Presentator : dr.

Indah Triana Sari Pohan

Mona nurdin amindt
Narasumber: Dr. R. Lia Kusumawati, M.Biomed., SpMK(K), PhD

KULTUR DAN
IDENTIFIKASI
M. TUBERCULOSIS
 Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Pewarnaan (pengecatan) Ziehl-Neelsen (ZN), dikenali

sebagai pewarna bakteri tahan asam atau sering disebut
pengecatan BTA. Dalam cat ini mengandung zat warna
karbol-fuchsin yang merupakan asam.
Pengecatan ini pertama sekali dicetuskan oleh dua orang
doktor Jerman, Franz Ziehl (1859-1926), seorang pakar
bakteria dan Friedrich Neelsen (1854-1894), ahli
patologi. Pengecatan ZN merupakan pewarna bakteri
khas yang digunakan untuk organisme/bakteri tahan
asam, terutamanya Mycobacteria.
 Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Komposisi cat Ziehl-Neelsen (ZN)

1. ZN A: cat primer, berisi Carbol fuchsin 1%, cat merah gelap dalam
5% phenol yang larut dalam bahan lipid seperti yang dimiliki oleh
dinding sel Mycobacterium sp. Penetrasi cat ini akan dipermudah
dengan adanya pemanasan yang membantu carbol fuchsin
menembus dinding lipid menuju sitoplasma.
2. ZN B: decolorizing agent, berisi asam alkohol (3% HCl dan 95%
Ethanol). Sifat larutan ini mampu mengeraskan dinding sel yang
tersusun dari lipid. Dekolorisasi menggunakan asam alkohol tidak
dapat melunturkan cat primer (ZN A)
3. ZN C: counterstain, berisi Methylene blue 0,1%.
PEWARNAAN BTA
 PEWARNAAN BTA

• Pemeriksaan mikroskopis juga dilakukan sebagai

bagian dari pemeriksaan biakan follow up selama masa
pengobatan yang dilakukan sesuai jadwal.
• Hasil pemeriksaan mikroskopis berupa hasil positif
dengan gradasi scanty, +, ++, +++
• Hasil negatif.
• Contoh uji dahak dapat berasal dari dahak sewaktu-
sewaktu atau sewaktu-Pagi.
 KULTUR KONVENSIONAL

Pemeriksaan laboratorium untuk uji kepekaan M.Tuberculosis

dilakukan dengan metode standar yang tersedia di Indonesia yaitu
metode fenotipik dan metode genotipik.
a. Metode fenotipik
 Menggunakan media padat (Lowenstein Jensen / LJ) atau media
cair (mycobacteria growth indicator tube / MGIT). Program
Penanggulangan TB hanya dilakukan menggunakan media cair
(MGIT).
 Pemeriksaan ini harus dilakukan oleh laboratorium yang sudah
tersertifikasi oleh laboratorium rujukan nasional TB.
 Biakan media cair BACTEC MGIT 960® dapat dilakukan secara
manual ataupun otomatis dengan BACTEC MGIT 960®
KULTUR KONVENSIONAL
b.Tes genotipik
1)Menggunakan Xpert MTB/RIF atau lebih dikenal
dengan tes cepat molekuler (TCM)
a)Pemeriksaan TCM dengan alat Xpert MTB/RIF
merupakan tes amplifikasi asam nukleat secara
otomatis untuk deteksi bakteri M. Tuberculosis
complex dan gen resistansi terhadap rifampisin (rpoB).
b)Hasil pemeriksaan dapat diketahui dalam waktu
kurang lebih 2 jam.
Media Padat Lowenstein–Jensen (LJ)

Lowenstein–Jensen, lebih dikenal sebagai

medium LJ, adalah medium pertumbuhan yang
khusus digunakan untuk kultur spesies
Mycobacterium, terutama Mycobacterium
Tuberculosis. Ketika ditumbuhkan pada media LJ,
M. Tuberculosis muncul sebagai koloni granular
berwarna coklat.
Media Padat Lowenstein–Jensen (LJ)

• Prinsip media Lowenstein Jensen Lowenstein-Jensen

menggunakan malasit green untuk menghambat bakteri
lain kemudian memodifikasi dengan citrate dan phosphate.
• Koloni yang tumbuh pada media Lowenstein Jensen
adalah Bakteri tahan asam saprofit dapat tumbuh dengan
baik bila ditanam pada medium yang sederhana pada suhu
kamar. Sebaliknya, bakteri tahan asam yang patogen tidak
dapat tumbuh pada media yang sederhana, tetapi hanya
dapat tumbuh secara lambat pada media yang mengandung
inspissated serum, telur, dan tepung kentang. Bakteri M.
Tuberculosis tumbuh baik pada pH optimal 6,8.
Media Padat Lowenstein–Jensen (LJ)
Koloni M. Tuberculosis
berwarna krem, permukaannya
tidak rata atau berdungkul
dungkul seperti bunga kubis
kering. Koloni mikrobacteria
yang patogen akan berbau
seperti aroma buah. Pemberian
gliserol juga bisa merangsang
pertumbuhan M.tuberculosis
 Mycobacterium growth indicatortube
(MGIT)

Mycobacterium growth indicatortube adalah suatu medium

untuk isolasi mikobakterium, yang mengandung 4 ml
middlebrook 7H9 Broth Base.

Medium ini berisi :

 0,5 ml Oleic acid, Bovine Albumin, Dekstrose, Catalase,
(OADC) dan 0,1 ml campuran antibiotik Polymixin B,
Amphotericin B, Nalidixid Acid, Trimetoprim, Azlocillin
(PANTA)
 Waktu rerata untuk mendeteksi M. Tuberkulosis adalah 7
hari .
 Mycobacterium growth indicatortube
(MGIT)
MGIT mengandung : 110 uL indikator fluorosensi dan 4 mL broth.Indikatornya mengandung Tris 4,7 –diphenyl -1, 10-
phenathrolinne ruthenium chloride pentahydrate dalam basis karet silicon (silicon rubber base).Kandungan per L adalah :
 Modified Middlebrook 7H9 Broth base 5,9 g
 Casein peptone 1,25 g
 Gliserol 3,1 mL

BBL MGIT OADC berisi 15 ml medium untuk mikobakteria (middlebrook) OADC enrichment kandungan per L
adalah :
 Bovine Albumin 50,0 g
 Dekstose 20,0 g
 Catalase 0,03 g
 Oleic – acid 0,6 g

BBL MGIT PANTA berisi campuran Lypholized senyawa antibiotic. Per vial mengandung:
 Polymixin B 6.000 unit
 Amphotericin B 600 μg
 Nalidixid Acid 2.400 μg
 Trimetropim 600 μg
 Azlocilin 600 μg
Mycobacterium growth indicatortube
(MGIT)
BACTEC MGIT
KULTUR KONVENSIONAL
Saat ini program TB menggunakan paket standar uji
kepekaan yang menguji 5 (lima) obat berikut:
1)INH (dosis rendah dan dosis tinggi)
2)Ofloksasin / Levofloksasin
3)Kanamisin
4)Kapreomisin
5)Moksifloksasin (dosis rendah dan dosis tinggi)
 TCM
Prinsip Kerja
Pemeriksaan TCM dengan Xpert MTB/RIF merupakan
metode deteksi molekuler berbasis nested real-time PCR
untuk diagnosis TB. Primer PCR yang digunakan mampu
mengamplifikasi sekitar 81 bp daerah inti gen rpoB MTB
kompleks, sedangkan probe dirancang untuk membedakan
sekuen wild type dan mutasi pada daerah inti yang
berhubungan dengan resistansi terhadap rifampisin.Sistem
tersebut terdiri atas alat GeneXpert,komputer dan
perangkat lunak.
 TCM

Pemeriksaan Xpert MTB/RIF dapat mendeteksi MTB

kompleks dan resistansi terhadap rifampisin secara simultan dengan
mengamplifikasi sekuen spesifik gen rpoB dari MTB kompleks
menggunakan lima probe molecular beacons (probe A – E) untuk
mendeteksi mutasi pada daerah gen rpoB. Setiap molecular beacon
dilabel dengan dye florofor yang berbeda.

Cycle threshold (Ct) maksimal yang

valid untuk analisis hasil pada probe A, B dan C adalah 39 siklus,
sedangkan pada probe D dan E adalah 36 siklus.
Pemeriksaan Xpert
MTB/RIF sudah
diatur secara
otomatis sesuai
dengan
protokol kerja Xpert
MTB/RIF dan tidak
dapat dimodifikasi
oleh pengguna.
KULTUR KONVENSIONAL
2)Menggunakan line probe assay (LPA):
a)Dikenal sebagai Hain test/Genotype MTBDR plus (LPA lini
pertama) dan MTBDRsl (LPA lini kedua). LPA lini pertama dapat
mendeteksi resistansi terhadap obat rifampisin dan isoniazid.
Sedangkan LPA lini kedua untuk mendeteksi resistansi pada obat
golongan flurokuinolon dan obat injeksi lini kedua.
Saat ini program TB hanya menggunakan LPA lini kedua.
Hasil pemeriksaan dapat diperoleh dalam waktu kurang lebih 48
jam. Laboratorium LPA akan melakukan pemeriksaan LPA
sebanyak satu sampai dua kali dalam seminggu agar lebih efisien.
Sehingga turn around time (TAT) pemeriksaan LPA adalah 5 hari
kerja.
 PCR Mycobacterium Tuberculosis
PCR adalah suatu metode in vitro untuk amplifikasi sekuen DNA
target spesifik secara enzimatik dengan menggunakan sepasang
primer oligonukleotida spesifik yang terdapat pada dua daerah
(region) yang sekuennya telah diketahui.
Pada dasarnya reaksi PCR mengambil prinsip replikasi DNA, yaitu
pembukaan untai ganda, penempelan primer,dan perpanjangan
rantai DNA baru oleh DNA polimerase dari arah 5’ ke 3’. Hanya
saja pada metode
PCR, tidak digunakan enzim ligase dan primer RNA
 PCR Mycobacterium Tuberculosis

Komponen-komponen yang dibutuhkan dalam

reaksi PCR
 Enzim termostabil Tag
 DNA polimerase
 larutan dapar PCR (PCR buffer), dNTP, DNA
cetakan(template),oligonuleotidaprimer
 kofaktor seperti magnesium (Mg2+)
 REFRENSI

• https://fk.uii.ac.id/mikrobiologi/materi/pengecatan-ziehl-neelsen-
zn/
• Petunjuk Teknis Penatalaksanaan Tuberkulosis Resistan Obat
(2020). Kementerian Kesehatan RI, Jakarta
• Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor
Hk.01.07/Menkes/755/2019 Tentang Pedoman Nasional
Pelayanan Kedokteran Tata Laksana Tuberkulosis.(2019).
Kementerian Kesehatan RI, Jakarta
TERIMAKASIH