HALAMAN JUDUL

HALAMAN PENGESAHAN

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR

DAFTAR TABEL

I. PENGENALAN ALAT, BEKERJA ASEPTIK, STERILISASI, DAN PEMBUATAN MEDIA A. Pendahuluan 1. Latar Belakang a. Bekerja secara aseptik dan sterilisasi Bekerja secara aseptik merupakan hal yang paling utama dalam bekerja atau melakukan pengamatan dengan menggunakan mikrobia. Kesterilan pengguna, alat dan bahan-bahan mutlak dibutuhkan karena mikrobia tersebut berukuran sangat kecil, tidak kasat mata, mudah trsebar, dapat hidup dimana saja maka dibutuhkan suatu keadaan yang benar-benar steril. Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam laboratorium mikrobiologi. Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi media. 2. Tujuan Praktikum a. Mengenal jenis-jenis peralatan yang digunakan pada laboratorium mikrobiologi dan cara penggunaannya b. Memiliki ketrampilan dasar bekerja secara aseptik c. Mengetahui cara-cara sterilisasi alat-alat d. Mengetahui cara pembuatan media dan fungsi dari masing-masing media B. Tinjauan Pustaka 1. Pengenalan Alat Pada dasarnya setiap alat memiliki nama yang menunjukkan kegunaan alat, prinsip kerja atau proses yang berlangsung ketika alat digunakan. Beberapa kegunaan alat dapat dikenali berdasarkan namanya. Penamaan alat-alat yang berfungsi mengukur biasanya diakhiri dengan kata meter seperti thermometer,hygrometer dan spektrofotometer,dll.

Alat-alat pengukur yang disertai dengan informasi tertulis, biasanya diberi tambahan graph seperti thermograph,barograf ( Moningka, 2008). Mikroskop adalah alat yang paling khas dalam laboratorium mikrobiologi yang memberikan perbesaran yang membuat kita dapat melihat struktur mikroorganisme yang tidak dapat dilihat oleh mata telanjang. Mikroskop yang tersedia menungkinkan jangkauan perbesaran yang luas dari beberapa kali hingga ribuan kali (Lay,1994). 2. Bekerja Secara Aseptik Teknik transfer aseptis adalah suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi (Pelczar, M. J., Chan, 2007). Teknik aseptik sangat diperlukan untuk menghindarkan

mikroorganisme dari kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Teknik aseptis digunakan sepanjang kegiatan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikannya, untuk alat dan bahan praktikum dapat diterapkan metode sterilitas. Penguasaan teknik aseptic ini sangat diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi (Oram, 2001). 3. Sterilisasi Sterilisasi dengan uap air panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat didterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. alat ini disebut Arnold steam sterilizer dengan suhu 1000Cdalam keadaan lembab. Secara sederhana dapat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 1000C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetatif mikrobia. kemudian disimpan pada suhu kamr 24 jam untuk memberi kesempatan spora tumbuh menjadi sel vegetatif, lalu dipanaskan lagi 1000C 30 menit. dan diinkubasi lagi 24 jam dan

disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan (Machmud, 2008). Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas-gas seperti

formaldehide, etilenoksida atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia; oleh sinar lembayung ultra atau sinar gamma. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Curtis, 1999). 4. Pembuatan Media Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 oC. Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen.

Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar (Machmud, 2008). Konsisten medium dapat dibuat bermacam-macam bergantung kepada keperluannya. Bahan yang paling umum digunakan untuk membuat medium menjadi padat dapat dipakai agar. Praktisnya semua media yang digunakan untuk penyediaan medium mikroba sudah secara komersial dalam bentuk bubuk dan juga dalam bentuk siap pakai. Dalam penyediaan media, kebanyakan bersifat alamiah sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan (Pelczar, 1986). Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wadah yang telah disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk

medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya, semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrient Agar), TSA (Trypticase Soy Agar) dan lain-lain. Bakteri, dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus (inti sel), Cytoskelen, dan organik lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena bakteri merupakan prokaryota, untuk membedakan dengan organisme lain yang memiliki sel yang lebih kompleks, disebut eukaryota. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya berukuran 0.5 5 m, meskipun akan ada juga jenis yang dapat menjangkau 0.3 mm dalam diameter (Thiomargarita) (Rachdie, 2006). Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi ultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Indra, 2008). C. Metodologi Praktikum 1. Waktu dan Tempat Praktikum Hari dan Tanggal : Rabu, 07 Oktober 2013 Waktu : 12.20 14.40 WIB Tempat : Laboratorium Biologi Tanah Fakultas Pertanian UNS 2. Alat a. Pengenalan Alat 1) Jarum OSE 2) Gelas ukur kaca+plastik

3) Pipet tetes 4) Pinset 5) Kaca preparat 6) Deglass 7) Dryglaski 8) Hand colony counter 9) Rak + chip 10) Pipet ukur 11) Mikropipet 12) Labu takar 13) Mortar 14) Lup 15) Tabung erlenmeyer 16) Beaker glass 17) Petridish 18) Sprayer + alkohol 19) Tabung reaksi 20) Pengaduk 21) Hemasitometer 22) Lampu bunsen 23) Spatula 24) Saringan mikoriza 25) S baker 26) Vortex 27) Mikroskop stereo 28) Mikroskop binokuler 29) Oven 30) Autoklaf 31) LAF 32) Inkubator 33) Hot plate stirer

34) Kompor listrik 35) Centrifuge b. Bekerja secara aseptis 1) Tabung reaksi 2) Petridish yang berisi biakan bakteri atau jamur atau

actinomycetes 3) Lampu Bunsen 4) Sarung tangan 5) Masker atau slayer 6) Botol semprot 7) Jarum ose c. Sterilisasi alat dan medium 1) Erlenmeyer 2) Jarum inokulasi, jarum ent, jarum ose 3) Petridish 4) Otoklaf 5) Tabung reaksi 6) Pipet 7) Pipet drop d. Nutrient Agar dan Potato Dexrose Agar 1) Timbangan analitik 2) Stirrer/Pengaduk 3) Erlenmeyer 4) Beaker glass 5) Petridish 6) Kompor gas/hot plate stirrer 3. Bahan a. Bekerja secara aseptis 1) Alkohol 70% 2) Kapas penyumbat 3) Koloni bakteri dalam media

b. Sterilisasi alat dan medium 1) Aquadest untuk mencuci alat 2) Kertas pembungkus 3) Karet 4) Plastik pembungkus c. Nutrient Agar (NA) : Beef extract 3 g Peptone 5 g Agar 15 g Aquades 1000 ml NaCl 5 g

d. Potato Dextrose Agar (PDA) : Kentang 3 g Peptone 5 g Agar 15 g Aquades 1000 ml

4. Cara Kerja a. Bekerja secara aseptik 1) Mencuci tangan dan membersihkan meja dengan alkohol 70% 2) Memakai sarung tangan dan masker 3) Memfiksasi ujung jarum ose pada api bunsen 4) Membuka tutup penyumbat tabung reaksi dengan tangan kanan, dan tabung reaksi berada di tangan kiri 5) Memfiksasi tabung reaksi pada lampu bunsen tersebut 6) Mengambil inokulum bakteri dengan jarum ose dalam keadaan dekat dengan api bunsen 7) Memfiksasi kembali tabung reaksi kemudian menutupnya dengan penyumbat 8) Memindahkan segera inokulum dari tabung reaksi ke dalam petridish yang telah berisi media agar, dengan cara mengoleskan zig-zag secara tipis dalam keadaan dekat dengan api bunsen

b. Sterilisasi alat dan medium 1) Mencuci bersih semua alat yang akan disterilkan 2) Membungkus petridish, tabung reaksi, pipet dan pipet drop dengan kertas 3) Memasukkan alat-alat yang telah dibungkus ke dalam otoklaf 4) Mengatur suhu, tekanan, dan waktu pada otoklaf 5) Mengambil alat dari otoklaf, diusahakan alat tetap steril dengan tidak membuka kertas pembungkus c. Pembuatan Nutrient Agar (NA) 1) Memotong kentang menjadi bagian-bagian kecil 2) Menimbang komponen medium dengan menggunakan

timbangan analitis 3) Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua, satu bagian untuk melarutkan beef extract dan peptone, dan sebagian lagiuntuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak 4) Mengaduk sebagian air secara konstan dan diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate strirrer 5) Mengaduk pada sebagian akuades pada pelarutan beef extract dan peptone 6) Menuangkan larutan beef extract dan peptone ke larutan agar sampai larut dan homogen 7) Memasukkan media ke dalam labu erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf 8) Menuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis d. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA) 1) Memotong kentang menjadi kecil-kecil 2) Menimbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis 3) Merebus kentang dalam sebagian akuades selama 1-3 jam sampai lunak, kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring

dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di beaker glass baru 4) Agar dilarutkan dengan stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi 5) Mencampur ekstrak kentang dan agar-dekstrosa sampai larut dan homogen 6) Menuang media ke dalam erlenmeyer atau tabung reaksi kemudian siap untuk di sterilisasi