Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika Astry Eka Citrasari, 1006775842 1. Mengapa enzim phosphatase diperlukan dalam penyambungan DNA dengan enzim ligase Sebelum menjawab pertanyaan perlu kita ketahui dulu struktur dari DNA. Pada DNA terdapat gugus fosfat. Gugus fosfat menjadi penyambung antara gugus gula satu dengan yang lainnya (lihat gambar 1). Setelah dipotong dengan enzim

restriksi, DNA akan berbentuk linear dan salah satu ujung DNA adalah gugus fosfat 5. Akan ada sebuah kemungkinan DNA akan kembali membentuk sirkular karena salah satu ujung 3 terdapat OH. Oleh karena itu dibutuhkan enzim tersebut. Enzim fosfatase merupakan enzim yang secara hidrolitikal menghilangkan gugus fosfat 5 dari molekul DNA dan menggantinya dengan gugus hidroksil. Bertujuan untuk mencegah penyambungan yang tidak diinginkan setelah terjadi restriksi. Enzim ini menjaga molekul DNA tetap dalam bentuk linearnya dan tidak menutup kembali ke posisi sirkular karena jika ujung 5 adalah gugus hidroksil, gugus terebut tidak akan berikatan dengan gugus 3 yang hidroksil juga.
Gambar 2. Struktur basa adenin ketika gugus fosfat telah diubah dengan gugus hidroksil Sumber : http://wordbiology.wordpress.com/2009/11/09/s ubstansi-genetika/ Sumber : http://wordbiology.wordpress.com/2009/11/09/s ubstansi-genetika/ Gambar 1. Struktur DNA. Bagian yang dilingkari adalah gugus fosfat pada DNA

fosfatase

untuk

menghindari

hal

1006775842

Page 1

Rekayasa Genetika
2. Sebutkan tahapan umum dari proses pemurnian DNA dari E. Coli a) Pemecahan sel Pada umumnya sel dipecahkan dengan bantuan enzim lysosim. Lisosim (muramidases) adalah keluarga enzim dengan aktivitas antimikroba yang ditandai dengan kemampuan untuk merusak

dinding sel bakteri. Enzim ini berkerja dengan cara mengkatalisasi hidrolisis ikatan 1,4-beta antara Nacetylmuramic asam dan residu N-asetil-D-

glukosamin di peptidoglycans dan antara residu Nasetil-D-glukosamin di chitodextrins.

Gambar 3. Bentuk enzim lizosim dalam kemasan Sumber : http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=3 C6EACCB-232E-44DC-913F-6D9B16BEF8D5

Meskipun ayam putih telur lisozim yang paling efektif untuk lisis bakteri gram positif, itu juga memfasilitasi lisis bakteri gram negatif seperti Salmonella dan Shigella. Lisis E. coli terutama ditingkatkan dengan penambahan lisozim dan enzim nuclease seperti DNase I. Dewasa ini telah diperoleh juga jenis lizosim yang lebih baik untuk pemecahan sel yaitu lizosim rekombinan. Lizosim ini lebih efektif daripada jenis lain. Lizosim rekombinan ini tidak mendenaturasi protein saat digunakan, justru dapat membantu produksi protein.

Gambar 4. Struktur dari deterjen Sumber :

http://www.piercenet.com/browse.cfm?

Selain dengan enzim lizosim, pemecahan sel dengan deterjen juga umum digunakan. Deterjen memecah sel menggunakan prinsip hidrofobik dan hidrofilik. Deterjen adalah molekul yang ampifatik yaitu memiliki molekul
Gambar 5. Struktur dari micelle Sumber :

http://www.piercenet.com/browse.cfm?

yang hidrofobik dan hidrofilik. Deterjen yang

1006775842 Page 2

Rekayasa Genetika
sudah berada di membran sel, sisi hidrofobiknya mengikat bagian hidrofobik dari membran sel yang kemudian menghilangkan fosfolipid dan membentuk micelle yang mengakibatkan sel pecah

b) Penghilangan protein dan kromosom DNA 'kromosom' DNA (DNA genom bakteri) dapat dihilangkan dengan

sentrifugasi karena dengan sentrifugasi akan terjadi pemisahan yang berdasarkan ukuran molekul. Molekul yang berat akan berada di bawah dan yang lebih ringan akan tetap melayang dipermukaan. Protein sendiri dihilangkan dengan cara ekstraksi ke fenol dan kloroform. Pemisahan DNA dari molekul-molekul lain juga dapat dilakukan dengan kromatografi. Kromatografi berprinsip pada pemisahan dengan adsorpsi dengan fase padat. Fase padat nya bisa bermacam-macam sesuai kebutuhan molekul yang akan dipisahkan. Pada umumnya digunakan Silika. Dengan Silika, DNA akan tertahan pada kolom kromatografi tetapi polisakarida dan protein tidak tertahan di silika sehingga terjadi pemisahan. Untuk mengelusi DNA dari silika digunakan larutan buffer bergaram rendah.

c) Mengambil Plasmid DNA Saat setelah sentrifugasi, tidak semua dapat di pisahkan butuh perlakuan lebih lanjut. Asam nukleat yang tetap dalam larutan kemudian diendapkan, biasanya dengan penambahan natrium asetat atau amonium dan etanol. Asam nukleat diendapkan dalam tahap ini meliputi DNA plasmid, setiap DNA kromosom yang sentrifugasi tidak menghapus, dan RNA. Kontaminasi DNA kromosom harus rendah, tetapi jika perlu dapat dihilangkan dengan pengobatan dengan exonuclease, karena kemungkinan untuk hadir sebagai fragmen linear dicukur. DNA plasmid sirkular akan tahan terhadap pencernaan exonuclease, karena tidak memiliki ujung bebas. Kontaminasi RNA dalam larutan dapat dihancurkan jika perlu dengan ribonuklease. Metode ini akan meninggalkan kita dengan persiapan DNA plasmid yang biasanya cocok untuk digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.

d) Pemurian lebih lanjut jika dibutuhkan

1006775842

Page 3

Rekayasa Genetika
3. Buatkan forward primer dan reverse primer dari gen dibawah ini 5ATGAACGCTCTCCAAGAAGATACTCCACCCGGACCATCAACGGTGTTCAGGCC ACCAACAAGTTCAC AAAGCTTGATTACCACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCGCAAGAAGGTGTATAA GACTGTAA-3 Jawaban : Keterangan : Tulisan merah : DNA Template Tulisan Hitam : DNA komplementer 5ATGAACGCTCTCCAAGAAGATACTCCACCCGGACCATCAACGGTGTTCAGGCC 3-TACTTGCGAGAGGTTCTTCTATGAGGTGGGCCTGGTAGTTGCCACAAGTCCGG ACCAACAAGTTCAC TGGTTGTTCAAGTG AAAGCTTGATTACCACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCGCAAGAAGGTGTATAA TTTCGAACTAATGGTGATGAGGGTCGGCTGGGGCTTGGCGTTCTTCCACATATT GACTGTAA-3 CTGACATT-5 Tulisan Hijau : sekuens yang akan diprimerkan

1006775842

Page 4

Rekayasa Genetika
Forward primer Diambil dari urutan DNA templatenya. Karena primer harus dimulai dari 5 Sekuens yang dipilih dari ujung awal 5 karena ujung awal tersebut mempunyai kodon ATG, yiatu kodon start Pemilihan sekuen berhenti pada C untuk meningkatkan efisiensi dari priming Sekuensnya adalah

5-ATG AAC GCT CTC CAA GAA GAT ACT CCA CCC-3
Reverse Primer Diambil dari urutan DNA komplementernya. Karena primer harus dimulai dari 5 Pemilihan sekuen berhenti pada G untuk meningkatkan efisiensi priming

5-ACA CCT TCT TGC GGT TCG GGG TCG GCT GGG-3

Daftar Pustaka

Howe, Christopher.2007.Gene Manipulation and Cloning.United Kingdom : Cambridgre University Press Anonim. Lyzozym.http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=3C6EACCB-232E-

44DC-913F-6D9B16BEF8D5(diakses pada 16 September 2012 pukul 21.09) Anonim, Primer design.

http://bioweb.uwlax.edu/genweb/molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htm . (diakses pada 16 September 2012 pukul 21.00) Fatkhomi,Farid.Substansi http://wordbiology.wordpress.com/2009/11/09/substansi-genetika/(diakses September 2012 pukul 20.00) http://www.youtube.com/watch?v=hD20ShdJs9s Genetika. pada 16

1006775842

Page 5

Rekayasa Genetika

1006775842

Page 6