TEKNIK PEWARNAAN

Pendahuluan
► Pengamatan mikroorganisme sulit:
 Berukuran kecil
 Transparan/tidak berwarna ketika disuspensikan
dalam media cair
► Perlu
dikembangkan teknik pewarnaan untuk
memudahkan dalam:
 Pengamatan morfologi mikroorganisme
 Pengidentifikasian bagain-bagian struktural sel
mikroorganisme
 Faktor Penentu Keberhasilan Dalam
Teknik Pewarnaan
1. Penempatan olesan, atau lapisan tipis
spesimen pada kaca objek
2. Fiksasi olesan pada kaca objek, biasanya
dengan pemanasan, menyebabkan
mikroorganisme melekat pada kaca objek
3. Aplikasi pewarna yang digunakan
(pewarnaan sederhana atau differensial)
 Prinsip Dasar Pewarnaan
► Secara kimiawi zat pewarna (stain/dye) yang digunakan
dalam pewarnaan berupa senyawa organik yang
mengandung kromogen+Auksokrom
► Kromogen:
 senyawa berwarna yang terbentuk atas benzen (senyawa
organik yang tidak berwarna)+ kromofor (senyawa yang
mampu membentuk warna jika bereaksi dengan benzen)
► Auksokrom
 Senyawa kimia yang dapat mengubah ionisasi dari kromogen
 Menjadikan kromogen membentuk garam dan dapat
berikatan dengan serat atau jaringan
 Prinsip Dasar Pewarnaan

► Kemampuan zat pewarna (stain) dalam

berikatan dengan komponen selular
makromolekul seperti protein atau asam
nukleat sangat bergantung pada
muatan listrik kromogen serta
komponen selular yang akan diwarnai.
► Dikenal ada dua jenis zat pewarna:
1. Pewarna asam (acidic stains)
2. Pewarna basa (basic stains)
 Pewarna Asam (acidic stains)
► Bersifat anionik
► Ionisasi stain membentuk kromogen
bermuatan negatif
► Memiliki afinitas yang kuat terhadap struktur
sel yang bermuatan positif, seperti protein
► Tidak terikat pada sel bakteri hanya
mewarnai latar blakang.
► Contoh Picric acid, eosin dan fuchsin acid
 Pewarna basa (basic stains)
► Bersifat kationik
► Ionisasi stain membentuk kromogen
bermuatan positif
► Memiliki afinitas yang kuat terhadap struktur
sel yang bermuatan negatif, seperti asam
nukleat
► Contoh methylene blue
Macam-macam teknik pewarnaan
► Pewarnaan sederhana (simple staining)
► Pewarnaan differensial (differential
staining):
 Pewarnaan gram
 Pewarnaan tahan asam
► Pewarnaan khusus
 Pewarnaan kapsul
 Pewarnaan spora
 Pewarnaan flagela
 Pewarnaan Sederhana
(simple staining)
► Pewarnaan yang hanya menggunakan zat
pewarna tunggal
► Menggunakan zat pewarna basa (mengandung
kromogen kationik)
► Digunakan untuk mewarnai asam nukleat dan
komponen dinding sel bakteri (bermuatan negatif)
► Bertujuan untuk mengamati morfologi dan
penataan sel bakteri
► Zat pewarna yang digunakan: methylene blue,
crystal violet, dan carbol fuchsin
 Pewarnaan differensial
(differential staining)
► Pewarnaan yang menggunakan lebih dari
satu zat pewarna
► Pewarna terbagi menjadi dua macam:
pewarna utama (primary dye) dan pewarna
tandingan (counterstain)
► Digunakan untuk menampilkan perbedaan
di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian
sel mikroba
 Pewarnaan Gram
► Dikembangkan pertama kali oleh Hans Christian
Gram pada tahun 1884
► Pewarna yang digunakan:
 Ungu kristal (pewarna utama), iodium gram (mordan),
alkohol 95 % (pemucat), safranin (pewarna tandingan)
► Intepretasi hasil:
 Gram positif: mampu menahan pewarna utama
meskipun telah dipucatkan dengan alkohol, serta
pemberian warna tandingan.
► Organisme berwarna ungu-hitam (warna kristal violet)
 Gram negatif: tidak mampu menahan pewarna utama,
serta mampu terwarnai dengan pewarna tandingan
setelah pemucatan.
► Organisme berwarna merah (warna safranin)
Pewarnaan Gram
 Pewarnaan Gram
► Determinasi gram + dan – disebabkan
adanya perbedaan struktur dan komposisi
dinding sel pada masing-masing kelompok.
 Gram – mengandung lipid, lemak dalam
prosentase yang lebih besar dibandingkan
dengan gram +.
 Dinding sel bakteri gram – juga lebih tipis
dibandingkan dengan bakteri gram +.
 Etanol mampu mengekstraksi pewarna utama
pada bakteri gram –
Pewarnaan
Gram
 Pewarnaan Tahan Asam
(Acid Fast Stain)
► Beberapa spesies tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan biasa, contohnya genus
Mycobacterium
► Hal ini disebabkan komposisi dinding sel yang
mengandung lipid yang tebal sehingga
menyulitkan pewarna biasa untuk dapat
melakukan penetrasi pewarnaan.
► Pewarna yang digunakan:
 Karbol fuchsin (pewarna utama), metilen biru (pewarna
tandingan), alkohol asam (3 % HCl + 95 % etanol)
sebagai pemucat.
► Proses pewarnaan dilakukan dengan pemanasan
atau tanpa pemanasan (penambahan
turgitol/wetting agent)
 Pewarnaan Tahan Asam
► Intepretasi hasil:
 Bakteri tahan asam: mampu menahan pewarna
utama meskipun telah dilakukan pemucatan
terhadap asam alkohol
►Bakteri berwarna merah keunguan
 Bakteri tak tahan asam: mampu dipucatkan
oleh alkohol asam, dan menerima pewarna
tandingan.
►Bakteri berwarna biru
Pewarnaan tahan asam
 (Pewarnaan Khusus)
Pewarnaan Kapsul
► Kapsul merupakan bagian dari struktur sel bakteri
yang berupa lapisan luar yang bergelatin
► Kapsul mengandung polisakarida, glikoprotein dan
polipeptida.
► Tidak semua bakteri memililki kapsul
► Umumnya keberadaan kapsul mengindikasikan
virulensi
► Pewarna yang digunakan:
 Kristal violet 1 % (pewarna utama); tembaga sulfat 20
% (pemucat dan pewarna tandingan)
► Tidak ada perlakuan pemanasan
Pewarnaan Kapsul
 Pewarnaan Spora
► Endospora: Bentuk dormansi bakteri
► Struktur yang resisten:
 Panas, radiasi, dingin, asam, desinfektan kimiawi
 Perebusan > 1 jam tetap viabel
► Membutuhkan energi dan waktu untuk membentuk spora
► Pewarnaan spora: menentukan lokasi yang menjadi dasar
klasifikasi  sentral, subterminal,terminal
► Struktur:
 Spore coat
 Cortex
 Core (Spore protoplast)
Pewarnaan Spora lanjutan
► Komponen penyusun inti endospora
 Air dalam konsentrasi yang rendah
 Small acid-soluble spore proteins (SASPs):
► Melindungi DNA dari radiasi UV, pengeringan & pemanasan
► Sumber karbon & energi untuk pembentukan sel vegetatif baru
(germinasi)
Pewarnaan Spora lanjutan
► Pewarna yang digunakan:
 Hijau malakit (pewarna utama), Safranin
(pewarna tandingan), air (pemucat)
► Perlu pemanasan ketika pemberian warna
► Intepretasihasil:
 Spora akan berwarna hijau (hijau malakit),
sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah
(safranin)
Pewarnaan Spora lanjutan
 Pewarnaan Flagel
► Digunakan untuk mewarnai flagel sehingga dapat
diamati keberadaan, jumlah, dan penataan flagel
pada bakteri.
► Penataan flagel akan membantu dalam identifikasi
bakteri.
► Untuk mewarnai flagel dibutuhkan teknik
pewarnaan yang khusus.
► Diperlukan bahan tertentu yang dapat melapisi
flagel bakteri, sehingga dapat menambah
ketebalan flagel.
► Pewarna selanjutnya akan mewarnai bahan
pelindung tersebut.
Pewarnaan flagel
 Pewarnaan Negatif
► Digunakan untuk mengamati morfologi dan
penataan bakteri
► Pewarna yang digunakan berupa pewarna asam
seperti tinta india atau nigrosin.
► Pewarna asam tidak akan mewarnai sel, karena
permukaan sel bakteri yang bermuatan negatif
► Bakteri tidak berwarna, sedangkan latar
belakangnya akan berwarna gelap
► Contoh : Pewarnaan kapsul
Pewarnaan Negatif
SEMOGA BERMANFAAT