Procedia Kimia 4 (2012) 208 - 215 1876-6196 2012 Diterbitkan oleh Elsevier Ltd

Hubungan Struktur-Properti di Polimer antimikroba Disintesis oleh Kemo-enzimatik Route

P. Dogra R. Dharela, G.S. Chauhana, R. Guptab, W. Azmib Departemen Kimia, Himachal Pradesh University, Shimla 171.005, HP, India Departemen Bioteknologi, Himachal Pradesh University, Shimla 171.005, HP, India Abstrak
Polimer Anti-mikroba merupakan kelas penting dari bahan yang menangkap perhatian dari para peneliti di seluruh dunia dalam pandangan peningkatan cepat dalam resistensi terhadap antibiotik oleh mikroba. Faktor-faktor seperti berat molekul polimer, sifat hidrofobik atau panjang rantai samping, dan sifat kation dan anion terutama mempengaruhi mereka khasiat. Hubungan struktur-properti pada polimer juga mempengaruhi aktivitas mereka, dan laporan kerja saat sintesis serangkaian kelas baru polimer anti-mikroba dengan chemoenzymatic rute awalnya menggunakan lipase sebagai biokatalis. Liontin nitro kelompok monomer dikurangi menjadi gugus amino dan monomer itu kemudian dipolimerisasi dan kelompok amino quaternized menggunakan bromida alkil yang berbeda. Bromida anion counter pada polimer ditukar dengan OH-, CF3COO-, Cl-atau HSCH2COO-Untuk menghasilkan serangkaian baru polimer. Sifat-sifat polimer disintesis dikarakterisasi dengan XRD, SEM, FT-IR dan spektroskopi NMR. Aktivitas anti-mikroba dari polimer baru juga diselidiki terhadap bakteri gram (-) bakteri (Citrobacterfreundii) dan jamur.

Kata

kunci:

polimer

Anti-mikroba,

biokatalis,

chemoenzymatic

rute,

hubungan

struktur-aktivitas.

1. Pengantar Pencarian untuk bahan anti-mikroba yang efektif telah menjadi keharusan dalam pandangan peningkatan cepat dalam resistensi terhadap antibioticsby mikroba. Sebuah kelas baru polimer, yang dikenal sebagai polimer anti mikroba yang mampu membunuh mikroba patogen, merupakan daerah yang berkembang pesat penelitian [1]. Ini polimer memiliki aplikasi potensial terhadap infeksi bakteri dalam perangkat biomedis seperti kateter atau implan [2], tekstil dan lapisan permukaan polimer [3]. Polimer yang memiliki struktur surfaktan telah dilaporkan dalam berbagai aplikasi [4-12]. Senyawa-senyawa amonium quaternized (QAC) dan polimer mereka menunjukkan antimikroba yang kuat kegiatan. Polimer non-toksik terhadap sel mamalia dan aman untuk digunakan dalam biomedis aplikasi. Mekanisme kerja polimer antimikroba melibatkan adsorpsi awal pada sel mikroba dan interaksi elektrostatik konsekuen dengan bilayer fosfolipid [13]. Ini interaksi mengganggu integritas membran sitoplasma dan mengakibatkan penghambatan pernapasan dan koagulasi intraseluler [14]. Interaksi antara nitrogen kationik polimer antimikroba dan fosfolipid bilayer mikroba yang menjadi negatif pada pH fisiologis, bertanggung jawab untuk polimer menunjukkan aksi antimikroba [15]. Polimer Anti-mikroba yang memiliki kuartener amonium atau piridinium ion dalam rantai dengan variabel panjang rantai alkil terpisah dari anti mikroba properti juga memiliki katalitik, pengemulsi dan sifat air pelunakan [16]. Sifat ini, terutama sifat anti-mikroba yang langsung berhubungan dengan sifat kuaterner nitrogen. Peneliti mengeksplorasi sifat anti-mikroba ofpolymers memiliki gugus kationik. Mengisi pada nitrogen, panjang rantai alkil, berat molekul dan sifat hidrofilik polimer kuat penentu yang mempengaruhi efektivitas dari polimer menunjukkan sifat antimikroba [17,18].

Selain itu, sifat anion juga sangat mempengaruhi efektivitas polimer. Dalam kelanjutan karya sebelumnya pada polimer anti-mikroba [19,20], dalam penelitian ini, sintesis dari serangkaian polimer baru dan penyelidikan sifat anti-mikroba mereka melawan gram (-) Bakteri dan dua jamur dilaporkan. Pengaruh panjang rantai alkil dan sifat kontra anion juga diselidiki untuk membangun hubungan struktur-properti dari polimer disintesis. Sebuah baru monomer, p-nitrofenil akrilat, disintesis oleh reaksi lipase-katalis. Liontin nitro kelompok yang disintesis p-nitrofenil akrilat dikurangi menjadi gugus amino dan selanjutnya polimerisasi dan quaternized melalui reaksi pos menggunakan empat bromida alkil dari berbagai panjang rantai. Setelah quaternization polimer yang diperoleh memiliki Br -Sebagai counter anion. Counter anion digantikan dengan anion seperti Cl-, OH-, CF3COO-Atau HSCH2COO-Oleh reaksi pertukaran anion untuk menghasilkan serangkaian delapan polimer [21]. Polimer, sehingga disiapkan, yang ditandai dengan berbagai teknik dan mereka sifat anti-mikroba dievaluasi terhadap dua jamur (Aspergillus nigerandMucor circenelliods) dan satu bakteri (Citrobacter freundii) oleh konsentrasi hambat minimum (MIC) menggunakan flukonazol dan clotrimazole atau penisilin, masing-masing, sebagai referensi. 2. Percobaan 2.1. Bahan Acrylic acid, p-nitro fenol, lipase, 2-butanon, seng debu, metanol, asam format, hidrazin, etil eter, sodiumchloride, butil bromida, oktil bromida, heksadesil bromida . Potato dextrose, lingkaran inokulasi, clotrimazole, flukonazol dan penisilin. Tes organisme Aspergillus nigerandMucor circenelliods (jamur) dan Citrobacter freundii (bakteri) diperoleh dari Departemen Bioteknologi, Himachal Pradesh Universitas Shimla, India. 2.2. Sintesis dan reaksi pasca poli (p-aminofenil akrilat) dengan bromida alkil yang berbeda Sintesis p-nitrofenil akrilat dilakukan dengan metode esterifikasi yang melibatkan reaksi asam akrilik dan p-nitrofenol (1:1 rasio molar) di hadapan lipase (1% dari total berat asam dan alkohol) pada 45 QC selama 10 -12 jam dalam Reaktor Kimia (IKA DTS-D4, AutoChem). Ester disintesis, pnitrofenil akrilat, dilarutkan dalam metil etil keton untuk menghapus lipase dan dicuci dengan air suling secara menyeluruh (3 sampai 4 kali) untuk memastikan bahwa itu adalah bebas dari kotoran. Sintesis p-aminofenil akrilat dilakukan dengan pengurangan nitro kelompok p-nitrofenil akrilat ke amina sebagai berikut. Campuran equimolar hidrazin hidrat dan asam formiat (larutan 85% dalam air suling) adalah bereaksi atas es mandi dengan pengadukan konstan untuk mendapatkan Hydrazinium monoformate (larutan yang digunakan untuk reduksi). Campuran p-nitrofenil acrylate (5 mM) dan debu seng (10 mM) dalam metanol (3 mL) adalah direaksikan dibawah atmosfir nitrogen selama 5-10 menit dengan pengadukan konstan pada suhu kamar terpisah. Hydrazinium monoformate (2 mL) ditambahkan ke reaksi di atas pada suhu kamar yang mengakibatkan pengurangan kelompok nitro. Setelah itu dietil eter ditambahkan yang diikuti oleh penambahan solusi jenuh natrium klorida untuk lepaskanstekerdari Hydrazinium monoformate. Lapisan organik bebas dari Hydrazinium monoformate dipisahkan menggunakan corong pisah dan dikeringkan pada suhu ambien untuk menghasilkan p-aminofenil akrilat. Polimerisasi p-aminofenil akrilat dilakukan dengan melarutkan p-aminofenil acrylate (5 g) dalam jumlah minimum dari air suling dan pemanasan pada 70O C selama 5 jam untuk mendapatkan padat

berwarna kuning poli (p-aminofenil akrilat) yang dipisahkan dengan melarutkan dalam jumlah minimum suling air dan diendapkan dengan menambahkan aseton. Itu dikeringkan dalam oven udara panas pada 40OC. Akhirnya, quaternization adalah dilakukan dengan mereaksikan poli (p aminofenil akrilat) (1 g) dengan kelebihan bromida alkil terpisah di 50OC selama 5 jam untuk memastikan quaternization penuh-NH2 group pada polimer amonium kuaterner kelompok menghasilkan serangkaian polimer quaternized. Bromida alkil bereaksi yang tertuang off dan polimer dipisahkan dengan mencucinya dengan aseton dan dikeringkan dalam oven udara panas pada 40OC. 2.2. Karakterisasi polimer Polimer disintesis dikarakterisasi dengan FTIR Spektroskopi, spektroskopi NMR dan XRD. FTIR Spektrum direkam pada Nicollet 5700 di KBr. Spektrum NMR direkam pada JEOL 400 MHz spektrofotometer di D2O. Pola difraksi sinar-X sampel dicatat pada PAN Analytic XRD dengan sistem difraktometer XPERT-PRO pada panjang gelombang 1,5406 (Cu-ki radiasi). Itu 2was sudut difraksi bervariasi 10 70 . 2.3. Studi aktivitas anti-mikroba Aktivitas anti-mikroba polimer yang berbeda dipelajari terhadap fungusAspergillus niger, Mucor circenelliods dan Gram (-) bakteri Citrobacter freundii. Aktivitas anti-mikroba dihitung dengan konsentrasi (MIC) metode hambat minimum, yaitu konsentrasi terendah senyawa yang menghambat pertumbuhan mikroba terlihat. Penentuan MIC melibatkan prosedur tes, yang memberikan perkiraan yang paling tidak konsentrasi agen ofanti-mikroba untuk mencegah pertumbuhan mikroba. Pengujian kerentanan dilakukan dengan seri pengenceran konvensional dan menemukan MIC dalam masingmasing media nutrisi. Protokol ini melibatkan penambahan senyawa sampel ke media mengikuti metode pengenceran serial. Kultur jamur dipertahankan pada dekstrosa kentang miring agar (1% direbus potato dextrose 20%, dan 2% agar) sebesar 3,5 pH. Media (2,5 ml) diambil pada tabung reaksi yang berbeda dan diautoklaf pada suhu 121 C dan 15 psi tekanan selama 20 menit. Setelah itu dikenal konsentrasi polimer (1000 mg / mL menjadi 62,5 mg / mL) yang ditambahkan ke dalam tabung tes untuk dua dari jamur dan diinokulasi dalam aliran laminar dengan 15 uL spora suspensi jamur diberikan. Tabung reaksi yang diinkubasi pada 30 C selama 5 d. Jumlah minimum senyawa yang menghambat pertumbuhan jamur, yaitu, MIC dihitung dan dibandingkan dengan standar fungisida (clotrimazole orfluconazole). Serupa Metode diadopsi untuk mempelajari aktivitas anti-bakteri dari polimer. Nutrisi kaldu (2 mL) dan polimer yang berbeda (100 mg / mL sampai 20 mg / mL) diautoklaf dan kemudian diinokulasi dalam aliran laminar dengan 100 uL bakteri (Citrobacter freundii) dengan bantuan inokulasi lingkaran. Para inoculates yang kemudian diinkubasi pada 55 C dengan gemetar pada 160 rpm selama 48 jam. Metode MIC digunakan untuk memeriksa penghambatan pertumbuhan bakteri menggunakan penisilin sebagai acuan. Semua eksperimen dibentuk dalam rangkap dua untuk mengevaluasi mereka pengulangan, dan kontrol bereksperimen dengan polimer juga didirikan.

2.4.

Pengaruh pertukaran anion pada aktivitas antimikroba Polimer quaternized dengan butil bromida diamati menunjukkan yang terbaik aktivitas biosidal baik terhadap bakteri dan jamur dari empat polimer dipelajari. Jadi polimer ini dipilih untuk melaksanakan reaksi pertukaran anion. Solusi jenuh polimer yang dicampur secara terpisah dan terus

menerus diaduk selama 30 menit dengan solusi jenuh empat garam natrium yang berbeda memiliki hidroksida, klorida, triflouroacetate, Thioglycolate sebagai anion. Ini dipisahkan dari solusi dengan curah hujan dengan aseton dan dikeringkan dalam oven udara pada 40 C. Aktivitas antimikroba dari polimer yang diperoleh memiliki anion yang berbeda telah dipelajari dengan mengikuti protokol yang sama sebagaimana digambarkan di atas dalam kisaran konsentrasi dari 500 mg / mL - 31.25 pg / mL, 80 mg / mL - 1 mg / mL rentang konsentrasi dari kedua jamur dan bakteri, masing-masing. 3. Hasil dan Pembahasan Serangkaian trialkil poli (p-ammoniumphenyl akrilat) bromida disintesis dengan berbeda agen alkylating sesuai Gambar 1 dan dikarakterisasi dengan XRD dan spektroskopi NMR.

Gambar. 1. Skema untuk sintesis dari seri baru polimer bioaktif

3.1. Karakterisasi polimer 1 H NMR p-nitrofenil acrylate memiliki sinyal pada 8,909 dan 7,616 ppm yang disebabkan oleh kehadiran proton phenylic. The doublet pada 5,89 ppm dan doublet lain pada 6,03 ppm diamati karena proton vinylic. Spektrum p-aminofenil akrilat, diperoleh setelah pengurangan kelompok nitro untuk amino kelompok, selain dari puncak karena vinyl dan proton fenil, memiliki puncak yang berbeda pada 4,566 ppm karena proton N-H. Dalam spektrum sinyal polimer baru muncul di 3,3-3,2 ppm, dan 2,9-1,9 ppm mengkonfirmasikan polimerisasi. Setelah quaternization kelompok amino, sinyal spektrum pada 4,566 ppm karena NH-proton menghilang mengkonfirmasikan reaksi quaternization. Sinyal pada 1,6-1,8 ppm muncul karena kejenuhan yang dikonfirmasi polimerisasi monomer bantalan gugus amino. Ada muncul lebih dekat puncak 1,8-1,4 ppm menunjukkan kejenuhan akibat proton dari rantai alkil. Penafsiran spektrum NMR yang berbeda jelas menegaskan pembentukan produk yang berbeda pada berbagai langkah termasuk pembentukan polimer yang ditargetkan

Gambar. 2. XRD Spektrum poli [p-aminofenil akrilat]

Gambar. 3. XRD Spektrum tributil poli [p ammoniumphenyl acrylate]bromida

Investigasi XRD jelas mengungkapkan bahwa polimer disintesis adalah alam kristal. Derajat kristalinitas (tidak dihitung) tergantung pada ion kontra. Pola XRD dari poli (p-aminofenil akrilat) disajikan sebagai Gambar 2 memiliki berbagai puncak luas antara 10 - 22q (2S) menunjukkan sangat teratur struktur dan sangat kristal sifat polimer. Intensitas puncak cukup tinggi di 10q (2s) dan di 70q (2s) dibandingkan dengan pola XRD lainnya. Puncak luas pada nilai 22 - 55q (2s) menegaskan nya Sifat kristal tetapi puncak antara 10 - 22q (2s) dan 55 - 70q (2s) cukup sempit menunjukkan quaternization dari polimer dan juga menegaskan bahwa panjang rantai tidak mempengaruhi kristalinitas tributil poli (p-ammoniumphenyl akrilat). Jenis yang sama penjelasan dapat diberikan dalam kasus lain dengan hanya perbedaan dalam puncak ofthe intensitas antara 10 - 22q (2s) dan 55 - 70q (2s) yang cukup rendah. Sekarang demikian menegaskan bahwa dengan peningkatan panjang rantai polimer puncak pada 22 - 55q (2s) berubah sedikit setelah quaternization seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3. Oleh karena itu, menegaskan bahwa semua polimer yang disintesis memiliki tingkat tinggi kristalinitas dan panjang rantai tidak mengubah sifat polimer drastis. 3.2. Aktivitas anti-mikroba Aktivitas anti-mikroba dari polimer adalah suatu kemampuan polimer untuk mengganggu selmembran mikroba yang dihasilkan dari interaksi polimer dengan dinding sel mikroba.

Gambar. 4. MIC polimer yang berbeda terhadap tiga mikroba dalam mg / mL Aktivitas anti-mikroba dipamerkan oleh polimer didorong oleh dua kekuatan: kekuatan elektrostatik antara kelompok kationik polimer dan bermuatan negatif membran sel dan van der Walls kekuatan antara gugus hidrofobik dari rantai polimer dan fosfolipid dari dinding sel [22]. Di kontak dengan polimer permukaan membran sel mikroba terganggu dan pembentukan biofilm mikroba adalah dicegah. Sebagian besar polimer menunjukkan aktivitas anti-bakteri kuat daripada aktivitas anti-jamur yang adalah karena perbedaan dalam struktur dinding sel jamur dan bakteri. Pada pH fisiologis, dinding sel bakteri bermuatan negatif dan polimer kationik kuat mengadsorbsi dan berinteraksi dengan dinding sel bakteri. C. freundii adalah bakteri gram negatif dengan dinding sel terdiri dari peptidoglikan layer dan membran luar terdiri dari fosfolipid dan lipopolisakarida, dan dinding sel memiliki muatan negatif secara keseluruhan. Di sisi lain, dinding sel jamur terutama dibuat up kitin yang memiliki ikatan hidrogen yang

kuat antara rantai polimer yang berbeda. Dengan demikian, struktur dari dinding sel jamur tidak mudah terganggu oleh polimer anti mikroba. Oleh karena itu, polimer kationik menunjukkan aktivitas biosidal tinggi terhadap bakteri dibandingkan jamur. The differencesin nilai MIC yang dijelaskan oleh efek anion pada polimer. Karena perubahan struktur polimer setelah pertukaran anion adalah anion tergantung, tingkat interaksi antara pusat kationik polimer dan dinding sel mikroba juga anion-dependen.

Gambar. 5. MIC polimer yang berbeda terhadap tiga mikroba dalam mg / mL setelah pertukaran ion Sebuah aktivitas anti-bakteri yang kuat dengan MIC terendah dari 80 ug / mL diperagakan oleh tributil poli (p-ammoniumphenyl akrilat) bromide terhadap bakteri gram (-) bakteri Citrobacter freundiiwhich memiliki jauh rumit struktur dinding sel dengan lapisan luar yang kurang berpori, Gambar 4. Kegiatan anti-jamur dipelajari terhadap A. niger dan M. circenelliods. Obat standar penisilin, clotrimazole atau fluconazole, masing-masing, tidak menunjukkan aktivitas terhadap bakteri atau jamur pada kisaran konsentrasi belajar. The anti-jamur kegiatan withthe nilai MIC terendah 500 mg / mL diberikan pada Gambar 4. Kegiatan anti-jamur berasal dari penghambatan sintesis atau interaksi langsung polimer dengan ergosterol, yang merupakan komponen utama dari membran sel jamur dan hasilnya terganggunya membran sel dan pencegahan pembentukan biofilm mikroba [23,24]. Polimer Struktur menginduksi pertukaran ion pada dinding sel jamur, menyebabkan ion divalen dari dinding sel jamur untuk pindah dari membran mengakibatkan hilangnya integritas membran [25]. Telah diamati bahwa aktivitas anti-mikroba polimer adalah alkil rantai panjang tergantung sebagai nilai MIC tributil poli (p-ammoniumphenyl akrilat) bromida diamati untuk menjadi yang terendah karena memiliki rantai minimum panjang, maka kontak efisien pada tahap awal, yang merupakan kondisi yang diperlukan untuk mengikuti karpet Mekanisme [19,20]. Semua polimer yang memiliki OH-, Cl-, CF3COO- Atau SHCH2COO Anion-counter memiliki khasiat yang sangat tinggi sebagai agen anti-mikroba dan antibakteri dari semua polimer yang ditemukan lebih kuat dari standar yang digunakan. Namun, aktivitas anti-mikroba juga diamati anion tergantung sebagai MIC polimer memiliki Cl- Sebagai kontra anion diamati menjadi 250 mg / mL terhadap jamur dan juga terhadap bakteri dengan nilai MIC 60 mg / mL disajikan pada Gambar 5.

Gambar. 6. Foto-foto mikroba diobati dengan polimer dan mikroba tidak diobati (a) bakteri, (b) dan (c) jamur . Foto-foto yang menggambarkan perbandingan mikroba diobati dengan polimer dan mikroba yang tidak diobati tampak seperti pada Gambar 6. Ini jelas menunjukkan perbedaan adanya mikroba diobati dengan polimer anti-mikroba dibandingkan dengan sampel yang tidak diobati yang menunjukkan pertumbuhan maksimum dari mikroba. 4. Kesimpulan Serangkaian trialkil poli (p-ammoniumphenyl akrilat) bromida disintesis dan kemudian dikenakan untuk anion reaksi metatesis dengan pertukaran anion. Dalam penelitian ini aktivitas antimikroba polimer terhadap kedua organisme uji diamati tergantung pada sifat dari organisme uji, panjang rantai alkil dan sifat kontra anion pada polimer. Itu keluar dari studi ini bahwa alkil panjang rantai dan struktur anion mempengaruhi penyelarasan rantai polimer menunjukkan mekanisme mirip dengan mekanisme karpet. Semakin lama panjang rantai tidak diamati efektif dalam kedua kasus. Ada bukti kuat yang menunjukkan bahwa struktur anion memiliki efek mendalam pada profil struktur properti dari polimer. Struktural aktivitas hubungan isevident sebagai polimer yang memiliki Cl- sebagai ion tanding dipamerkan aktivitas anti-jamur terkuat dengan nilai MIC 250 mg / mL againstA. Niger M. circenelliods. Nilai-nilai MIC polimer dipelajari terhadap Gram tersebut (-ve) bakteri sangat rendah dibandingkan dengan penisilin obat standar. Hasil ini signifikan sebagai polimer disintesis oleh Metode chemoenzymatic hijau sederhana spektrum agen anti-mikroba kuat dan luas. Pengakuan Salah satu penulis, Priyanka Dogra, adalah gratefulto Universitas Grants Commission, New Delhi, India, untuk bersekutu di bawah RGNF-2010 Skema. Referensi [1] Kenawy ER, Worley SD, Broughton R., Biomacromol. 2007; 8:1359-1384. [2] E. Ranucci, Ferruti P., Polymer1991, 32: 2876-2879. [3] Worley S.D., Sun G., Tren polym. Sci. 1996; 4: 364-370. [4] Dueymes C., A. Schonberger, Adamo I., Navarro AE, Meyer A., M. Lange, Org. Lett.2005; 7: 3485 3488. [5] Tang J., H. Tang, Sun W., Plancher H., M. Radosz, Shen Y., Chem. Commun. 2005; 26: 3325-3327. [6] Tang J., Sun W., Tang H., M. Radosz, Shen Y., Macromolecules2005; 38:2037-2039. [7] M. Yoshizawa, Ogihara W., Ohno H., polym. Adv Technol. 2002; 13: 589-594. [8] Ferreyra NF, Coche-Guerente L., Labbe P., Calvo EJ, Langmuir2003, 19: 3864-3874. [9] Yan F., Texter J., Chem Commun. 2006; 25: 2696-2698. [10] Yan F., Texter J., Angew. Chem. Int. Ed.2007, 46: 2440-2443. [11] Sambhy V., MacBride MM, Peterson BR, Sen A., J. Am. Chem. Soc. 2006; 128: 9798-9808.

[12] Stratton TR, Rickus JL, Youngblood JP, Biomacromol. 2009; 10: 2550-2555. [13] Butorac RR, Al-deyab SS, Cowley AH, Molecules2011, 16: 3168-3178. [14] Hindi KM, Panzner MJ, Tessier CA, Cannon CL, Youngs WJ, Chem. Rev 2009; 109: 3859-3884. [15] Yeaman M. R., Yount N.Y., Pharmacol. Rev 2003, 55, 27-55. [16] Chauhan GS, Lal H., S. Mahajan, Bansal M., J. polym Sci A: polym. Chem.2000, 38: 4506-4518. [17] Denyer S.P., Stewart G.S.A.B., Intl. Biodeter. Biodegr.1998, 41: 261-268. [18] Li G., Shen J., Zhu Y., J. Appl. Polym. Sci. 2000; 78: 668-675. [19] G. Garg, Chauhan GS, Gupta R., Ahn JH, J. Koloid Antarmuka Sci. 2010; 344: 90-96. [20] Sharma SK, Chauhan GS, Gupta R., Ahn JH, J. Mater Sci:. Mater. Med 2010; 21: 717. [21] Chauhan GS, Singh B., Dhiman SK, J. Appl. Polym Sci. 2004; 91: 2454-2464. [22] V. Yadav, Mandhan R., Pasha T., S. Pasha, Katyal A., Chhillar AK, Gupta J., Dabur R., Sharma GL, J. Med. Microbiol. 2007; 56: 637-644. [23] Ghannoum sarjana sastra, Beras L.B., Clin. Microbiol. Rev 1999; 12: 501-517. [24] Sheehan DJ, Hitchcock CA, Sibley CM, Clin. Microbiol. Rev.1999, 12: 40-79. [25] R. Kugler, Bouloussa O., Rondelez F., Microbiology2005, 151: 1341-1348..