KROMATOG

RAFI
 Literatur
Shriner, et.al, 2004, The Systematic
Identification of Organic Compounds, edisi
8th,John Willeys & sons, Singapore
Sarker, S.D., et.al., 2006, Natural
Product
Isolation, Humana Press, New Jersey
Gritter, R.J, et.al, 1991, Pengantar
Kromatografi, Penerbit ITB,
Bandung
Applied Thin-Layer
 Pengertian …

Stahl :
Kromatografi adalah metode fisiko-kimia
untuk memisahkan komponen
berdasarkan waktu tambat setiap
komponen diantara fase diam (FD) dan
fase gerak (FG)

Komponen A merambat lebih cepat

daripada komponen B karena waktu
tambat A lebih
kecil dibandingkan waktu tambat komponen B
 Pengertian …

Martin :
Kromatografi adalah metode fisikokimia
untuk memisahkan komponen
berdasarkan perbedaan pergerakan setiap
komponen di
antara fase diam dan fase gerak

Komponen A merambat lebih cepat dari

komponen B
karena komponen A bergerak lebih cepat
daripada
B
Pengertian

Kromatografi adalah pemisahan

komponen dalam larutan melalui
distribusi komponen secara selektif
di antara fase gerak (FG) dan fase
diam (FD).
 Pemakaian kromatografi

Tujuan Kualitatif
◦ Mendeteksi keberadaan senyawa dlm sampel
◦ Menggambarkan kerumitan suatu campuran
◦ Dapat digunakan u/menetapakn pola sidik jari
suatu campuran
◦ Co/ KKt, KLT, KG, KCKT
 Tujuan
Kuantitatif
◦ Menunjukkan banyaknya masing2
komponen
◦ Digunakan u/menetapkan kadar cuplikan
◦ Co/ KG dan KCKT

Tujuan Preparatif
◦ Digunakan untuk memperoleh komponen
dalam jumlah memadai (mg – g) dalam
keadaan murni
 Pengelompokkan
A. Berdasarkan FG B. Berdasarkan FD

a) Kromatografi a) Kromatografi Cair-

Cair cair
 KLT  KKt
 KK b) Kromatografi
 KKt Cair-
 KCKT Padat
 KLT
 KK
b) Kromatografi Gas
 KCKT
 GLC - GSC
 Pengelompokkan….
.
C. Berdasarka D. Berdasarkan
n Wadah
Mekanisme FD

a) Krom. a) Krom. Cair Planar

Partisi - KKt
- KKt - KLT

b) Krom.Adso b) Krom. Cair Kolom

rpsi - KGC
- KLT -
- KK - KCKT
KGC
1.Kromatografi lapis
tipis

2.Kromatografi kertas
1. Kromatografi lapis
tipis
Mekanisme
◦ Terjadi adsorpsi solut pada
adsorben/FD
 Terjadi kompetisi antara FG dan solut
untuk teradsorpsi pada adsorben/FD

◦ Solut terdesorpsi dari FD

◦ Solut terelusi oleh FG/sistem
cairan
pengembang (eluen)
 Jenis lapis tipis

Plat Adsorben
penyangga ◦ Silika gel
◦ Kaca ◦ Alumina
◦ Alumunium ◦ Kiselguhr
◦ Plastik ◦ Selulosa
 Silika GEL (Si OH)

BersifatPolar Silika Gel GF 254

Silika Gel G ◦ Mengandung pengikat
◦ Mengandung senyawa (gypsum) dan
pengikat (Gypsum = indikator fluoresensi
CaSO 4 5- anorganik yang
15%) dpt berfluoresensi
pada λ 254 nm
Silika Gel S
◦ Mengandung
pengikat (starch)
 Silika gel Silika gel PF 254+365
H/silika ◦ Digunakan pada
gel◦ Tanpa
N senyawa pemisahan preparatif
pengikat dan mengandung
indikator fluoresensi
Silika gel F 254

◦ Mengandung indikator
fluoresensi
Alumina
Bersifat kurang polar dibandingkan silika
gel
Bisa bersifat basa, netral dan asam
Jenis: alumina G, F, H
Kiselguhr Selulosa
 Mgd SIO2 > Mekanisme = KKt
89%,
Al2CO3, Fe2O3,TiO2, Serat < KKt
CaO, MgO, Na2O, Bercak < KKt
dll Waktu elusi
Adsorben lain < selulosa<
KKt
 Memiliki aktivitas
Tidak dapat
yang rendah
menggunakan
penampak bercak
H2 SO 4
Jenis adsorben / FD
Plat pra-lapis (Merck)
Serbuk silika gel
◦ Plat dibuat dgn alat Stahl-Desaga
◦ Dilakukan pada suhu kamar
◦ Plat diaktifkan pada suhu 110oC,
selama 1 jam
Sistem Elusi / FG
Pelarut tunggal
Campuran
pelarut
Tgt kepolaran
senyawa
Hanya digunakan
untuk 1x
pengembangan /
elusi

Tjd perubahan
komposisi
Penampak Bercak
A. Pereaksi Semprot
 Universal :
 H 2 SO 4 dgn konsentrasi 5-10% dalam
metanol
 Uap I2
 Ce2 SO4

 Spesifik
 Dragendorff : u/alkaloid
 AlCl3 : u/flavonoid
 FeCl3 : u/ fenol
 Penampak bercak …

B. Lampu U V  Plat tanpa

 Plat dg indikator fluoresensi indikator
fluoresensi
◦ Solut dg ikatan rangkap
terkonjugasi
menghslkan:
Background
berfluoresensi
Beberapa solut
Bercak gelap dapat berfluoresensi
◦ Solut tanpa ikatan pada λ 254 & 366
nm
rangkap
terkonjugasi menghslkan
:
Background
berfluoresensi
Arah Pengembangan/Elusi pada KLT

Menaik

Radial /
Sirkular
 Jenis Pengembangan/Elusi
Pengembangan Pengembangan
Tunggal Berganda
◦ Sistem pengembang: ◦ U/memperbai
sama ataupun ki pemisahan
berbeda ◦ Nilai Rf terlalu
rendah
◦ Setelah plat dielusi 1x,
dikeluarkan dari
bejana, keringkan,
elusi u/ke 2x
◦ Sistem pengembang :
sama
Kepolaran pengembang
meningkat
 Jenis Pengembangan/Elusi…

Pengembangan dua dimensi

◦ Sistem pengembang ke-1 bbd dari yang ke-2
◦ Arah pengembangan ke-2 berbeda 90o dari
arah pengembangan ke-1
◦ Untuk menguji kemurnian isolat

2
 W A R N I N G !!

Untuk mengidentifikasi senyawa

jangan
membandingkan harga Rf hasil
penelitian
dengan Rf pada literatur
Faktor yg Mempengaruhi Nilai Rf
 Kejenuhan chamber  Jarak bercak dari sisi
 Adsorben plat
 Suhu  Jmlh plat dlm

 Kelembaban chamber
 Pengukuran bercak
 Plat berupa pra-lapis
atau tidak  Sistem pengembang

 Ketebalan lapisan  Kemurnian pelarut pd

 Metode sistem pengembang

u/mengaktivasi  Konsentrasi sampel
plat (jmlh besar :
tailing)
Penggunaan KLT
 Analisis  Preparatif
◦ Kualitatif ◦ Mendapatkan isolat
Pemantau murni
an
komponen
◦ Kuantitatif
menentukan
jumlah
/kadar komponen
KLT-Preparatif
 Menggunakan plat pra-
lapis untuk preparatif
atau plat yang dibuat
dgn alat Stahl-Desaga
 Ketebalan optimum :
1
– 1,5 mm
 Sampel ditotolkan
sebesar 1-5 mm
dalam bentuk pita
 Hasil pemisahan: bbtk
pita
 KLT-Preparatif…

Penampak Pita yg mgd

bercak senyawa
◦ Lampu UV kmdn dikerok
◦ Pereaksi semprot Ekstraksi dengan
pelarut

Di bagian
pinggir Didapatka
plat n
isolat
2. Kromatografi
Kertas
Mekanisme:
Partisi solut di antara FD dan FG

Fase Diam:
Berupa lapisan cairan tipis pada
penyangga

Penyangga:
selulosa (kertas whatman)
Fase gerak
 B A W (4 : 1 : 5)

Air

Forestal
(HCl : asam asetat : air =
3:10:30)

Asam Asetat 2 – 50%

Penampak bercak
Pereaksi semprot spesifik atau lampu
UV
Tidak dapat menggunakan pereaksi
semprot H 2 SO 4

Arah Pengembangan
Pengembangan menaik (ascending
devlpm)
Pengembangan menurun (descending
 KKt KKt Preparatif
Kualitatif
 Menggunakan kertas  Menggunakan kertas
Whatman no. 1 Whatman no. 3
 Ketebalan kertas: 0,  Ketebalan kertas
16 0,31
mm mm
 U/pemisahan senyawa  Sampel ditotolkan
polar dalam bentuk pita
(flavonoid, karbohidrat,  Hasil pemisahan:
bbtk
asam amino) pita
 Penjenuhan chamber:  Pita yg mgd senyawa
24 jam digunting
 Waktu pengembangan :  Diekstraksi dengan
30’ – 12 jam pelarut
 KLT vs KKt
Pemisahan pada KLT KLT : bisa
lebih baik dari KKt menggunakan
Waktu elusi KLT < penyemprot bercak
KKt yg sifatnya korosif
Difusi pd KLT < KLT dapat
KKt digunakan sbg
KLT : sistem orientasi sistem
pengembang lebih pengembang pada
variatif Krom Kolom
Kapasitas KLT >
KKt
 1.Kromatografi kolom klasik
2.Kromatografi cair vakum
3.Kromatografi cair tekanan
menengah
4.Kromatografi cair tekanan tinggi
Contoh Kromatogram HPLC
1. Kromatografi Kolom Klasik
 Proses/mekanisme:
Adsorpsi, desorpsi, elusi (=
KLT), dan gravitasi
 Pemilihan eluen :
Adsorbent
◦ Silika gel ◦ Berdasarkan
◦ Alumina literatur
◦ Selulosa ◦ Data hsl
◦ Poliamida pemantauan KLT
Ukuran partikel
◦ KK : 63 – 250
μm
◦ KLT : < 63 μm
Menggunakan data pemantauan
KLT
 Pilih eluen untuk KLT (2
sistem pengembang:
lebih polar & kurang
polar)
 Pilih eluen yg
menghasilkan
Rf 0,2 – 0,3 pada KLT
 Pilih eluen yg bersifat
kurang polar untuk
digunakan dalam KK
Metode Penyiapan Krom Kolom
Metode kering Metode basah
◦ Adsorbent Masukkan sebagian
dimasukkan ke dalam eluen ke dalam
kolom
kolom
◦ Baru kmdn eluen
Tambahkan lumpuran
dimasukkan ke dalam
kolom adsorben ke dalam
kolom
Penyiapan Kolom
 Ketinggian
Kolom
 Pemisahan Normal:
10 – 100 x Ø dlm kolom

 Pemisahan Sulit :
> 100 x Ø dlm kolom
Penyiapan Sampel
 Sampel dilarutkan dalam eluen

 Sampel dilarutkan dalam pelarut

yang kurang polar dibdgkan eluen

 Dibuat serbuk sampel+adsorbent

Jumlah sampel
 Pemisahan Kasar
sampel : adsorben = 1: 10

 Pemisahan Normal
sampel : adsorben = 1: 30

 Pemisahan Sulit
sampel : adsorben = 1: 100 - 300
Metode Elusi
Elusi isokratik Pengumpulan fraksi
◦ Menggunakan 1 ◦ Warna
pelarut ◦ Volume
Elusi ◦ Waktu
gradien Pemantauan
◦ Menggunakan Komponen
bermacam eluen dgn ◦ KLT/KKt
kepolaran
meningkat fraksi yg mgd senyawa
yg sama digabungkan
2. Kromatografi Cair Vakum

Proses/mekanisme:
Adsorpsi, desorpsi,
elusi dan
perbedaan ?
tekanan

Contoh komposisi
Adsorbent
KK : 63 – 250 μm eluen:
N-hex – EtOac – MeOH
KCV :40 – 63 μm 9 : 1 25 mL
8 : 2 25 mL
 Dst
Eluen 1 : 9 25 mL
menggunakan
eluen dgn 10 : 25 mL
kepolaran yang 0
meningkat 9 : 25 mL
1
dst
0 : 25 mL
Penyiapan Adsorben + Sampel
Masukkan adsorben Pengumpulan fraksi
ke dalam kolom ◦ Setiap fraksi
Ketinggian adsorben dikumpulkan
± 5-6 cm (setelah
divakum) Pemantauan :
Sampel dibuat serbuk ◦ KLT/KKt
bersama dgn fraksi yg mgd
adsorben senyawa yg sama
digabungkan
Alhamdulilla
h