HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Dwi Susiloningrum
 Chromatography
(Kromatografi)

Bahasa Yunani

“Chroma” “Graphein”
(Warna) (menulis)
 Percobaan M.S. Tswett

Pemisahan pigmen tumbuh-

tumbuhan

Tabung gelas  kolom

Serbuk CaCO3  Packing
MIKHAIL SEMENOVICH TSWETT Ekstrak daun  sampel
(1872 – 1919) Petroleum eter  fase gerak
 KROMATOGRAFI

 Termasuk salah satu teknik pemisahan komponen campuran

zat
 Untuk analisis kualitatif, kuantitatif dan preparatif

 Analit terdistribusi dalam fase gerak (mobile phase) dan

fase diam (stationary phase)
FASE GERAK
 FASE DIAM
 Berupa padatan atau cairan
 Fase diam
 dapat berupa kertas  disebut Kromatografi Kertas (Paper
Chromatography)
 dapat ditebarkan pada lempeng (plate)disebut kromatografi lapis tipis
(Thin Layer Chromatography =TLC)
 dapat diisikan/dilapiskan pada kolom  Contoh: HPLC, GC,
Kromatografi kolom)
KLASIFIKASI BERDASARKAN MEKANISME

Kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)

Kromatografi Partisi
(partition chromatography)

Kromatografi Pertukaran ion

(ion exchange Chromatography)

Size Exclusion Chromatography (SEC)

Kromatografi Permeasi Gel; Kromatografi Filtrasi Gel
 CHROM AT OGRAP HY

GAS SFC L IQ U ID

GSC GLC C o lu m n P la n a r

NP RP IE C SEC T LC Paper

GPC GFC
GSC: Gas Solid Chromatography; GLC: Gas Liquid Chromatography
SFC: Supercritical Fluid Chromatography; NP: Normal Phase; RP: Reversed
Phase; IEC: Ion-Exchange; SEC: Size Exclusion Chromatography, GPC: Gel
Permeation Chromatography, GFC: Gel Filtration Chromatography
 The most frequently used technique
HPLC

High Performance
HP High Pressure

L Liquid
Cairan sebagai Fase gerak

Chromatography
C  Teknik Pemisahan
HPLC = KCKT
 Dikembangkan pada awal 1970-an
 Dewasa ini merupakan teknik paling banyak digunakan untuk
pemisahan dan analisis dari berbagai bidang seperti farmasi,
bioteknologi, lingkungan, polimer dan makanan.
 Merupakan “method of choice for the analysis of a wide variety
compounds”
APLIKASI HPLC BIDANG FARMASI

Analisis
Analisis Kualitatif
Kualitatif
Manfaat
Manfaat
Analisis
HPLC
HPLC
Analisis Kuantitatif
Kuantitatif
di
di bidang
bidang
Farmasi
Farmasi
Preparatif
Preparatif
PENGGUNAAN HPLC

Senyawa Organik, dan Anorganik

Bahan Aktif, Bahan Tambahan

dan Cemaran

Molekul sederhana dan

makromolekul (netral, ionik, zwitter ion)

Pemisahan Isomer (enantiomer)

12
BERDASARKAN SIFAT KIMIA PEMISAHAN
SEC Size
NP
Exclusion
Normal (GPC, GFC)
Phase

IE

Reversed Ion
HILIC Phase Exchange

RP

Dilakukan dengan instrumen HPLC yang sama,

tergantung dari kolom yang digunakan
 HPLC FASE TERBALIK
 RP-HPLC: fase gerak polar, fase
diam non polar
 Pemisahan didasarkan atas koefisien
partisi analit dalam fase diam dan
fase gerak
 Urutan elusi: analit polar terelusi
lebih dahulu, analit non plar terelusi
terakhir
 Untuk analit berupa ion dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan dapar dan teknik
pasangan ion (ion-pair).
REVERSED-PHASE MOBILE PHASES
 Water
 Methanol

 Acetonitrile

 THF

 Additives, salts, acids, bases

 ION EXCHANGE HPLC
 Pemisahan didasarkan atas
pertukaran ion analit dengan ion
dari gugus fungsi bahan
pendukung padat fase diam
 Contoh Fase diam: senyawa
sulfonate (penukar kation);
ammonium kuarterner (penukar
anion)
 Fase gerak: dapar
 Aplikasi: analisis ion, asam-asam
amino, protein/peptida,
polinukleotida
 SIZE EXCLUSION HPLC
 Untuk pemisahan
makromolekul (BM > 10000).
 Disebut GFC jika digunakan
untuk pemisahan molekul
biologis yang larut air
 Disebut GPC jika digunakan
untuk penentuan Bobot
molekul suatu polimer organik.
Fase gerak umumnya toluen
dan tetrahidrofuran.
 HPLC: Berdasarkan komposisi fase gerak

Isokaratik (Isocratic elution):

 Komposisi fase gerak tetap

Gradien (Gradient elution):

 Komposisi fase gerak berubah

Elusi gradien
% Solven B

Elusi Isokratik

Waktu (menit)
 GRADIENT ANALYSIS
Advantages:
 Better suited for complex samples
 Better resolution of early and late eluting peaks
 Better sensitivity of late eluting peaks
 Higher peak capacity (fit more peaks in the chromatogram)

Disadvantages
 More complex HPLC instrument
 Method development, implementation and transfer are more
difficult
 Typically longer analysis times since column must be calibrated
with initial mobile phase
PEMISAHAN KROMATOGRAFI CAIR
CHROMATOGRAM
tR-B
Respon Detektor 

tR-A
Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width

Area =
width x height
2
Chromatographic retention times are characteristics of the compounds
they represent but are not unique
 CHROMATOGRAM AND ITS USES

Used to evaluate separation efficiency and column

performance :
 Mobile Phase Retention Time (to)
Analyt Absolute Retention Time, and
Relative Retention Time (tr)
 Capacity factor (k’)
 Selectivity ()
 The number of theoretical plates (N)
 Height equivalent to theoretical plate (HETP)
 Resolution (Rs) / Trennzahl TZ
 KROMATOGRAM Data :
 Kromatogram  tR: waktu retensi (retention time)
 (parameter kualitatif)

tR-1  Luas puncak = Peak area

Respon Detektor

 parameter kuantitatif
tR-2
 Tinggi puncak (Peak height)
parameter kuantitatif

waktu
 Width = lebar puncak

Retention volume (VR)

VR = tR × F Relative Retention Time (RRT) = tR2/tR1
RETENTION OF UNRETAINED COMPOUND

 tM = to adalah waktu retensi zat yang tak tertahan

oleh fase diam
 VM = dead volume

  tM = Hold-Up time = dead time

 tR’ = tR – tM = adjusted retention time

LEBAR PUNCAK (W)
 Lebar garis dasar (baseline) = Wb
 Lebar tengah puncak (W0.5)
TAILING, FRONTING & SYMMETRY PEAK

a b
 TAILING FACTOR (USP)

Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)

 Dihitung pada posisi 5% dari tinggi maksimum puncak

Tf = 1.0  Puncak simetri

Tf < 1.0  fronting
Tf > 2.0  tailing
RETENTION FACTOR = CAPACITY FACTOR (K’)

tR  tM
k 'A 
tM

Menggambarkan kecepatan elusi analit pada kolom

Jika k’A < 1 elusi terlalu cepat.
Jika k’A > 10  elusi terlalu lambat
k’A sebaiknya antara 1.5 dan 4
 SELECTIVITY, 

Selectivity is an indication
V0
V1 of the degree of separation
V2 between two peaks.

k' 2 V2  V0
Selectivity  = 
k'1 V1  V0
 FAKTOR SELEKTIVITAS
 Faktorselektivitas= Selectivity Factor () = k’B /k’A
 Merupakan ukuran atau selektivitas pemisahan dua
komponen
 Harga  > 1 berarti dua puncak terpisah

 Dipengaruhi komposisi fase gerak, jenis fase diam,

temperatur, pH fase gerak

k ' B (t R ) B  t M
 
k ' A (t R ) A  t M
 RESOLUSI (RS)

Pada integrasi secara elektronik:

2[(t R ) B  (t R ) A ]
RS  1.18[(t R ) B  (t R ) A ]
WA  WB RS 
W0.5( A)  W0.5( B )
EFISIENSI KROMATOGRAFI

 Suatu kolom/lapis fase diam dapat dipandang terdiri atas

sejumlah lempeng (theoritical plate), yang pada setiap satu
lempeng terjadi kesetimbangan sempurna antara linarut yang
berada pada fase diam dan fase gerak
 Makin banyak lempeng teoritis makin efisien
 HETP (height equivalent to a theoritical plate), yaitu panjang
atau jarak atau tebal kolom/lapis yang diperlukan untuk bersifat
sebagai lempeng teoritis  makin tipis HETP makin besar
bilangan lempeng teoritis
 TINGGI PELAT DAN PELAT TEORETIS

 Pelat teoretis = Theoretical Plates (N)

 Tinggi pelat = Plate Height (H) = HETP (High equivalent to a
Theoretical Plate)
 Untuk menunjukkan efisiensi kolom
N = L/H
L = panjang kolom
MENGHITUNG N DARI KROMATOGRAM

2
 tR 
N  16  
W 
2
 t 
N  5.54 R 
 W0.5 

Pada integrasi secara elektronik:

EFISIENSI KOLOM

Krom kolom

K
L
T
N = 5.54 (tr /Wl/2)2

Makin lebar puncak kromatogram (relatif terhadap

waktu tambat) makin kecil efisiensi elusi kolom.

Efisiensi kolom biasanya dinyatakan dalam N = bilangan lempeng

teoritis per meter: n X lOO/L, dimana L = panjang kolom (cm). Neff >
30,000 ►
HETP =panjang kolom yang diperlukan untuk satu tahap partisi
 Peak A Peak B

Peak area A = Peak area B

WA WB

Peak B:
Peak A:
•Narrow band;
•Broad band; •Narrow peak;
•Broad peak;
•Greater peak height;
•Less sensitivity;
•Increased sensitivity
•Less resolution capacity
•More resolution capability
•Less Plates
•More Plates
HUBUNGAN RESOLUSI DENGAN N

1. Dipengaruhi ukuran partikel, Panjang kolom, kondisi

kolom
2. Faktor selektivitas  tergantung analit dan fase diam
3. Faktor kapasitas  kondisi pemisahan
MEMPERBAIKI RESOLUSI
 Optimasi kondisi pemisahan
 Pemilihan kolom (ukuran partikel, diameter internal,
jenis fase diam)
 komposisi fase gerak

 Temperatur
HUKUM VAN DEEMTER
 H = A + B/ + C. 

 A= suku difusi Eddy; B=suku difusi longitudinal; C= suku

perpindahan massa; =kecepatan fase gerak
HUKUM VAN DEEMTER
 Eddy Diffusion

A = 2  dp

•disebut difusi Eddy

• tergantung pada distribusi
ukuran partikel
•Jika ukuran partikel packing seragam
  kecil
•dp = diameter partikel packing
 Longitudinal Diffusion (B)

B/u = 2DM/u

•  = konstan tergantung mutu packing

• DM = koefisien difusi fase gerak

• Berbanding terbalik dengan laju alir fase gerak
 Mass Transfer (Cs + Cm)

H = A + B/u + (Cs + Cm)u

CS = fS(k’)df2 / DS

CM = fM(k’)dp2 / DM

• DM = koefisien difusi fase gerak

• DS = koefisien difusi fase diam
• df = film thickness
• dp = diameter partikel
• Berbanding lurus dengan laju alir fase gerak
SYSTEM SUITABILITY TESTS

Parameter SST
 Capacity Factor ( k' )
 Precision/Injection Repeatability (RSD)
 Relative Retention (α)
 Resolution ( Rs )
 Tailing Factor ( T )
 Theoretical Plate Number ( N )

45
SYSTEM SUITABILITY
PARAMETERS
Capacity Factors ( k' )
 k' = ( ｔＲ－ｔ０ ) / ｔ０
 k' ＞２
 Precision/Injection Repeatability ( RSD )
 ｎ≧５
 RSD≦ １％
 Relative Retention (α )
 α = k'1 / k'2
 Resolution ( Rs )

 Tailing Factor ( T )
 T = Ｗ x / ２ｆ
 T≦ ２
 Theoretical Plate Number ( N )
 N = １６ ( ｔＲ / ｔＷ )2 = Ｌ / Ｈ N ＞２０００

46