Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

MODUL 1.07 Teknik Fermentasi

I. Pendahuluan

Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk menghasilkan metabolit promer dan metabolit sekunder dalam suatu lingkungan yang dikendalikan. Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap awal proses fermentasi yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar dapat diperoleh sel yang hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium, komposisi medium, suplai O2, dan agitasi. Bahkan jumlah mikroba dalam fermentor juga harus dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi. Nutrisi dan produk fermentasi juga perlu dikendalikan, sebab jika berlebih nutrisi dan produk metabolit hasil fermentasi tersebut dapat menyebabkan inhibisi dan represi. Pengendalian diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu medium fermentasi dipengaruhi banyak faktor baik ekstraselular maupun faktor intraselular. Kinetika pertumbuhan secara dinamik dapat digunakan untuk meramalkan produksi biomassa dalam suatu proses. Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan fermentor bervolume 5 L dengan volume kerja 2 L. Sebagai biakan digunakan Saccharomycess cereviceae dengan substrat glukosa 1% pada pH 4,5. Fermentasi dilakukan secara aerobik dengan laju aerasi dijaga antara 7 sampai 8 v/v/m. Praktikan bertugas mengamati profil pertumbuhan biomassa sel. Pengamatan dilakukan dengan pengambilan sampel setiap satu jam. Pada sampel dianalisis konsentrasi sel/biomassa dan konsentrasi glukosa. Setlah serangkaian tahap penyiapan sampel, konsentrasi sel dan glukosa dilakukan secara spektrofotometri terhadap absorbansi, kemudian dengan korelasi pada kurva baku akan diketahui konsentrasi sel dan glukosa yang sebenarnya. Data-data ini kemudian diplot menjadi sebuah grafik pertumbuhan sel. Dari grafik ini dapat diamati yield dan max. Dalam percobaan ini diasumsikan laju pertumbuhan pada setiap bagian fermentor sama untuk waktu tertentu. Pengadukan dianggap sempurna sehingga konsentrasi komponen sama di setiap bagian fermentor.

-1/24-

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

II. Tujuan

Dengan melaksanakan praktikum Modul Teknik Fermentasi, praktikan akan mengenal teknik pelaksanaan fermentasi dalam produksi biomassa.

III. Sasaran

Praktikum ini dilakukan agar praktikan dapat mengoperasikan fermentasi mulai dari penyiapan medium, pelaksanaan dan pengakhiran fermentasi. Pada akhirnya praktikan dapat menggambarkan kurva pertumbuhan mikroorganisme dan konsumsi substratnya pada suatu proses fermentasi

IV. Tinjauan Pustaka

Fermentasi berasal dari bahasa Latin fervere yang berarti mendidihkan. Seiring perkembangan teknologi, definisi fermentasi meluas, menjadi semua proses yang melibatkan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk yang disebut metabolit primer dan sekunder dalam suatu lingkungan yang dikendalikan. Pada mulanya istilah fermentasi digunakan untuk menunjukkan proses pengubahan glukosa menjadi alkohol yang berlangsung secara anaerob. Namun, kemudian istilah fermentasi berkembang lagi menjadi seluruh perombakan senyawa organik yang dilakukan mikroorganisme yang melibatkan enzim yang dihasilkannya. Dengan kata lain, fermentasi adalah perubahan struktur kimia dari bahan-bahan organik dengan memanfaatkan agen-agen biologis terutama enzim sebagai biokatalis. Produk fermentasi dapat digolongkan menjadi 4 jenis: 1. produk biomassa 2. produk enzim 3. produk metabolit 4. produk transformasi Dalam bioproses fermentasi memegang peranan penting karena merupakan kunci (proses utama) bagi produksi bahan-bahan yang berbasis biologis. Bahan-bahan yang diuhasilkan melalui fermentasi merupaklan hasil-hasil metabolit sel mikroba, misalnya antibiotik, asam-asam organik, aldehid, alkohol, fussel oil, dan sebagainya. Di samping hasil-hasil metabolit tersebut, fermentasi juga dapat diterapkan untuk menghasilkan

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 2 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

biomassa sel mikroba seperti ragi roti (baker yeast) yang digunakan dalam pembuatan roti. Untuk menghasilkan tiap-tiap produk fermentasi di atas dibutuhkan kondisi fermentasi yang berbeda-beda dan jenis mikroba yang bervariasi juga karakteristiknya. Oleh karena itu, diperlukan keadaan lingkungan, substrat (media), serta perlakuan (treatment) yang sesuai sehingga produk yang dihasilkan optimal. Pada percobaan ini digunakan ragi Saccharomycess cereviceae, yang bersifat fakulktatif anaerobik. Pada kondisi aerobik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik adalah oksigen. Pemanfaatan pada keadaan ini menghasilkan penambahan biomassa sel dengan persamaan reaksi sebagai berikut: C6H12O6 CO2 + H2O + biomassa sel Pada kondisi anaerobik, Saccharomycess cereviceae menggunakan senyawa organik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik. Dalam hal ini yang digunakan adalah glukosa dari substrat dengan hasil akhir perombakan berupa alkohol (etanol), aldehid, asam organik, dan fussel oil. Reaksi yang berlangsung dalam keadaan anaerobik tersebut adalah sebagai berikut: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + produk samping Pada percobaan ini digunakan glukosa sebagai substrat utama. Hal ini disebabakan struktur model glikosa yang sederhana sehingga mudah digunakan oleh Saccharomycess cereviceae. Glukosa digunakan sebagai sumber energi dan sumber karbon yang digunakan untuk membentuk material penyusun sel baru. Glukosa disebut juga reducing sugar sehingga pemanfaatannya oleh Saccharomycess cereviceae dilakukan dengan mengoksidasi glukosa yaitu dengan cara pemutusan ikatan rangkap pada gugus karbonil glukosa. Media yang digunakan di dalam fermentasi harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel Saccharomycess cereviceae mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel Saccharomycess cereviceae tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam penggunaan substrat. Oleh karena itu, selain glukosa, ke dalam medium fermentasi juga ditambahkan zat-zat lain yang berfungsi sebagai sumber makronutrien dan mikronutrien serta growth factor.

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 3 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Proses pertumbuhan mikroba sangat dinamik dan kinetikanya dapat digunakaan untuk meramal produksi biomassa dalam suatu proses fermentasi. Faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan dan perilaku mikroba dapat digolongan dalam faktor intraseluler dan faktor ekstraselular. Faktor intraselular meliputi struktur, mekanisme, metabolisme, dan genetika. Sedangkan faktor ekstraselular meliputi kondisi lingkungan seperti pH, suhu, tekanan. Proses pertumbuhan mikroba merupakan proses yang memiliki batas tertentu. Pada saat tertentu, setelah melewati tahap minimum, mikroba akan mengalami fasa kematian. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan berhentinya pertumbuhan mikroba antara lain: 1. Penyusutan konsentrasi nutrisi yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikroba karena habis terkonsumsi. 2. Produk akhir metabolisme yang menghambat pertumbuhan mikroba karena terjadinya inhibisi dan represi. Pertumbuhan kultur mikroba umumnya dapat digambarkan dalam suatu kurva pertumbuhan. Pertumbuhan mikroba dapat terbagi dalam beberapa tahap seperti pada Gambar 1, antara lain: 1. Fasa stationer adalah fasa yang disebut fasa adaptasi/ lag phase. Pada saat ini mikroba lebih berusaha menyesuaikan diri dengan lingkungan dan medium baru daripada tumbuh ataupun berkembang biak. Pada saat ini mikroba berusaha merombak materi-materi dalam medium agar dapat digunakan sebagai nutrisi untuk pertumbuhannya. Bila dalam medium ada komponen yang tidak dikenal mikroba, mikroba akan memproduksi enzim ekstraselular untuk merombak komponen tersebut. Fasa ini juga berlangsung seleksi. Hanya mikroba yang dapat mencerna nutrisi dalam medium untuk pertumbuhannya lah yang dapat bertahan hidup. 2. Fasa pertumbuhan dipercepat adalah fasa dimana mikrioba sudah dapat menggunakan nutrisi dalam medium fermentasinya. Pada fasa ini mikroba banyak tumbuh dan membelah diri sehingga jumlahnya meningkat dengan cepat. Laju pertumbuhan =

dX meningkat mencapai nilai maksimumnya. dt

= laju pertumbuhan mikroba (sel/detik) X = jumlah mikroba hidup

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 4 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

3. Fasa eksponensial adalah akhir fasa pertumbuhan dipercepat. Pada fasa ini laju pertumbuhan tetap pada laju pertumbuhan maksimum (maks). Nilai maks ini ditentukan oleh konstanta jenuh/ saturasi substrat. Nilai maks untuk setiap mikroba juga tertentu pada masing-masing substrat. 4. Fasa pertumbuhan diperlambat mulai pada akhir fasa eksponensial. Pertumbuhan mikroba yang begitu cepat tidak diimbangi tersedianya nutrisi yang cukup. Jika fermentasi dilakukan secara batch, dimana umpan nutrisi dimasukkan hanya pada awal proses fermentasi, pada waktu tertentu saat jumlah mikroba yang mengkonsumsi nutrisi tersebut melebihi daya dukung nutrisi akan terjadi kekurangan nutrisi. Hal lain yang memperlambat pertumbuhan mikroba adalah terjadinya inhibisi ataupun represi yang terjadi karena terakumulasinya produk metabolit sekunder hasil aktifitas fermentasi mikroorganisme. 5. Fasa kematian terjadi apabila nutrisi sudah benar-benar tidak dapat lagi mencukupi kebutuhan mikroorganisme. Keadaan ini diperparah oleh akumulasi produk metabolit primer dan sekunder yang tidak dipanen sehingga terus menginhibisi ataupun merepresi pertumbuhan sel mikroorganisme. Selain itu umur sel juga sudah tua, sehingga pertahan sel terhadap lingkungan yang berbeda dari kondisi biasanya juga berkurang.

Gambar 1 Kurva Karakteristik Pertumbuhan Sel dalam Medium Fermentor

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 5 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

. Dalam percobaan ini, proses fermentasi ragi tersebut melalui 4 tahapan: 1. tahap persiapan medium fermentor 2. tahap sterilisasi 3. tahap pembuatan inokulum dan pengembangan starter 4. tahap pelaksanaan fermentasi Tahap Persiapan Medium Fermentasi Medium yang digunakan adalah medium cair yang terdiri dari 2 macam larutan. Larutan pertama berisi garam-garam nutrisi untuk pertumbuhan ragi, sedangkan larutan kedua adalah substrat yang umumnya berupa latutan glukosa dalam air. Nutrisi yang diperlukan dalam medium petumbuhan ragi antara lain unsur N, S, O, H, Mg, K, Ca. Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Kadar senyawa-senyawa yang diperlukan supaya medium dapat mendukung pertumbuhan ragi secara optimal harus ditentukan berdasarkan komposisi masing-masing unsur dalam sel ragi yang telah banyak diteliti dan dibukukan. Adapun komponen dari media yang digunakan adalah sebagai berikut: a. Substrat utama Sebagai substrat utama digunakan larutan glukosa. Karena glukosa adalah substrat utama, maka pertumbuhan biomassa sel Saccharomycess cereviceae merupakan fungsi dari konsentrasi glukosa. Hasil perombakan glukosa oleh sel adalah berupa CO2 dan H2O. b. Sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor. Sebagai sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor umumnya Laboratorium Mikrobiologi dan teknologi Bioproses Dept. Teknik Kimia ITB menggunakan zat-zat sebagai berikut: 1. (NH4)2SO4 sebagai sumber nitrogen yang berguna bagi pembentukan asam nukleat dan asam-asam amino. 2. K2SO4 sebagai sumber K+ yang merupakan kofaktor enzim 3. Na2HPO4.2H2O sebagai sumber Na dan P. Na berfungsi sebagai kofaktor dan P berguna untuk sintesis asam nukleat, ATP, fosfolipid, dan senyawa yang mengandung fosfor lainnya. 4. MgSO4 sebagi sumber Mg yang berperan di dalam stabilisasi ribosom, stabilisasi membran dan dinding sel, serta berfungsi sebagai kofaktor enzim. 5. CaCl2 sebagai sumber Ca untuk stabilisasi dinding sel

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 6 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

6. ZnSO4 sebagai sumber Zn yang berfungsi sebagai regulator enzim 7. Fe(NH4)(SO4) sebagai sumber Fe, makronutrien pembentuk sitokrom pembawa elektron dalam jalur transportasi elektron. 8. CuSO4 sebagai sumber Cu yang berperan penting dalam reaksi redoks metabolisme. 9. yeast extract sebagai penyedia asam-asam amino tunggal, growth factor dan berbagai vitamin yang dibutuhkan sel 10. aqua dm, sebagai media pelarut dan pengaduk dalam transportasi senyawa. Setelah medium substrat dan medium nutrisi dicampurkan, diusahakan pH tetap 4-5 yang merupakan pH optimal pertumbuhan sel ragi. Tahap Sterilisasi Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga terbebas dari kontaminasi mikroorganisme lain. Sterilisasi perlu dilakukan karena kontaminasi mikroba lain akan memberikan dampak yang tidak menguntungkan sebagai berikut: 1. 2. 3. kontaminan meningkatkan persaingan di dalam mengkonsumsi substrat sehingga akan mengurangi perolehan kontaminan dapat menghambat proses metabolisme sel sehingga akan mengurangi perolehan kontaminan meningkatkan turbiditas sehingga dapat mengacaukan pengukuran terhadap jumlah sel setiap saat. Pada percobaan ini proses sterilisasi dilakukan di laboratorium dengan menggunakan autoclave. Autoclave melakukan sterilisasi dengan menggunakan panas lembab. Keuntungan penggunaan panas lembab dalam proses sterilisasi adalah kelembaban mempermudah proses denaturasi protein sel kontaminan. Autoclave dioperasikan pada tekanan 15 psia dan temperatur 121 oC selama 15 menit. Pada saat sterilisasi beberapa lubang pada fermentor ditutup dengan kapas. Tujuannya adalah untuk mengalirkan udara panas dari dalam fermentor sehingga tidak terjadi tekanan yang terlalu tinggi di dalam fermentor selama sterilisasi. Sedangkan tujuan lain penggunaan kapas adalah agar kehilangan uap air selama sterilisasi minimal. Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi tidak boleh disterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses karamelisasi. Karamelisasi disebut juga proses reduksi Maillard. Proses ini terjadi karena gugus karbonil pada glukosa bereaksi dengan gugus amonium atau protein dari medium

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 7 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

sehingga membentuk nitrogen hitam. Senyawa ini tidak dapat dioksidasi mikroba dan disebut unfermented substrate. Akibat reaksi ini glukosa tidak dapat diuraikan oleh sel ragi, bahkan menjadi inhibitor terhadap sel ragi tersebut. Reaksi karamelisasi glukosa ini berlangsung sebagai berikut: R-COH + NH2-R R-COH-NH2 + produk lain Karena itu, proses sterilisasi dilakukan terpisah. Larutan nutrisi dimasukkan dalam fermentor dan disterilisasi sekaligus bersama fermentornya. Larutan glukosa disterilisasi sendiri dalam erlenmeyer. Setelah fermentor dan medium steril dingin, larutan glukosa steril dimasukkan secara aseptik ke dalam fermentor. Kemudian pH diatur sampai 4,5 dengan menambahkan HCH steril 1 N. Nilai 4,5 adalah pH optimum pertumbuhan ragi. Tahap Penyiapan Inokulum Setelah seluruh alat dan bahan steril, dilakukan inokulasi Saccharomycess cereviceae dari biakan murni. Yang digunakan sebagai inokulum adalah biakan ragi pada agar miring. Komposisi medium starter adalah sama dengan komposisi media fermentasi dengan penambahan growth factor. Inokulum tersebut dimasukkan dalam campuran larutan nutrisi dan substrat yang diambil sebagian dari fermentor dan dimasukkan dalam labu erlenmeyer 150 mL. Tujuan dibiakkannya ragi dalam starter adalah mengadaptasikan sel terhadap media fermentasi. Dengan adanya adaptasi pada starter ini diharapkan lag phase sebagai tahap awal fermentasi dilewati. Biakan diusahakan tepat berada pada akhir fasa logaritmik. Dengan demikian pertumbuhan sel ragi akan maksimum dalam waktu yang relatif singkat. Inokulasi Sacchromycess cereviceae dilakukan secara aseptis untuk menjaga kemurnian biakan. Setelah dimasukkan dalam medium, inokulum tersebut diletakkan dalam alat shaker selama, paling cepat, 16 jam. Fungsi shaker adalah mempermudah difusi oksigen ke dalam medium sehingga kontak antara dan inokulum makin banyak dan homogen. Hal ini penting dilakukan untuk menjaga kondisi biakan tetap aerobik. Jika difusi oksigen dalam medium lancar, kadar DO (oksigen terlarut) dalam medium akan cukup mendukung pertumbuhan sel secara aerobik. Jika sel hidup secara aerobik, biomassa baru akan lebih banyak terbentuk daripada etanol. Dengan demikian pada akhir masa inkubasi shaker ini diharapkan juga sel sudah berada pada akhir fasa logaritmik.

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 8 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Tahap Pelaksanaan Fermentasi Tahap ini dimulai saat inokulum yang telah beradaptasi dalam medium dimasukkan dalam medium di fermentor. Pada praktikum ini fermentor yang dipakai bervolume 5 liter. Fermentor adalah suatu reaktor yang dipersiapkan untuk melakukan reaksi fermentasi yang dilengkapi dengan pengaduk, saluran aerasi, dan perlengkapan lainnya. Pelaksanaan fermentasi dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1. Nutrisi, substrat, dan inokulan dimasukkan ke dalam fermentor yang dilakukan secara aseptis. Nutrisi dimasukkan ke dalam fermentor sebelum disterilisasi dalam autoclave. Substrat dan inokulan dimasukkan dengan cara memanaskan mulut inlet dengan kapas yang dibakar kemudian medium dan inokulum dimasukkan ke dalam fermentor. 2. Kemudian dilakukan kecepatan aerasi dan agitasi. Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel ragi dalam bentuk gelembung gas. Aerasi diatur pada kecepatan skala 9. Laju oksigen yang disuplai ke dalam fermentor dijaga stabil. Fluktuasi laju alir oksigen ini dapat menurunkan unjuk kerja fermentor karena laju transfer O2 tidak tetap sehingga metabolisme sel ragi terganggu karena kadar DO yang tidak stabil. Agitasi berfungsi sebagai alat penghomogen larutan fermentasi. Agitasi dilakukan pada kecepatan 600 rpm. Pengadukan dilakukan oleh impeller yang berjumlah 3 buah. Semakin banyak impeller di dalam fermentor semakin homogen larutan tersebut. Laju alir udara dan pengadukan saling terkait satu sama lain. Pengaliran udara berfungsi untuk menjaga suplai oksigen agar tetap sedangkan pengadukan akan meningkatkan laju dispersi oksigen ke dalam larutan dan meratakan kadar oksigen di seluruh medium fermentasi. Di pinggiran fermentor juga terdapat baffle yang berfungsi mencegah terjadinya vortex (pusaran air) sehingga dapat meningkatkan efisiensi aerator. Pengaturan udara keluar dan masuk fermentor dilakukan sedemikian rupa sehingga kontaminasi dapat diminimalkan, yaitu dengan cara menggunakan filter mikroba kapas pada aliran masuk dan menggunakan larutan CuSO4 yang bersifat oligodinamik dan mampu membunuh mikroba kontaminan. Pencampuran inokulum ke dalam medium fermentor dilakukan secara aseptik dengan menyalakan api di sekitar tempat pemasukan inokulum. Sebaiknya, sebelum proses fermentasi dimulai, ke dalam medium fermentor ditambahkan zat antifoam yang

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 9 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

berfungsi mencegah terjadinya foaming. Zat antifoam yang banyak digunakan di industri adalah silicon. Foaming terjadi karena protein terdenaturasi dalam medium fermentasi. Selain menggunakan zat kimia, foaming juga dapat dicegah secara mekanik dengan mengatur putaran agitator. Hal ini lebih sering dilakukan karena zat kimia yang terlalu banyak ditambahkan ke dalam medium dapat menjadi inhibitor bagi pertumbuhan mikroba. Pada awal fermentasi diusakan pH medium adalah 4,5 yang optimal bagi pertumbuhan ragi. Selama fermentasi pH medium sangat mungkin mengalami penurunan karena terbentuknya asam organik sebagai produk samping fermentasi. Karena itu pH medium harus dipantau, jangan sampai terlalu drop yang akan mengakibatkan sel ragi mati. Pengambilan dan Pengujian Sampel Dalam percobaan fermentasi ini sampel untuk analisis diambil dari outlet sample yang disebut sampling point. Untuk mencegah kontaminasi udara luar dan menjamin bahwa sampel yang dianalisis adalah medium yang representatif pada kondisi tepat saat pengambilan sampel tanpa terpengaruh kotoran dan sampel sebelumnya yang mungkin ada di aliran sampling point, maka 5 mL pertama dari sampel harus dibuang. Analisis yang diperlukan untuk percobaan ini adalah konsentrasi glukosa dan konsentrasi ragi setiap waktu. Penentuan konsentrasi sel ragi dan glukosa dilakukan dengan analisis spektrofotometri. Prinsip spektrofotometeri adalah analisis turbidometri. Prinsip turbidometeri adalah menganalisis konsentrasi suatu zat berdasarkan kekeruhannya dibanding sampel blanko yang dianggap nilai 0 absorban atau full scale transmitan, atau tidak mengandung konsentrasi zat yang dianalisis. Pada penentuan konsentrasi sel ragi kekeruhan disebabkan oleh suspensi sel ragi. Blanko yang digunkan adalah larutan medium yang persis sama dengan medium fermentor, tetapi yang tidak dipakai sebagai medium pertumbuhan ragi. Analisis dilakukan dengan mengambil data absorbansi. Untuk membuat kurva pertumbuhan diperlukan kurva baku untuk mengkorelasikan antara konsentrasi sel terhadap absorbans. Panjang gelombang yang digunakan untuk menganalisis konsentrasi sel adalah 600 nm. Sampel untuk analisa konsentrasi glukosa harus disentrifugasi terlebih dahulu untuk mengendapkan semua sel ragi sedemikian sampai larutan medium terlihat jernih sehingga tidak mengganggu pancaran sinar saat diperiksa dengan spektrofotometri.

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 10 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Sentrifugasi dilakukan selama 15 menit dengan kecepatan putaran 5000 rpm. Hasil sentrifugasi adalah supernatan di bagian atas yang berupa cairan yang mengandung glukosa residu (belum terkonsumsi sel ragi) dan endapan sel ragi di bagian bawah. Jangkauan konsentrasi sampel yang dapat dideteksi akurat oleh spektrofotometri sangat pendek. Karena itu larutan supernatan glukosa yang telah terpisah dari sel ragi harus diencerkan dahulu. Data absorbansi spektofotometri dengan reagen SomogyiNelson baru akurat pada konsentrasi 20-150 ppm. Analisis pertama dilakukan dengan penambahan Somogyi 1 (yang mengandung Na2SO4 anhidrat, KNa tartrat, Na2CO3, NaHCO3 ) yang berfungsi memberi kondisi basa, dan larutan Somogyi 2 yang mengandung Cu SO4. Saat bereaksi dengan Somogyi 2 glukosa akan teroksidasi. Gugus karbonil glukosa akan teroksidasi menjadi karboksilat sementara Cu2+ akan tereduksi menjadi Cu+. Reaksi redoks tersebut dalam kesetimbangan akan menjadi: Karbonil + Cu2+ + basa Karboksilat + Cu2O + H+ Reaksi redoks ini hanya dapat berlangsung pada kondisi panas. Karena itu setelah supernatan ditambahi Somogyi 2 campuran harus dipanaskan sampai reaksi mencapai kesetimbangan. Reaksi oksidasi dihentikan dengan mendinginkan secara tiba-tiba campuran tersebut dalam es batu. Analisis dilanjutkan dengan penambahan reagen Nielson yang mengandung ansenomolibdate berwarna kuning. Penambahan Nielson dimaksudkan untuk mengubah karboksilat yang ada menjadi gas CO2. Untuk mengeluarkan gas ini, campuran harus dikocok. Setelah penambahan Nielson, larutan akan berubah warna dari biru menjadi kuning. Campuran yang telah bebas CO2 tersebut dianalisis dengan spektrofotometri. Untuk penentukan konsentrasi glukosa digunakan panjang gelombang 520 nm. Panjang gelombang ini sesuai dengan intensitas warna larutan yang berwarna hijau. Konsentrasi glukosa ditentukan dengan bantuan kurva baku absorbasn terhadap konsentrasi glukosa. Penentuan Growth Yield Perolehan biomassa yang menunjukkan produktivitas proses fermentasi dinyatakan sebagai perolehan (Yield). Growth yield ini dinyatakan dengan persamaan:

Y=dimana: X = massa sel saat t X0 = massa sel awal

X X X 0 = S S0 S

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 11 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

S = massa glukosa saat t S0 = massa glukosa awal Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (maks) Laju pertumbuhan spesifik mikroorganisme () diformulasikan sebagai:

=
Nilai akan bernilai maksimum bila

1 dX X dt

dX dX bernilai maksimum. adalah gradien kurva dt dt dX maksimum pada dt

pertumbuhan yang mununjukkan jumlah sel ragi setiap waktu. Nilai

fasa logaritmik, dimana terlihat jumlah mikroba paling tinggi dan konstan selama beberapa saat.

V.

Rancangan Percobaan

V.1 Perangkat dan Alat Ukur 1. Fermentor batch seperti pada Gambar 2 2. Labu erlenmeyer 3. Spektrofotometer V.2 Bahan/ Zat Kimia 1. Glukosa 2. Bahan-bahan nutrisi 3. Biakan mikroba dalam agar miring

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 12 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Sensor Putaran

Motor

Inlet Hole

Inlet Udara

2
Impeller Liquid level

Baffle

Sensor suplai udara

Sparger

Outlet Hole/ Sampling Point

4 Filter Mikroba

Aerator

Gambar 2 Perangkat Alat dan Instrumentasi Modul Fermentasi Keterangan Gambar: 1. 2. 3. Inlet adalah tempat memasukkan inokulan dan medium Pengaduk/impeller adalah alat untuk mendispersikan semua komponen di dalam larutan sehingga larutan dalam fermentor menjadi homogen Sparger adalah alat pemecah gelembung-gelembung udara agar gelembung udara yang terbentuk berukuran kecil sehingga luas permukaan interfasanya lebih besar sehingga laju difusi oksigen ke dalam lerutan labih cepat dan kadar oksigen terlarut meningkat 4. 5. 6. 7. Filter mikroba adalah penyaring kontaminan mikroba dari udara kompresor yang masuk. Filter yang digunakan adalah kapas. Baffle adalah lempengan tipis di dinding fermentor yang bertujuan menghasilkan aliran turbulen dan mencegah terbentuknya vorteks. Sampling point adalah saluran tempat sampel diambil. Inlet udara adalah tempat udara aerasi masuk ke dalam fermentor.

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 13 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.3 Prosedur Kerja V.3.1 Penyiapan Medium Proses penyiapan medium dilakukan mengikuti diagram kerja yang ditunjukkan pada Gambar 3
Komponen-komponen Nutrisi Masukkan Labu Kocok Campurkan, Larutkan dalam air, Aduk Larutan Nutrisi untuk Medium Tambah asam/basa, atur sampai pH 4,5 Larutan Nutrisi pH 4,5 Masukkan Fermentor Masukkan Autoclave Atur suhu 121 oC dan tekanan 15 psi Sterilisasi fermentor+medium dan larutan glukosa Autoclave shut down Dinginkan Keluarkan fermentor Larutan Substrat untuk Medium Glukosa

Labu Kocok

Fermentor + Medium steril

Lar. Substrat steril

Gambar 3 Penyiapan Medium

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 14 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.3.2 Pengembangan Kultur Ragi dalam Labu Kocok Pengembangan kultur ragi dalam labu kocok untuk fasa adaptasi dikerjakan sesuai prosedur kerja yang ditunjukkan pada Gambar 4.

Isikan perlahan @ 135 mL lar Nutrisi 2 Labu Erlenmeyer 500 mL

Glukosa

Labu Kocok

2 Labu Erlenmeyer berisi 135 mL lar Nutrisi

Larutan Substrat untuk Medium Masukkan Autoclave Atur suhu 121 oC dan tekanan 15 psi Sterilisasi lar. nutrisi dalam erlenmeyer dan larutan glukosa

Autoclave shut down Dinginkan Keluarkan lar. nutisi dan lar. glukosa

Lar. nutrisi steril

Lar. glukosa steril Masukkan 10 mL

Lar. nutrisi dengan glukosa steril Dinginkan Lar. nutrisi dengan glukosa steril dingin Inokulasikan Inokulum Kocak pada shaker 30 0C Kultur siap digunakan Biakan ragi dalam agar miring

Gambar 4 Proses Pengembangan Kultur Ragi

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 15 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.3.3 Proses Fermentasi Proses fermentasi ini adalah percobaan utama. Fermentasi dilakukan sesuai prosedur yang ditunjukkan pada Gambar 5

Fermentor Instalasikan dengan benar atur T = 30 0C, r =600 rpm, laju aerasi 1,5 v/v/m Fermentor siap pakai Kultur ragi yang telah didiamkan 16 jam Tuangkan secara steril dan aseptik (dekat api)

Fermentasi dimulai

catat waktu atur pH 4,5 Lakukan prosedur pengambilan sampel dari sampling point Sampel

Gambar 5 Fermentasi Ragi dalam Fermentor

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 16 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.3.4 Pengujian Sampel Pada sampel akan dianalisis konsentrasi sel ragi dan konsentrasi glukosanya. Analisis tersebut dilakukan sesuai prosedur pada Gambar 6.
Fermentor
Catat waktu setiap 1 jam Atur pH 4,5

Sampling Point
Ambil sampel tiap 1 jam, teknik aseptik

Sample Spektrofotometer
Tunggu 15 menit agar panas Atur Ambil 6 mL panjang gelombang 600 nM Jaga agar absorbansi tetap 0,2 - 0,7 Ambil 5 mL, buang

Sample
Ambil 10 mL Ambil 6 mL Ambil 4 mL

Spektrofotometer siap pakai

Sampel untuk Pengukuran Konsentrasi Sel

Sampel untuk Pengukuran Konsentrasi Glukosa

Ambil 2 mL

Data absorbansi sel pada sampel

Ukur absorbansi sampel

Sentrifugasi pada 5000 rpm, 15-20 min.

Penentuan konsentrasi sel

Kurva baku absorbansi vs konsentrasi sel

1,6 mL Somogyi I 0.4 mL Somogyi II

Supernatan
Encerkan hingga kadar glukosa dalam larutan berkisar 20-120 mg/L

Konsentrasi Sel

Supernatan Encer

Campuran reaksi
Kocok, Tutup Panaskan 10 mL Dinginkan secara cepat Masukkan ke dalam es 5 min. 2 mL Nielson 4 mL Aqua DM

Spektrofotometer
Tunggu 15 menit agar panas Atur Ambil 6 mL panjang gelombang 520 nm Jaga agar absorbansi tetap 0,2 - 0,7

Campuran reaksi Analisis

Kocok, hingga semua CO2 keluar

Spektrofotometer siap pakai Data absorbansi Konsentrasi Glukosa pada sampel Kurva baku absorbansi vs kons. glukosa

Supernatan bebas CO2

Ukur Absorbasnsi Lar. Glukosa

Konsentrasi Glukosa

Gambar 6 Prosedur Pengujian Sampel

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 17 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.4

Data Pengamatan Data yang diambil untuk mendapatkan kurva pertumbuhan mikroba dan kurva konsentrasi glukosa setiap waktu adalah: 1. Absorbansi / % transmitan suspensi ragi [sel] (g/mL) Agitasi (rpm)

t (jam)

%trans.

Absorbansi

log [sel]

pH

Aerasi

2. Absorbansi / % transmitan larutan glukosa t (jam) %trans. Absorbansi [gluksosal] log (g/mL) [glukosa] Agitasi (rpm) pH Aerasi

V.5 Data Literatur Data literatur yang dibutuhkan untuk praktikum Modul teknik fermentasi antara lain: 1. 2. V.6 Kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi sel kering (mg/mL) Kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi glukosa (mg/mL)

Langkah Perhitungan Baku Absorbansi terhadap Konsentrasi Glukosa Sebagai contoh berikut adalah data berat sel kering terhdap absorbansi pada panjang gelombang 600 nm
Berat sel kering (mg/mL) 0.4 1.09 1.81 2.5 3.72 5.31 5.89 6.9 7.79 8.48 Absorbansi 0.06 0.18 0.28 0.39 0.57 0.83 0.92 1.08 1.21 1.34

V.6.1 Pembuatan Kurva Baku Absorbansi terhadap Konsentrasi Sel dan Kurva

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 18 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Pengaluran data absorbansi terhadap berat sel kering tersebut ditunjukkan pada grafik berikut.
Kurva Baku Konsentrasi Sel
9 8 Konsentrasi Sel (mg/mL) 7 6 5 4 3 2 1 0 0 0.5 Absorbansi 1 1.5 y = 6.379x + 0.013 R2 = 0.9997

Dari grafik tersebut terlihat bahwa hubungan antara absorbansi dan konsentrasi sel kering cenderung linear mengikuti persamaan: Konsentrasi sel kering = 6.379 Absorbansi + 0.013 Misalkan data hubungan absorbansi terhadap konsentrasi glukosa adalah:
Konsentrasi glukosa (mg/mL) 0 20 40 60 80 100 120 140 Absorbansi 0 0.198 0.403 0.595 0.8 1 1.213 1.403

Maka kurva baku bsorbansi terhadap konsentrasi glukosa adalah:

Kurva Baku Konsentrasi Glukosa
160 Konsentrasi Glukosa (mg/mL) 140 120 100 80 60 40 20 0 0 0.5 Absorbansi 1 1.5 y = 99.447x + 0.2381 R2 = 0.9999

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 19 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.6.2

Perhitungan Absorbansi Perhitungan ini dilakukan jika yang terbaca pada spektrofotometer adalah % transmitan. Persamaan yang dipakai: A = - log T

V.6.3

Penentuan Konsentrasi Sel Persamaan yang dipakai: C = Faktor Kalibrasi . Absorbansi

V.6.4

Penentuan Konsentrasi Glukosa Persamaan yang dipakai ;C = Faktor Kalibrasi . Faktor Pengenceran. Absorbansi

V.6.5

Contoh Perhitungan Misalkan setalah 3 jam fermnetasi didapat data: Maka: Absorbansi suspensi sel = -log 0.644 = 0.1911 Konsentrasi suspensi sel berdasarkan kurva baku tersebut adalah: 6.379.0.1911+0.013 = 1.221 mg/mL Absorbansi larutan glukosa = -log 0.594 = 0.2262 Konsentrasi larutan glukosa berdasarkan kurva baku diatas dan sebelum diencerkan adalah: 250.(99.447.0.2262+0.2381)=5.6325 mg/mL % transmitan suspensi sel adalah 64.4, tanpa pengenceran % transmitan larutan glukosa adalah 59.4 setelah pengenceran 250 kali.

V.6.6

Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel dan Kurva Konsentrasi Glukosa Tiap Saat Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan mengalukan data waktu (jam) di sumbu x terhadap konsentrasi suspensi sel (mg/mL) pada sumbu y. Sedangkan Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan mengalukan data waktu (jam) di sumbu x terhadap konsentrasi larutan glukosa (mg/mL) pada sumbu y.

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 20 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Misalkan diperoleh data fermentasi berikut:

t (jam) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 %trans. 99 76 66 61 57 54 47 41 33 26 21 18 16 15 15 Absorbansi 0.0043648 0.1191864 0.1804561 0.2146702 0.2441251 0.2676062 0.3279021 0.3872161 0.4814861 0.5850267 0.6777807 0.7447275 0.79588 0.8239087 0.8239087 [sel] mg/mL 0.0408431 0.7732901 1.1641292 1.382381 1.5702743 1.7200602 2.1046878 2.4830518 3.0843996 3.744885 4.3365631 4.7636167 5.0899186 5.2687139 5.2687139 log [Sel] -1.388881 -0.1116576 0.0660012 0.1406278 0.1959755 0.2355436 0.3231877 0.3949858 0.4891706 0.5734385 0.6371457 0.6779368 0.7067108 0.7217046 0.7217046 pH 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4 4 4 4 4 4 4 4 Aerasi 9 7 9 9 6.5 9 7.5 7 8.5 8 6.5 7 8 8 6.5 Agitasi (rpm) 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600

Maka Kurva Pertumbuhan Biomassa Sel adalah:

Kurva Pertum buhan Sel 6

Konsentrasi Sel (mg/mL)

0 0 2 4 6 8 Waktu (jam ) 10 12 14 16

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 21 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Dan berikutnya adalah hasil pengujian konsentrasi glukosa yang tertinggal dalam medium dan yang terkonsumsi.
t (jam) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 %trans. 30 32 35 36 38 40 42 44 45 55 56 60 64 78 98 Absorbansi 0.5228787 0.49485 0.455932 0.4436975 0.4202164 0.39794 0.3767507 0.3565473 0.3467875 0.2596373 0.251812 0.2218487 0.19382 0.1079054 0.0087739 Pengencaran 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 [glukosa] residu mg/mL 0.1044736 0.0988989 0.0911583 0.088725 0.0840547 0.0796241 0.0754097 0.0713913 0.0694502 0.0521165 0.0505601 0.0446006 0.0390258 0.0219379 0.0022213 [glukosa] konsumsi mg/mL 0 0.0055747 0.0133153 0.0157487 0.0204189 0.0248496 0.029064 0.0330823 0.0350235 0.0523571 0.0539136 0.0598731 0.0654478 0.0825357 0.1022524 log [glukosa] residu mg/mL -0.9810 -1.0048 -1.0402 -1.0520 -1.0754 -1.0990 -1.1226 -1.1464 -1.1583 -1.2830 -1.2962 -1.3507 -1.4086 -1.6588 -2.6534 log [glukosa] kopsumsi mg/mL -2.2538 -1.8756 -1.8028 -1.6900 -1.6047 -1.5366 -1.4804 -1.4556 -1.2810 -1.2683 -1.2228 -1.1841 -1.0834 -0.9903

Dan kurva Konsentrasi Glukosa (Residu dan Konsumsi) adalah:

Konsentrasi Residu dan Konsum si Glukosa 0.12

0.1 Konsentrasi Glukosa (mg/mL)

0.08

0.06

0.04

0.02

0 0 2 4 6 8 Waktu (jam ) 10 12 14 16

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 22 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

V.6.7 Penentuan Growth Yield Persamaan yang digunakan:

Y=-

X X X 0 = S S0 S

Dari hasil percobaan diperoleh konsumsi total glukosa selama fermentasi adalah: 10 mg/L (500*0.0022 mg/L) = 8.9 mg/mL Sedangkan pertumbuhan total sel ragi adalah: 5.2687 mg/mL 0.0408 mg/mL = 5.228 mg/mL Maka yield pertumbuhan proses fermentasi ini adalah:

Y=-

5.228 = 0.587 8.9

V.6.8 Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum Persamaan yang digunakan:

maks =

lnX awal - lnX akhir t fasa logaritmik

Pada kurva logaritmik pertumbuhan sel berikut ini terlihat bahwa fasa logaritmik berlangsung pada jam ke-4 sapai jam ke-11. Saat itu ln X4 = 0.1959 dan ln X11 = 0.6779.
Kurva Pertum buhan Sel 1

0.5

Log Konsentrasi Sel

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

-0.5

-1

-1.5 Waktu (jam )

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 23 dar 24

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II Departemen Teknik Kimia ITB

Maka dapat diperkirakan:

maks =

0.6779 - 0.1959 = 0.069 sel/jam 7

Daftar Pustaka 1. Bailey, J.E., and Ollis, D.F., Biochemical Enginering Fundamentals, McGraw-Hill Kogakusha Ltd., Tokyo, 1987 2. Soeryo, W, Kinetika Pertumbuhan Mikroba.

Modul 1.07 Teknik Fermentasi

Halaman 24 dar 24