Materi Asistensi Biomedik FK Uns2009

Materi Asistensi Biomedik FK UNS 2009-Afiono Agung Prasetyo
BAB I EKSTRAKSI ASAM NUKLEAT
A. Pendahuluan Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. Protokol ekstraksi atau isolasi asam nukleat biasanya melibatkan proses fisik dan kimia. Proses tersebut biasanya dimulai dengan homogenisasi jaringan untuk meningkatkan jumlah sel atau permukaan area yang akan dilisiskan. Homogenisasi jaringan sangat berguna untuk mengekstrak asam nukleat dari organ atau jaringan. Langkah selanjutnya biasanya adalah permeabilisasi sel target. Permeabilisasi sel dapat dilakukan dengan menggunakan detergen nonionik (sehingga tidak mengikat asam nukleat) seperti T een, !"! ( Sodium Dodecyl Sulfate), #onidet, Laureth dan Triton. $ntuk melepaskan asam nukleat di dalamnya sel perlu dilisiskan terlebih dahulu (biasanya menggunakan bufer hipotonik). Langkah selanjutnya berupa degradasi dan presipitasi protein (dengan pemanasan, en%ime proteinase atau dengan menggunakan garam chaotropic). &sam nukleat yang diperoleh dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam 'olume yang lebih ke(il. Presipitat yang sering digunakan adalah isopropanol, etanol, dan PE) (polyethylene glycol). !etelah dilakukan pen(u(ian, langkah
terakhir adalah solubilisasi asam nukleat. *etode yang paling dikenal untuk ekstraksi+isolasi asam nukleat adalah metode fenol+khloroform+isoamilalkohol. *etode ini sangat bermanfaat untuk aplikasi P,- karena dapat membantu menghilangkan penghambat P,- yang terdapat pada larutan ekstrak. *etode ini akan menghasilkan lapisan air yang mengandung asam nukleat, lapisan antara fenol dan air yang berisi protein penghambat yang mengalami presipitasi dan polimer (termasuk karbohidrat), dan lapisan khloroform-isoamilalkohol yang mengikat lemak. !etelah ektraksi fenol ini, lapisan air dipindahkan ke tabung mikrosentrifus steril dan asam nukleat dipresipitasi dengan menambahkan . * !odium asetat pH /,0 yang diikuti dengan pen(u(ian menggunakan etanol 1223 dilanjutkan dengan etanol 423 untuk membuang sisa fenol dan garam. *eskipun sangat murah dan relatif mudah, yang perlu diingat adalah phenol+khloroform+isoamilalkohol sangat toksik dan limbahnya perlu perlakukan khusus sebelum dibuang.
B. Ekstraksi DNA !aat ini kita dapat menemukan berbagai ma(am metode ektraksi "#&. Para peneliti selalu berusaha menyederhanakan tahapan yang digunakan atau mengurangi jumlah perlakukan. Tahapan atau perlakuan yang terlalu panjang dan terlalu kompleks sering meningkatkan resiko kegagalan, terutama bagi pemula. Tahapan atau perlakuan dalam ekstraksi "#& juga dipengaruhi asal sel+jaringan target. Pada modul praktikum ini akan dibahas prinsip dasar ekstraksi "#& se(ara umum.
"#& biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan metode yang melisiskan sel tetapi men(egah fragmentasi "#&. Langkah ini biasanya melibatkan E"T& (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh en%im "#ase). 5dealnya dinding sel (jika ada) didigesti se(ara en%imatis (misalnya dengan en%im lisosim). !elanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. 6ika disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya dilakukan seminim mungkin. "alam proses disrupsi ini en%im nuklease yang terlepas dari komponen selular dapat men(erna asam nukleat se(ara efisien, sehingga kerja en%im nuklease harus dihambat. "isrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada suhu 7 2,, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah diauto(la'e (fungsi auto(la'e adalah untuk menghan(urkan akti'itas "#ase pada alat atau larutan tersebut). !etelah melepaskan asam nukleat dari sel, -#& dapat dihilangkan dengan penambahan -#ase yang telah diterapi panas untuk menginakti'asi "#ase kontaminan (-#ase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika didinginkan). 8ontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan dengan larutan fenol atau (ampuran fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). !etelah (ampuran tersebut dibuat menjadi emulsi, dilakukan pemusingan. !etelah pemusingan akan terbentuk bagian organik di bagian ba ah dan bagian a9ueous di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi. ,airan a9ueous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi
material yang terlihat pada lapisan tengah. 8emudian "#& yang sudah tidak mengandung protein ini di(ampur dengan dua bagian etanol. "#& akan menjadi presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut. !etelah dipusingkan, pelet "#& kemudian dilarutkan kembali. !e(ara umum mekanisme isolasi total "#& seluler se(ara kon'ensional adalah sebagai berikut: 1. homogenisasi sel+jaringan (dalam suhu 7 2,, semua bahan dan peralatan steril) 0. lisis seluler (dengan detergen atau lisosim) .. penambahan chelating agents: E"T&+sitrat 7. penambahan proteinase (proteinase 8) /. ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform) ;. presipitasi alkohol (423 atau 1223 etanol) 4. pelarutan kembali "#&, misalnya dengan bufer TE (Tris-E"T&) <eberapa senya a mempunyai fungsi multipel dalam protokol ekstraksi asam nukleat. &gen chaotropic seperti )u!,# (guanidine isothiocyanate), #a5 (sodium iodide), dan Li,l (lithium chloride) memiliki kemampuan untuk menghan(urkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein dan menginakti'asi nuklease. )u!,# dengan molaritas di atas 7 * dapat mempresipitasi "#& dan -#& berberat molekular tinggi. "alam lingkungan yang tinggi garam chaotropic ini senya a silika dapat berikatan se(ara spesifik dengan molekul "#& dan -#&, sedangkan lemak dan protein kontaminan hanya mempunyai afinitas yang moderat terhadap silika sehingga dapat di(u(i bersih darinya. &bsorbsi asam nukleat pada matriks silika meningkat pada pH asam dan konsentrasi garam yang tinggi, sehingga larutan bufer yang mengandung pH yang
tinggi dan konsentrasi garam yang rendah dapat digunakan untuk men(u(ilepaskan asam nukleat dari matriks silika. ,ara lain pemanfaatan silika dalam proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan melakukan perubahan kimia pada matriks silika sehingga akan se(ara spesifik berikatan dengan protein atau polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan sebelumnya). Ekstraksi asam nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar metode ekstraksi asam nukleat kit komersial. *atriks silika dalam kit komersial tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti filter (spin column), gel (glassmilk, silica gel), suspensi (celite, plain-coarse silicate), bahkan partikel berselubung magnetik (Dynabeads). =iltrasi, sentrifugasi, atau penggunaan magnet memungkinkan pemisahan asam nukleat yang berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan protein melalui langkah pembilasan yang multipel. *etode ini juga mendasari pembuatan alat ekstraksi asam nukleat. *etode alternatif yang berbasis matriks silika antara lain teknik hibridisasi fragmen asam nukleat yang menggunakan probe yang didesain spesifik yang melekat pada matriks solid atau bead magnetik. 8elemahan umum dari teknik penangkapan seperti ini adalah selama proses pelekatan dan (u(i-lepas, dapat terjadi fragmentasi dan hilangnya "#& target. "#& juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel 'irus. $ntuk ekstraksi "#& sema(am ini sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau 'irus tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi "#&-nya karena isolasi "#& target dari (ampuran "#& ("#& total) relatif sulit. 6ika dibutuhkan isolat "#& dengan kemurnian yang tinggi, "#& dapat dimurnikan dengan density gradient centrifugation menggunakan ,s,l (Caesium chloride).
$ntuk memeriksa integritas "#& dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose. !e(ara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat "#& kita. ,ara yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian "#& yang diperoleh adalah dengan menggunakan spektrofotometer $>. "#& untai tunggal mempunyai koefisien absorbsi 2,204, "#& untai ganda 2,20 dan -#& 2,20/ g per-ml per-(m pada panjang gelombang 0;2 nm. -asio absorbsi 0;2+0?2 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein atau fenol (protein memiliki absorbsi maksimum pada 0?2 nm). !ampel "#& yang murni memiliki rasio 0;2+0?2 nm sebesar 1,?-1,@, sedangkan sampel -#& yang murni 1,@-0,2. 6ika rasio tersebut di ba ah 1,? berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. !aat ini sudah banyak dijual alat spektrofotometer otomatik yang se(ara otomatis mengkalkulasi rasio 0;2+0?2 nm dan kuantitas asam nukleat. Aang perlu diingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan larutan BblankC sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel. Aang digunakan sebagai BblankC adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa.
C. Ekstraksi RNA *etode untuk ekstraksi -#& mirip dengan metode ekstraksi "#&. #amun, molekul -#& relatif pendek dan lebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. *eskipun begitu,
-#& sangat mudah didigesti oleh -#ase yang terdapat endogen dengan konsentrasi yang ber'ariasi di dalam sel dan di eksogen di jari. !ehingga, untuk ektraksi -#& harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi -#ase yang ada. Proses deproteinisasi harus dilakukan se(ara lebih agresif karena -#& sering berikatan kuat dengan protein. Penambahan "#ase dapat digunakan untuk menghilangkan "#&. -#& kemudian dipresipitasi dengan etanol. -eagen yang sering digunakan untuk ekstraksi -#& adalah guanidinium thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat -#ase dan merupakan denaturan protein. 5ntegritas -#& dapat di(ek dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. !pesies -#& yang terbanyak (molekul r-#&) berukuran 0.! dan 1;! untuk prokariot dan 1?! dan 0?! untuk eukariot. -#& tersebut akan tampak sebagai pita yang diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan komponen -#& lainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam keadaan denaturasi untuk men(egah terjadinya formasi struktur sekunder pada -#&. -#& sangat sensitif terhadap nuklease. !emua basa -#& memiliki grup 0hidroksil reaktif sehingga mudah terjadi reaksi kimia yang menghasilkan air dan merusakkan rantai gulanya. Aang perlu diingat, nuklease (-#ase) relatif stabil di lingkungan dan bahkan kadang masih dapat bertahan setelah proses denaturasi panas dan ekstraksi fenol. &kti'itas nuklease selama proses ekstraksi asam nukleat dapat dikurangi dengan (ara: *empertahankan suhu inkubasi dan sentrifugasi di ba ah suhu optimum
nuklease (.4 2,), misalnya dengan mempertahankan larutan ekstrak pada suhu es atau 7 2,. *enginakti'asi nuklease pada permukaan gelas, air dan bahan habis pakai dengan bahan kimia seperti "EP, (diethylpyrocarbonate). 5nakti'asi dan atau penghambatan se(ara kimia i, misalnya dengan fenol atau garam guanidinium. Penghilangan ion logam ko-faktor untuk nuklease dengan chelating agent. $ntuk mengisolasi m-#& eukariotik (yang hanya 0-/3 dari -#& selular) dari (ampuran molekular -#& total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Pada konsentrasi garam yang tinggi, m-#& yang mengandung ekor poli(&) akan berikatan dengan molekul oligo(dT) komplementer pada kolumn afinitas, sehingga m-#& tetap tertinggal, sedangkan molekul -#& lainnya dapat di(u(i bersih dari kolumn menggunakan larutan tinggi garam. !elanjutnya, m-#& yang terikat tadi dapat dilarutkan dengan garam berkonsentrasi rendah.
D. Penyim anan Asam Nukleat Penyimpanan larutan "#& atau -#& sering problematik. 6ika ingin disimpan dalam aktu lama larutan "#& dapat disimpan dalam bentuk ali9uot
dalam -02 2, atau -42 2, untuk menghindari kerusakan karena pengulangan freeze-thawing. $ntuk pemakaian Bsehari-hariC "#& dapat disimpan dalam 7 2, untuk beberapa bulan. Hanya saja, jika "#& dilarutkan dalam air, kualitas "#& tersebut dapat memburuk jika disimpan dalam 7 2, ("#& akan bersifat asam lemah dalam air). $ntuk mengatasinya, "#& dapat dilarutkan dalam bufer TE
(Tris-E"T&). !ayangnya, E"T& merupakan chelating agent yang dapat mengikat ion *g sehingga dapat menjadi masalah jika digunakan untuk pemeriksaan P,-. Tris tidak memiliki efek penghambatan terhadap akti'itas Ta9 polimerase, hanya saja kesuksesan dan reproduksibilitasnya sering bergantung pada pH reaksi (ampuran P,-. Larutan -#& juga dapat disimpan dalam bentuk ali9uot dalam -02 2, atau -42 2,. $ntuk penyimpanan dalam aktu lama -#& sebaiknya
disimpan dalam suhu -42 2, atau jika memungkinkan dalam nitrogen (air (-1@;
2
,).
Ekstraksi DNA dari Darah Met!de Ka"asaki untuk A likasi PCR Rea#en$ 1) Proteinase 8 (02 mg+ml dalam 12 m* Tris-,l pH 4,/) 0) <ufer TE: - 12 m* Tris-,l - 1 m* E"T& (pH 4,/ atau ?,2) .) <ufer P,-: - /2 m* 8,l - 12-02 m* Tris-,l - 0,/ m* *g,l0 (pH ?,.) 7) <ufer 8: - <ufer P,- T een 02 2,/3 - 122 g+ml Proteinase 8 Pr!sedur$ 1. ,ampur /2 l darah utuh dengan 2,/ ml bufer TE dalam tabung mikrosentrifus. 0. !entrifus 12 detik dengan ke(epatan 1..222 D g. .. <uang supernatan, resuspen pelet dengan 2,/ ml buffer TE, sentrifus 12 detik 1.,222 D g. 7. $langi langkah no-. dua kali. /. -esuspen pelet terakhir dalam 122 l <ufer 8, inkubasi 7/ menit pada /; 2, (atau semalaman jika memungkinkan). ;. 5nkubasi 12 menit @/ 2,. 4. "#& siap dipakai untuk P,-.
BAB II PCR %POLYMERASE CHAIN REACTION&
A. Prinsi Dasar PCR P,- merupakan teknik amplifikasi "#& selektif in vitro yang meniru fenomena replikasi "#& in vivo. 8omponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal "#& sebagai (etakan, primer (sekuens oligonukleotida yang mengkomplementeri akhiran sekuens (etakan "#& yang sudah ditentukan), d#TPs (deoxynucleotide triphosphates), dan en%im polimerase "#&. 1. "#& $ntuk aplikasi P,-, kemurnian "#& mempengaruhi hasil. "#& yang tidak murni sering menyebabkan masalah reproduksibilitas. $ntuk tujuan diagnosis "#& (atau -#&) harus dimurnikan dahulu sebelum diproses dengan P,-. "alam proses isolasi tersebut "#& yang dihasilkan sebaiknya bebas nuklease, endo-atau eksoprotease, dan DNA-binding protein. 8husus untuk -#&, karena -#& tidak dapat digunakan sebagai (etakan langsung untuk P,-, maka diperlukan tahapan transkripsi balik untuk membuat m-#& menjadi "#& komplementernya (("#&) yang kemudian dapat digunakan sebagai (etakan untuk P,-. Teknik ini disebut dengan -T-P,- (reverse transcription- C! atau P,- transkripsi balik). 0. Primer Primer P,- adalah komponen yang sangat menentukan keberhasilan P,-. !angat penting untuk mendesain sepasang primer yang Bbaik-efektif-efisienC. &da beberapa program untuk mendesain primer P,- yang dapat digunakan
se(ara gratis, seperti *E"$!&, Primer., PrimerEuest, dan lain-lain. Penggunaan program sema(am ini sangat disarankan untuk mendesain protokol P,- baru. *eskipun begitu, kita juga dapat mendesain primer P,se(ara manual berbekal beberapa aturan dasar. 8elebihan dari desain primer se(ara manual adalah kita dapat mendesain primer P,- yang efektif dengan karakteristik yang mungkin Ftidak diijinkanF oleh program yang ada. &turan dasar tersebut adalah sebagai berikut: Panjang primer sebaiknya antara 1?-.2 nukleotida (ke(uali untuk tujuan tertentu). !ekuens dalam primer sebaiknya tidak mengandung daerah
komplementari internal. !ebaiknya dalam sepasang primer tidak ada daerah yang saling berkomplementari. "alam primer tidak ada struktur sekunder. *emiliki kandungan ), (guanosine dan cytosine) /23. Hindari ketidakseimbangan distribusi daerah kaya )+, dan &+T. $ntuk P,- diagnostik pilih primer P,- yang mengamplifikasi daerah yang stabil se(ara genetik. Perbedaan suhu anealing dalam suatu pasangan primer jangan lebih dari / 2,. P,- dapat digunakan untuk berbagai ma(am aplikasi. &plikasi yang berbasis P,- biasanya membutuhkan primer P,- yang telah dimodifikasi. &da berbagai ma(am modifikasi primer P,- yang mungkin kita lakukan, namun pada prinsipnya adalah:
a. *odifikasi /Gend Penambahan tempat restriksi (sekuens yang dapat dikenali oleh en%im restriksi endonuklease) Penambahan sekuens pengatur Penambahan Promotor dan -<! (ribosomal binding sites) Penambahan label Penambahan "C-clamp
b. Degenerate primer Site directed mutagenesis "HP (degenerate oligonucleotide primer) P,Translasi sekuens asam amino ke dalam sekuens genomik Primer uni'ersal Primer kompetitor
(. #iscellaneous Primer sekuens berulang Primer concatemeric Primer P,- multipleks *egaprimer #olecular beacon
.. d#TPs (Deoxynucleotide triphosphates) d#TP! merupakan blok pembangun molekul asam nukleat yang terdiri dari deoxyadenosine triphosphate (d&TP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxycytosine triphosphate (d,TP), dan deoxyguanosine triphosphate (d)TP). "alam beberapa aplikasi dan protokol P,-, salah satu dari empat d#TP tersebut dapat diganti elemen analog. *odifikasi ini berguna untuk
aplikasi yang berbasis paska-P,-. 7. Polimerase "#& 8etika terjadi sintesis "#&, en%im polimerase "#& akan melakukan seleksi nukleotida yang tepat untuk ditambahkan ke primer untuk melanjutkan rantai "#& sesuai dengan aturan pasangan basa Iatson-,ri(k (&:T dan ):,). Polimerase "#& selalu mengkatalis sintesis "#& dalam orientasi /G ke .G. <eberapa polimerase "#& juga memiliki akti'itas eksonuklease atau yang sering disebut dengan akti'itas FproofreadingF yang akan memeriksa basa yang telah ditambahkan untuk menumbuhkan untai "#&. 8etika terjadi penambahan nukleotida yang tidak tepat akti'itas proofreading tersebut akan membuang basa yang tidak tepat tersebut. *ekanisme koreksi ini akan meningkatkan akurasi atau atau yang disebut juga dengan fidelitas. 8etika membandingkan atau memilih polimerase "#&, ada dua hal yang penting dalam P,- yaitu fidelitasnya dan efisiensi sintesisnya. *a(am-ma(am polymerase lainnya yang saat ini ada di pasaran: &mpliTa9, !toffel, &mpliterm, Pyra, $$% @7, $fl, $fu, "eep >ent, >ent, $li, Proofstart, &' @0, fx, wo, $L $ma, dan Thermal &(e. "ari en%im polimerase tersebut yang memiliki akti'itas /J-.J proofreading adalah: &mpliTa9, $$% @7, dan $fl. Aang memiliki akti'itas .J-/J proofreading adalah: $fu, "eep >ent, >ent, $li, Proofstart, &' @0, fx, wo, dan Thermal &(e. /. <ufer reaksi P,<ufer reaksi P,- biasanya mengandung *g0K, kation mono'alen, dan beberapa co-solvent. Co-solvent membantu menstabilisasi en%im polimerase "#&, mempengaruhi kerja en%im, dan atau DNA melting temperature (Tm).
5on *ono'alen seperti #aK, 8K dan #H7K menstimulasi akti'itas polimerase "#& dan melindungi muatan negatif gugus fosfat "#&, sehingga melemahkan kekuatan elektronik yang saling menolak antara primer dan "#& target. 5on *g0K berperan sebagai ko-faktor akti'itas polimerase "#& thermostabil. !e(ara umum konsentrasi ion *g0K yang sering digunakan adalah 0,/ m* (antara 2,/-/ m*). Aang perlu diingat, konsentrasi ion magnesium yang berlebihan menghambat reaksi amplifikasi P,-.
B. Reaksi PCR Pada prinsipnya, reaksi P,- (protokol P,- kon'ensional) membutuhkan tiga tahap: 1. "enaturasi (*elting) Prinsipnya adalah memisahkan "#& untai ganda menjadi komponen untai tunggal, sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi primer P,- untai tunggal pada sekuens targetnya (jika ada). 0. Annealing (Hibridisasi) Primer P,Pada tahap ini terjadi hibridisasi primer P,- pada sekuens targetnya. !e(ara umum suhu annealing P,- biasanya berasal dari suhu annealing primer hasil kalkulasi matematis dikurangi / derajat ,el(ius, dengan kata lain primer dapat berikatan dengan target komplementarinya dan jika sudah terhibridisasi tidak mudah mengalami disosiasi. Iaktu yang dibutuhkan biasanya 1/-;2 detik. .. Elongasi (ekstensi rantai "#&) Tahap ini penting untuk mengamplifikasi daerah yang sudah dihibridisasi
oleh primer, dari /Gend ke .Gend. !ebagian besar en%ym polimerase membutuhkan suhu elongasi 40 2,. !e(ara umum suhu elongasi sebaiknya /
2
, di ba ah suhu melting seluruh amplimer. Hal lain yang perlu aktu inkubasi,
dipertimbangkan dalam menentukan langkah elongasi adalah
yaitu sebaiknya (ukup panjang bagi polimerase "#& mengamplifikasi sekuens target se(ara komplit tetapi (ukup pendek untuk men(egah amplifikasi produk non-spesifik yang lebih panjang daripada sekuens target. !e(ara detail, protokol suatu P,- tergantung dari tujuan, en%im polimerase, primer, bahkan kit yang digunakan. <erdasarkan proses kinetik yang terjadi, reaksi P,- dapat dibagi menjadi . fase kinetik: 1. =ase & al 0. =ase Eksponensial .. =ase Plateau
C. Analisis dan 'isualisasi Pr!duk PCR &nalisis produk P,- dapat dilakukan se(ara ex-vitro (dilakukan di luar tabung P,-, misalnya: elektroforesis gel, hibridisasi "#&) maupun in-vitro (dalam tabung P,- dan selama reaksi P,- berlangsung). 8edua teknik tersebut membutuhkan produk P,- yang telah di-F'isualisasiF-kan sebelum dianalisis. >isualisasi produk amplifikasi P,-: 1. menge(at "#& untai ganda dengan bahan pe arna kimia atau ion perak yang berinterkalasi di antara untai ganda "#& 0. labelisasi primer P,- atau nukleotida d#TP dengan bahan pe arna fluoresen
(fluorophore) atau hapten sebelum amplifikasi P,-
D. P!siti( Palsu dan Ne#ati( Palsu 1. Positif Palsu Penyebab tersering hasil P,- yang positif palsu: Primer yang digunakan tidak (ukup selektif. !uhu annealing primer terlalu rendah. Terlalu banyak siklus P,-.
0. #egatif Palsu Hasil negatif palsu terjadi jika kontrol positif atau sampel yang telah diketahui mengandung molekul target P,- spesifik ternyata memberikan hasil pemeriksaan yang negatif. Penyebab tersering hasil P,- yang negati'e palsud: 6umlah "#& target dalam sampel di ba ah ambang batas deteksi. Terdapat faktor yang mendenaturasi atau menghambat kerja Ta9 polimerase. pH dan atau sistem bufer yang tidak tepat. Prosedur deteksi amplimer yang kurang sensitif. Problem pada elektroforesis gel. *utasi pada (etakan atau oligomer. "epurinasi. )angguan pada proses denaturasi "#& atau hibridisasi primer. Problem pada reaksi thermocycling. 8ehilangan asam nukleat pada proses ekstraksi asam nukleat. &sam nukleat tidak terkestrak.
!truktur sekunder pada asam nukleat target.
E. A likasi Medis PCR &plikasi medis P,- utama adalah deteksi patogen infeksius dan identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan faktor resiko penyakit. ,ontohnya, antara lain: "eteksi polimorfisme: -=LP (restriction fragment length polymorphisms), >#T- (variable number of tandem repeat se(uences), dan !T- (short tandem repeats) !kreening+deteksi mutasi berbasis P,P,- kuantitatif: dengan menggunakan kompetitor+mimic (internal exogenous standards), dengan housekeeping gene (internal endogenous standard), atau dengan -eal-Time P,-. >ariasi dan adaptasi protokol P,- kon'ensional: Labelisasi amplimer P,- untuk 'isualisasi produk P,-, pembuatan probe "#& dan kloning. P,dua langkah (denaturasi dan kombinasi annealing K
ekstensi+amplifikasi). P,- booster (untuk menghambat akumulasi amplimer non spesifik dan komplek primer dimer). P,- %ot-Start dan $ime-!elease (untuk mengurangi pembentukan amplimer non spesifik). )nverse P,- (untuk mengamplifikasi daerah yang belum diketahui sekuensnya yang terletak tepat di atas atau di ba ah daerah yang sudah
diketahui sekuensnya). P,- asimetrik (salah satu primer P,- mempunyai konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan primer pasangannya sehingga menghasilkan konsentrasi tinggi molekul "#& untai tunggal). !ekuensing "#& yang dimediasi P,-. P,- $ouchdown dan $ouch-'p (untuk sampel "#& komplek yang hanya mengandung sedikit molekul (etakan, P,- multiplek, amplifikasi selektif daerah target dimana satu atau lebih sekuens primer sangat mirip dengan sekuens lainnya yang terdapat dalam (etakan "#& yang digunakan, untuk protokol umum P,- dengan banyak pasangan primer P,-). P,- multiplek (menggunakan beberapa pasangan primer dalam (ampuran P,- yang sama untuk mengamplifikasi beberapa target yang berbeda pada aktu yang sama). P,- degenerasi (menggunakan (ampuran primer P,- yang didesain untuk mengamplifikasi sekuens target "#& genetik yang sama dimana diharapkan ada sejumlah ke(il perubahan nukleotida antara isolat atau indi'idual yang berbeda)+ P,- repeat dan inter-repeat. P,- repeat (untuk menentukan panjang daerah genetik yang mengandung sekuens pengulangan tandem. P,- inter-repeat dilakukan dengan teknik -&P" (random amplification of polymorphic DNA) atau arbitrary primed (&P-P,-) untuk mengetahui keberadaan daerah pengulangan sekuens genetik). &=LP-P,(amplification fragment length polymorphism) untuk
membedakan isolat atau spesies yang berbeda berdasarkan keberadaan daerah
en%im restriksi (polimorfisme daerah restriksi). <E!!-T-!(an (*ase +xcision Se(uence Scanning) untuk mendeteksi mutasi T+& atau &+T. ""--T-P,- (Differential Display -T-P,-) untuk mem'isualisasikan perbedaan ekspresi gen pada sel-sel yang berbeda tipenya atau sel-sel yang sama tipenya tapi mendapatkan perlakuan yang berbeda. rotein $runcation $est (PTT), untuk mendeteksi adanya mutasi pada "#& genomik yang menginduksi adanya stop (odon pada m-#&-nya. P,- untuk mendeteksi adanya metilasi "#&. *reakpoint translokasi). P,- mutagenesis (untuk mengintroduksi mutasi pada sekuens "#& yang telah diketahui). P,- untuk kloning. !&)E (Serial Analysis of "ene +xpression) P,- EL5!& Amplification refractory mutation system (&-*!) untuk mendeteksi point mutation melalui priming oligonukleotida kompetitif. P,- in situ P,(untuk mengamplifikasi daerah yang mengalami
). Pen*e#ahan Terhada K!ntaminasi P,- merupakan metode deteksi yang sangat sensitif. $ntuk mendapatkan hasil yang akurat dan reproduksibel, prinsip "ood ,aboratory dijalankan oleh mereka yang bergelut dengan teknik ini. ractice perlu
Pe(egahan terhadap kontaminasi dimulai dari masalah penataan ruang dan peralatan. *asing-masing alat sebaiknya diletakkan dalam ruangan yang terpisah sesuai dengan peruntukkannya. !ebaiknya, untuk menghindari terjadinya kontaminasi, semua langkah yang berhubungan dengan persiapan P,(pengolahan spesimen, persiapan reaksi P,-, dan sintesis primer) dilakukan di ruangan yang bertekanan positif untuk men(egah masuknya kontaminan dan aerosol. $ntuk tahapan P,- (thermocycling) dan elektroforesis gel untuk analisis produk P,- sebaiknya dilakukan di ruangan yang bertekanan negatif untuk men(egah keluarnya aerosol yang terkontaminasi produk P,- ke luar ruangan. $rutan perjalanan bahan dan personel yang melakukan teknik P,- harus dalam urutan yang semestinya dan tidak berulang. !ebagai (ontoh, setelah mempersiapkan reaksi P,- dilanjutkan dengan langkah memasukkan sampel, lalu melakukan P,-, dan terakhir elektroforesis. !pesimen klinis dan produk P,merupakan sumber kontaminasi utama sehingga T5"&8 <HLEH diba a kembali ke tempat reaksi P,-, begitu juga sebaliknya. 5dealnya, mereka yang bekerja di ruangan untuk elektroforesis tidak boleh bekerja di ruangan untuk persiapan P,(isolasi spesimen, pembuatan reaksi P,-) dalam hari yang sama karena mereka beresiko memba a kontaminan produk P,- pada baju-tangan-rambut, dll. #amun, untuk laboratorium yang sibuk, rekomendasi tersebut mungkin sulit diterapkan. Hleh karena itu, untuk membantu langkah pen(egahan, setiap ruangan yang digunakan untuk setiap tahap P,- sebaiknya memiliki pakaian dan sarung tangan tersendiri. Pakaian dan sarung tangan tersebut harus dipakai ketika bekerja di ruangan tersebut dan harus dilepas sebelum berpindah ke ruangan yang lain.
Pakaian laboratorium tersebut juga sebaiknya dilabel yang jelas, di(u(i bersih dan di-autoclave se(ara teratur, dan penggunaannya se(ara ketat dibatasi sesuai dengan ruangan dan personel yang bersangkutan. !ebagai langkah pen(egahan kontaminasi, semua tabung yang
mengandung spesimen klinis, reaksi P,-, primer, dan asam nukleat disentrifugasi dahulu sebelum dibuka untuk mengurangi kontaminasi aerosol ketika membuka tutupnya. !emua bahan yang digunakan (tabung mikrosentrifus, tip, bufer, larutan, dll) sebaiknya dalam keadaan steril (disterilisasi dahulu sebelum dipakai). 5dealnya permukaan meja laboratorium dibersihkan dengan 1 # H,l se(ara teratur atau menggunakan sinar-u' atau radiasi sinar gama selama satu malam untuk menghan(urkan aerosol kontaminan yang dihasilkan selama bekerja seharian. !umber kontaminasi terpenting pada laboratorium P,- adalah aerosol. !ayangnya, hampir semua tahapan dalam teknik biomol dapat menghasilkan produk aerosol. &erosol ini dapat bertahan di udara ruangan selama beberapa jam dan dapat menyebar apabila ada aliran udara yang masuk+keluar seperti ketika pintu laboratorium dibuka+ditutup. &erosol ini dapat menempel pada meja, baju, tangan, bahkan pada reaksi P,- yang sedang dibuat. 8ontaminan yang terdapat pada tangan+baju+rambut juga dapat mengkontaminasi reaksi P,- BsterilC. !umber kontaminan penting lainnya adalah debu. "ebu yang terkontaminasi plasmid, "#&, atau produk P,- ini dapat menyebar dengan mudah apabila "ood ,aboratory ractice tidak dijalankan dengan baik (misalnya, pakaian dan atau
sarung tangan yang digunakan ketika melakukan elektroforesis produk P,diba a ke ruangan lain).
Pembagian -uangan Laboratorium P,-: 1. -uangan B<ersihC Pembuatan reaksi P,- dilakukan di ruangan BbersihC. "i tempat ini hanya terdapat bufer dan en%im yang dibutuhkan untuk membuat larutan reaksi P,dan primer beserta bahan dan alat penunjangnya (tips, pipetman, dll). !pesimen, asam nukleat, produk P,-, plasmid dan semua alat+bahan yang berkaitan dengan yang disebutkan tersebut tidak boleh diba a masuk ke dalam ruangan ini. <egitu pula sebaliknya, semua alat+bahan di dalam ruangan bersih tidak boleh diba a keluar. 0. -uangan penerimaan sampel dan atau isolasi asam nukleat -uangan ini adalah ruangan bersih yang kedua, dimana plasmid dan produk P,- tidak boleh berada di dalam ruangan ini. .. -uangan P,-uangan ini adalah tempat alat P,- berada dan sebaiknya tidak ada manipulasi apapun terhadap sampel P,- di ruangan ini. 7. -uangan paska-P,"i ruangan ini dilakukan analisis produk P,- termasuk diantaranya elektroforesis gel. -uangan ini sangat beresiko tinggi terjadi kontaminasi aerosol dan atau debu.
BAB III ELEKTR+)+RESIS ,EL
A. Pendahuluan Elektroforesis adalah perpindahan molekul yang bermuatan sebagai respon terhadap medan listrik. &ngka perpindahan tergantung pada kekuatan medan listrik, muatan listrik, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan ionik, 'iskositas, dan suhu medium yang digunakan oleh molekul tersebut untuk berpindah. Elektroforesis merupakan alat analisis yang simpel, (epat, dan mempunyai sensiti'itas yang tinggi. Elektroforesis digunakan untuk mempelajari properti spesies bermuatan tunggal dan juga untuk teknik separasi. Elektroforesis sering digunakan untuk mengkarakterisasi massa molekular polinukleotida dan polipeptida, seperti kemurnian, heterogenisitas+adanya degradasi, dan komposisi subunit polinukleotida dan polipeptida. &da beberapa 'ariasi teknik elektroforesis. *asing-masing menghasilkan informasi yang berbeda-beda sehingga mempunyai kegunaan yang berbeda-beda pula. !e(ara umum, sampel akan dijalankan di suatu matriks+medium. *edium yang sering digunakan adalah agarose dan poliakrilamid, yang merupakan gel berpori, dan dalam kondisi tertentu dapat memisahkan molekul berdasarkan ukurannya.
B. Elektr!(!resis ,el DNA *aterial elektroforesis gel yang sering digunakan untuk "#& adalah
agarose
dan
akrilamid.
Elektroforesis
menggunakan
gel
agarose
atau
poliakrilamid merupakan metode standart untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen "#&. *etode paling mudah dan paling sering digunakan adalah dengan gel agarose horisontal. Teknik ini sangat sederhana, tidak memakan banyak aktu, dan dapat menghasilkan fragmen "#& yang tidak
dapat dipisahkan se(ara adekuat dengan prosedur lain seperti density gradient centrifugation. )el agarose dapat digunakan untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 122 bp (base pairs). $ntuk resolusi yang lebih tinggi atau untuk separasi yang lebih efektif dari molekul "#& yang lebih pendek sebaiknya menggunakan gel poliakrilamid. )el akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan fragmen "#& ke(il, biasanya berukuran kurang dari 122 bp. )el ini biasanya menggunakan akrilamid berkonsentrasi rendah (L;3) dan mengandung agen denaturing nonionik (urea ;*). &gen denaturing ini berperan untuk men(egah pembentukan formasi struktur sekunder oligonukleotida sehingga memungkinkan penentuan massa molekular yang akurat. "#& merupakan molekul yang bersifat asam, sehingga akan bergerak dari kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda). Pergerakan "#& di dalam gel tergantung pada berat+ukuran molekul "#&, bentuk konformasi "#&, konsentrasi agarosa, tegangan listrik yang digunakan dan kekuatan bufer elektroforesis. 6enis bufer yang digunakan untuk elektroforesis juga
mempengaruhi resolusi pemisahan "#&. <ufer T&E (Tris-&(etate-E"T&) akan menghasilkan resolusi yang lebih baik untuk fragmen "#& yang berukuran lebih
dari 7 kb, sedangkan bufer T<E (Tris-<orate-E"T&) akan menghasilkan resolusi yang lebih baik untuk fragmen "#& berukuran 2,1M. kb.
C. Elektr!(!resis ,el Pr!tein Elektroforesis gel untuk protein hampir selalu menggunakan poliakrilamid. Larutan akrilamid yang digunakan biasanya mengandung dua komponen, yaitu akrilamid dan bis-akrilamid. <is-akrilamid merupakan komponen cross-linking esensial dalam polimer akrilamid. 8onsentrasi akrilamid total dalam gel mempengaruhi migrasi protein. $ntuk memisahkan protein, metode yang sering digunakan adalah Sodium Dodecyl Sulphate olyacrylamide "el +lectrophoresis (!"!-P&)E) dan )soelectric &ocusing (5E=). !"!-P&)E memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya dan 5E= memisahkan molekul protein berdasarkan poin isoelektriknya. )el protein biasanya dibuat dalam terdenaturasi karena keberadaan !"! (sodium dodecyl sulfate). 8eberadaan !"! menyebabkan protein mengalami denaturasi oleh panas. !"! berikatan dengan protein melalui interaksi hidrofobik se(ara proporsional sesuai dengan ukuran protein. 8arena adanya muatan alami dari molekul !"!, maka protein bermigrasi dalam gel dengan ke(epatan yang proporsional dengan molekular massanya.
D. 'isualisasi DNA dan Pr!tein dalam ,el ,ara paling mudah untuk mem'isualisasi "#& dalam elektroforesis gel adalah dengan penge(atan menggunakan fluorescent intercalating dye seperti ethidium bromid (Et<r). Et<r akan mengikat "#& dengan (ara menginsersi
diantara stacked base-pairs, yang disebut dengan interkalasi, dan akan menghasilkan arna orange+merah fluoresen ketika diiluminasi dengan (ahaya
$>. Et<r biasanya disiapkan dalam larutan stok 12mg+ml dalam air, disimpan dalam suhu kamar dan terlindung dari sinar (ahaya. Et<r dapat dituangkan dalam gel ketika proses pembuatan dan running bufer, atau sebaliknya, gel direndam dalam larutan Et<r (2,/ g+ml) setelah elektroforesis selama .2 menit. Iarna di'isualisasikan dengan iradiasi $> (misalnya menggunakan transiluminator) dan difoto dengan film polaroid. 6ika diperlukan, "#& dalam gel dapat diisolasi dan digunakan untuk tujuan kloning. Aang perlu diperhatikan adalah karena Et<merupakan agen interkalasi, maka Et<r merupakan mutagen yang sangat kuatNNN &lternatif lainnya adalah dengan menggunakan !A<-)reen atau )elstar, yang mempunyai sensiti'itas yang sama, namun lebih aman untuk digunakan. $ntuk penge(atan protein yang sering dipakai adalah ,oomassie <rilliant <lue atau sering juga menggunakan teknik BPenge(atan PerakC. Elektroforesis gel untuk "#& dan protein menggunakan standar berat molekular untuk mengkalibrasi ukuran sampel yang dianalisis. !tandar berat molekular "#& mengandung (ampuran fragmen "#& yang sudah diketahui massa molekularnya. !edangkan marker untuk berat molekular protein biasanya terdiri dari (ampuran protein murni yang sudah diketahui massa molekularnya.
Elektr!(!resis ,el A#ar!se
Pem-uatan ,el A#ar!se &lat yang dibutuhkan: Submarine gel apparatus, termasuk di antaranya glass plate, comb, dan surround. Ethidium bromide 12 mg+mL atau !A<- )reen. &garose dalam T<E atau T&E. gel-loading buffer atau gel-loading dye.
Pr!sedur$ 1. $ntuk membuat 122 mL larutan agarose 2,?3, timbang 2,?gram agarose ke dalam glass beaker atau flask dan tambahkan 122 mL 1DT<E atau T&E. 0. ,airkan agarose dengan menggunakan microwave atau autoclave. .. *iD dengan magnetic stirrer dalam keadaan panas, dinginkan ke // 2, sebelum dituangkan. 7. ,ampur dengan Et<r sampai men(apai konsentrasi 2./ mg+ml dengan magnetic stirrer. /. Tuangkan ke dalam gel tray yang sudah dipasangi comb. ;. Tuangkan gel ke dalam tray, biarkan dalam suhu kamar selama 1/-02 menit sampai menjadi solid. 4. &mbil comb se(ara hati-hati, letakkan gel ke dalam electroforesis chamber, dan genangi (sampai (ukup tergenang) dengan bufer elektroforesis (gunakan bufer yang sama dengan yang digunakan untuk membuat agarose).
?. !iapkan 1 l ;D gel loading dye untuk setiap / l larutan "#&(atau -#&), (ampur dengan baik menggunakan pipet. Tuangkan (ampuran tersebut ke dalam sumur. @. Elektroforesis /2-1/2 >olt, sampai dye marker bermigrasi se(ukupnya, tergantung dari ukuran "#& yang akan di'isualisasikan. 6ika gel belum di(ampur dengan Et<r sebelum elektroforesis, genangi gel dengan Et<r 2,/ g+ml dalam bufer T&E atau T<E sampai "#& berikatan dengan (at arna tersebut dan dapat dilihat dengan menggunakan (ahaya $>.
Ba- ' Pen#enalan En.ym Restriksi
En%im restriksi atau disebut juga en%im endonuklease restriksi merupakan bagian dari sistem kekebalan bakteri untuk melindungi bakteri dari infeksi "#& asing. En%im endonuklease restriksi biasanya diberi nama berdasarkan nama bakteri asal en%im tersebut diisolasi. !aat ini telah dikenal lebih dari 022 en%im restriksi dengan sekuens tempat pembelahan yang spesifik. $ntuk mempermudah pemahamam tentang (ara kerja en%im restriksi akan digunakan (ontoh bakteri penghasil en%im E(o-5. E(o-5 merupakan en%im yang mengenali sekuens /G-)O&&TT,-.G. $ntuk melindungi "#& dalam selnya, bakteri penghasil E(o-5 tersebut menghasilkan en%im metilase. En%im metilase dalam bakteri tersebut akan memetilasi basa & kedua dalam urutan sekuens tersebut ()&ATT,). !e(ara garis besar en%im endonuklease restriksi bakteri akan mendigest pada atau di dekat tempat yang dikenali+dimetilasi oleh en%im metilase yang dihasilkan bakteri tersebut. "alam hal en%im E(o-5, en%im tersebut akan memisahkan ) dari & pada sekuens )&&TT,. #amun, pada bakteri penghasil E(o-5, karena basa & kedua pada sekuens )&&TT, tersebut telah dimetilasi, maka en%im E(o-5 T5"&8 &8&# mendigest "#& tersebut. "engan kata lain, pada bakteri penghasil en%im E(o-5, sekuens )&&TT,-nya akan mengalami metilasi pada basa adenin internalnya oleh en%im metilase E(o-5. En%im endonuklease E(o-5 dalam bakteri yang sama tidak akan mendigest "#& yang telah mengalami metilasi. "#& asing yang
belum mengalami metilasi pada sekuens )&&TT,-nya akan dikenali sebagai "#& asing dan akan didigest en%im endonuklease E(o-5, akibatnya "#& asing tersebut akan kehilangan fungsinya.Hleh karena itu, en%im metilase dan endonuklease berfungsi sebagai sistem imun untuk bakteri, melindungi bakteri tersebut dari "#& asing (misalnya 'irus). En%im seperti E(o-5 tersebut disebut en%im endonuklease restriksi karena me-restrict "#& dalam sel agar hanya "#& asli+miliknya saja yang boleh ada ("#& asing tidak boleh ada). 8egunaan suatu ensim endonuklease restriksi tergantung pada spesifisitas dan frekuensi terjadinya pengenalan tempat restriksi yang terdapat pada sampel "#& manapun. &lu5 mempunyai spesifisitas nukleotida sebanyak 7 nukleotida (&O),T), sehingga "#& apapun akan mengandung tempat yang dikenali &lu5 setiap 2,0/ kilobasa. !edangkan #ot5 mempunyai spesifisitas nukleotida sebanyak ? nukleotida (),O)),,),), sehingga "#& akan mengandung sekuens restriksi #ot5 setiap ;/,/ kilobasa. Hleh karena itu, #ot5 sangat berguna untuk mengisolasi daerah yang besar dari "#& terutama pada penelitian yang berhubungan dengan manipulasi "#& genomik. 8ebalikannya, &lu5 akan mendigest sampel "#& menjadi banyak fragmen-fragmen ke(il. )abungan dari kumpulan fragmen "#& hasil digesti suatu sampel "#& dengan satu atau lebih en%im restriksi dapat menjadi suatu sidik jari. "#& yang berbeda tidak akan menghasilkan kumpulan fragmen yang beraneka ukuran yang sama. Hleh karena itu, "#& dari berbagai sumber dapat di(o(okkan atau dibedakan berdasarkan kumpulan fragmen yang dihasilkan tersebut. Hal ini disebut -=LP (!estriction &ragment ,ength olymorphisms). &nalisis sederhana
ini sering digunakan untuk forensik. !elain untuk tujuan pembuatan sidik jari "#& seperti tersebut di atas, en%im endonuklease restriksi sering digunakan dalam proses kloning. Hidrolisis endonuklease merupakan reaksi yang spontan dan tidak membutuhkan &TP. <ufer reaksi untuk en%im endonuklease biasanya
mengandung 12 m* T-5! (dengan pH sekitar ?,2), garam magnesium (biasanya 12 m* *g,l0), suatu reducing agent (biasanya 1 m* dithiothreitol atau "TT), suatu protein karier pelindung (biasanya 122 g+ml bovine serum albumin atau <!&) dan garam (#a,l). Penentu terpenting dalam akti'itas suatu en%im endonuklease biasanya konsentrasi ionik dalam bufer (#a,l). Hleh karena itu, biasanya bufer untuk en%im restriksi biasanya dibagi menjadi low (02 m*), medium (122 m*), atau high (0/2 m*) berdasarkan konsentasi #a,l-nya. "igesti biasanya membutuhkan inkubasi 1-0 jam pada suhu .4 2,. #amun, pada keadaan tertentu dapat saja dibutuhkan masa inkubasi yang panjang (misalnya satu malam+10 jam). En%im endonuklease restriksi biasanya dijual dalam berbagai konsentrasi dengan akti'itas yang berdasarkan angka pendigestian sampel "#& standart. !atu unit akti'itas biasanya didefinisikan sebagai sejumlah en%im yang dibutuhkan untuk mendigest satu g "#& referensi dalam 1 jam pada suhu .4 derajat ,el(ius.
DA)TAR PUSTAKA <ro n, !.*., Hay, 6.)., Hstrer, H. 022@. Essentials of *edi(al )enomi(s. !e(ond ed. 6ohn Iiley P !ons, 5n(. #e 6ersey, $!&. ,orkill, )., -apley, -. 022?. The *anipulation of #u(lei( &(ids: <asi( Tools and Te(hni9ues. 5n: *ole(ular <iomethods Handbook !e(ond Edition. Ed: Ialker, 6.*., -apley, -. Humana Press, #6, $!&. Epplen, 6.E., and T. Lubjuhn. 1@@@. "#& profiling and "#& fingerprinting. <irhkhauser >erlag, <erlin. Harisha, !. 0224. <iote(hnology pro(edures and eDperiments handbook (&n introdu(tion to biote(hnology).5nfinity !(ien(e Press LL,. Hingham, *&. ,anada. *(Pherson, *.6., *oller, !.). 022;. P,-. !e(ond ed. Taylor P =ran(is )roup. *adison &'enue, #A, $!. Theophilus, <.".*. 022?. Prin(iples and *edi(al &ppli(ations of the Polymerase ,hain -ea(tion. 5n: *ole(ular <iomethods Handbook !e(ond Edition. Ed: Ialker, 6.*., -apley, -. Humana Press, #6, $!&. 'an Pelt->erkuil, E., 'an <elkum, &., Hays, 6.P. 022?. Prin(iples and te(hni(al aspe(ts of P,- amplifi(ation. !pringer !(ien(e K <usiness *edia <.>.

Materi Asistensi Biomedik FK Uns2009

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Materi Asistensi Biomedik FK Uns2009

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Materi Asistensi Biomedik FK UNS 2009-Afiono Agung Prasetyo

BAB I EKSTRAKSI ASAM NUKLEAT