Kloning Gena

KLONING GEN
 Kloning

 Perbanyakan fragmen gen target dengan memberikan DNA rekombinan

dalam suatu sel
 Menciptakan MH tanpa melalui perkawinan
 Jenis kloning
1. Embrional
2. DNA Dewasa
3. Terapeutik
 DNA rekombinan

 DNA yang merupakan gabungan dari

DNA tuan rumah dan makhluk asing
sehingga menghasilkan kombinasi
baru.

 DNA kombinasi ini disebut DNA

rekombinan dan mengekspresikan
protein dari makhluk asing tersebut.
 Jenis-Jenis Kloning

Teknik yang dilakukan untuk memperoleh kembar

1 Kloning Embrional identik, meniru apa yang terjadi secara alamiah

Rekayasa genetis untuk memperoleh duplikat dari seorang

2 Kloning DNA Dewasa individu yang sudah dewasa.

Rekayasa genetis untuk memperoleh sel, jaringan atau organ dari

3 Kloning Terapeutik satu individu tertentu untuk tujuan pengobatan atau perbaikan
kesehatan
 Komponen
Digunakan sebagai gen yang akan
diperbanyak
Kloning Gen Berfungsi untuk menyimpan
DNA gen atau fragmen DNA
Sel
Sisipan yang sudah di klon
Inang

DNA
Vektor
Berfungsi sebagai wadah DNA
sisipan
Enzim

Ligase

Digunakan
Digunakan untuk memotong DNA Enzim untuk
menyambu
Restriksi
ng DNA
 Komponen
DNA Sisipan
Kloning Gen
Merupakan fragmen DNA (gen) yang akan di kloning
DNA sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :
1. Produk PCR.
2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim
restriksi

DNA vektor

Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang bertindak sebagai wadah untuk
membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan bertanggung jawab atas
replikasinya.
Syarat suatu vektor adalah :
(1)Dapat dipotong dengan enzim restriksi
(2)Mampu memasuki sel inang,
(3)Bereplikasi sendiri
(4)Menghasilkan jumlah copy yang banyak dan
(5)Mempunyai ukuran yang relatif kecil
 Komponen Kloning Gen
Plasmid

 Merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk

sirkular dan terdapat bebas di dalam sel.
 Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang
karena mempunyai suatu urutan DNA spesifik yang
disebut ori (origin of replication/ titik awal replikasi).

Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :

a. Berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda
(double stranded)
b. Dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti
c. Terdapat di luar kromosom
d. Secara genetik dapat ditransfer secara stabil
 Komponen Kloning Gen
Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNA dan
memotong pada urutan yang spesifik tersebut.

Enzim Restriksi yang sering digunakan pada proses rekombinan DNA

Enzyme Source Recognition Sequence Cut

EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 5’--G AATTC--3’

3’CTTAAG 3’--CTTAA G--5’
EcoRII Escherichia coli 5’CCWGG 5’-- CCWGG--3’
3’GGWCC 3’--GGWCC --5’
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’GGATCC 5’--G GATCC--3’
3’CCTAGG 3’--CCTAG G--5’
HindIII Haemophilus influenzae 5’AAGCTT 5’--A AGCTT--3’
3’TTCGAA 3’--TTCGA A--5’
TaqI Thermus aquaticus 5’TCGA 5’--T CGA--3’
3’AGCT 3’--AGC T--5’
 Komponen Kloning Gen
Enzim Ligase

Enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan fospodiester antara potongan
fragmen DNA atau RNA berujung kohesif yang saling berkomplemen hasil pemotongan dengan
enzim restriksi.
Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli, DNA ligase dari Fage T4,
ligase bakteri termofilik dan termostable DNA ligase.

Sel Inang

Organisme yang menampung virus, dll umumnya dengan

menyediakan makanan dan tempat berlindung.
 Tahap-tahap Kloning Gen

Isolasi DNA

Penyambungan dengan Pemotongan DNA dengan

Enzim Ligase Enzim Restriksi DNA

Transformasi Sel

Seleksi Klon Rekombinan

Isolasi DNA
 Tahap pertama dari berbagai teknologi analisi DNA
 Ekstraksi DNA dilakukan dengan penambahan buffer untuk

mencegah DNA rusak

 Untuk mebantu terjadinya ekstraksi maka dilakukan inkubasi pada

suhu 60 C.
 Pemisahan dari komponen lain menggunakan sentrifugasi
 Penyambungan DNA

Terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan dengan menggunakan

enzim DNA ligase dari bakteri, serta dengan pemberian enzim
deoksinukleotidil transferase untuk mensintesis untai tunggal
homopolimerik 3’.

Proses ini terjadi antara ujung fosfat dengan ujung hidroksil

 Transformasi
Transformasi sel merupakan proses untuk
Transformasi Sel memasukkan DNA ke dalam sel inang.

Transformasi dapat dilakukan dengan cara :

A. Alami : DNA yang berbentuk untai ganda dan punya urutan basa
spesifik
B. Buatan : Sel bakteri dipaksa menjadi sel kompeten agar DNA berikatan
dengan sel.
1. Heat Shock (Kejutan Panas), dimana campuran sel dan DNA plasmid
rekombinan didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskan
dengan segera pada suhu 42°C.
2. Lektroporasi (kejutan listrik) menggunakan suatu alat yang dialiri arus
listrik
 Seleksi

Seleksi Klon Rekombinan

Seleksi klon rekombinan ini bertujuan untuk menentukan koloni mana yang
membawa plasmid rekombinan.
Terdapat beberapa cara seleksi klon tekombinan, diantaranya :

1. X gal  untuk identifikasi plasmid rekombinan

2. Enzim restriksi  untuk seleksi plasmid rekombinan hasil kloning

 Aplikasi Kloning Gen

Pada Manusia

Pada Hewan

Pada tanaman

Etika tentang klonasi/ kloning dalam
adeddum Buku Kedokteran Indonesia
disebutkan bahwa menolak dilakukan
kloning terhadap manusia karena upaya
itu mencerminkan penurunan derajat
serta martabat manusia.
Yang sangat utama untuk diperhatikan adalah
seharusnya kloning hanya dilakukan untuk
kepentingan kesejahteraan kehidupan serta tidak
menyalahi etika dan moral.
Tinjauan Bioetika
Kloning
Sel atau jaringan dalam upaya
meningkatkan derajat kesehatan melalui
antara lain: pembuatan zat anti atau
antigen monoclonal yang banyak
digunakan dalam bidang kedokteran baik
aspek diagnostic maupun dalam
pengobatan.
KLONING
TERAPEUTIK
 Prinsip Dasar

 Beberapa penyakit terjadi karena kurangnya/tidak adanya

protein fungsional dalam tubuh

 DNA dalam sel makhluk hidup mampu mengekspresikan protein

fungsional

 Protein fungsional dari makhluk hidup lain bisa digunakan untuk

mengganti / sebagai obat.
 Contoh Penyakit diabetes

 Insulin  hormon polipeptida yang mengatur metabolisme karbohidrat.

 Insulin  "efektor" utama dalam homeostasis karbohidrat, hormon ini juga

ambil bagian dalam metabolisme lemak (trigliserida) . Hormon tersebut juga
mempengaruhi jaringan tubuh lainnya.

 Insulin digunakan dalam pengobatan diabetes mellitus.

 Pasien dengan diabetes mellitus tipe 1 bergantung pada
insulin eksogen (disuntikkan ke bawah kulit/subkutan) untuk
keselamatannya karena kekurangan absolut hormon tersebut;

 Pasien dengan diabetes mellitus tipe 2 memiliki tingkat

produksi insulin rendah atau kebal insulin, dan kadang kala
membutuhkan pengaturan insulin bila pengobatan lain tidak
cukup untuk mengatur kadar glukosa darah
Pembuatan Insulin

1921.Insulin pertama kali di

ekstraksi dari jaringan pankreas
anjing

1965. Insulin manusia telah berhasil

disintesis secara kimia.
Insulin diisolasi dari pankreas
sapi/babi  memuaskan, akan
tetapi :
1. Ada perbedan pada asam amino
penyusunnya yang dapat
menimbulkan alergi
2. Prosedur pemurnian sulit dan
 Pig (Babi)
 Cow (Sapi)

Apa kelemahan ???

 Inkompatibilitas terdapat protein

berbahaya misal prion penyebab sapi

gila (madcow)  kematian
 Halal-haram ??
 Pengobatan diabet tipe 1

 Pasien harus
mendapatkan suplai
insulin dari luar.

 Dari mana insulin

diperoleh ????
Insulin diproduksi Produk hormon insulin
dapat dihasilkan dari
menggunakan sel
teknik rekayasa genetik
mikroba yang dengan teknologi
tidak patogen plasmid.

Produksi insulin dapat

dilakukan dengan cara
mentransplantasikan
gen pengendali hormon
ke plasmid bakteri.
Dasar

 DNA melakukan transkripsi dan translasi

 Sehingga meskipun dimasukkan ke makhluk lain dia masih
tetap melakukan proses-proses transkripsi dan translasi.

 Jika DNA tuan rumah disisipi gen penghasil insulin maka DNA
rekombinan tadi akan memproduksi insulin

 Jika DNA makhluk hidup disisipi gen penyandi interferon maka di

dalam sel baru ia akan menghasilkan antivirus

 Jika DNA penyandi somatropin dimasukkan ke makhluk hidup lain

maka ia menghasilkan hormon pertumbuhan
 Metode

 Komponen yang dibutuhkan:

• Gen bermanfaat (potongan DNA)
• Vektor pembawa/vehicle (mis. DNA Plasmid)
• Sel tuan rumah: E.coli (bakteri), S.cerevisae (jamur),
N.tobaccum (tumbuhan)
• Enzim-enzim untuk memotong, menyambung DNA.
Proses Pembuatan Insulin
Isolasi plasmid Plasmid dipotong
e.coli pada bakteri menggunakan
yang akan enzim restriksi
direkayasa endonuklease

DNA yg di isolasi dari

sel pankreas dipotong
pada suatu segmen
untuk ambil segmen
pengkode insulin

DNA kode insulin Hasilnya adalah

disambungkan dengan kombinasi DNA kode
plasmid menggunakan insulin dengan plasmid
bantuan enzim DNA bakteri  DNA
ligase. rekombinan
 Bakteri yang Memilih koloni bakteri
mengandung DNA yang mengandung DNA
rekombinan rekombinan dengan
diidentifikasi menempatkan pada kertas
menggunakan probe filters yang disinari UV

Bakteri yang memiliki

DNA rekombinan
yang telah diberi
probe akan bersinar

Bakteri inilah yang

akan memproduksi
hormon insulin
 TUGAS

 BUAT PPT
• Dikumpulkan tgl 18-12-2017
• Tema : Permanfaatan dan perkembangan biologimolekuler

Misal : Penerapan biomol dalam pembuatan keju

Kloning