LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI
ISOLASI DNA

Oleh
Nama
NIM
Kelompok
Asisten

:
: Farid Mufti A
: 115040201111104
: Selasa, 07.30 WIB
: Agatha

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012

I.

I.1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
DNA merupakan suatu senyawa asam nukleat
yang membawa sifat genetik. Di dalam sel, DNA
umumnya terletak di dalam inti sel. DNA sendiri
berperan sebagai materi genetik. DNA merupakan
polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu
gugus fosdat, gula, deoksiribonukleat, dan basa
nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yangterdiri dari
ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida,
sehinnga DNA tergolong sebagai polinukleotida.

I.2

Tujuan
a. Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA
dan PCR
b. Untuk mengetahui uji kualitas DNA

c. Untuk mengetahui komponen dan tahapan

PCR
d. Untuk mengetahui manfaat PCR

II.

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari

DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung (Mader 193).
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam
fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Campbell 2002).

PCR adalah suatu metode in-vitro yang

digunakan untuk mensisntesis sekuens tertentu
DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang
berlawanan dan mengapit dua target DNA.
(Brown, 2002)

II.2 Uji kualitas DNA

Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA.
Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang
berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian
dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan
metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini
bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA
dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan
dengan uji kuantitatif DNA dengan metode
spekrofotometri.
Spektrofotometri merupakan suatu
metode
analisis untuk mengukur konsentrasi suatu
senyawa berdasarkan kemampuan senyawa
tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya.
Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar
dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu, sementara fotometer adalah pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau
diabsorbsi
(Riyadi, 2009).

II.3 Komponen dan tahapan PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan

enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan
adalah:
a. Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau
oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus
membatasi

reaksi

pemanjangan

rantai

atau

polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau

PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E.
coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR
hanya mampu menggandakan DNA pada daerah
tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan
dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer
dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen
dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel
mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

b. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai batu bata

penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam
sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP,
dCTP, dGTP dan dTTP.

c. Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia
untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum
dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
d. Ion Logam
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya
sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa
ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan PCR adalah sebagai berikut:

a. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96C
selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda
akan memisah menjadi utas tunggal.
b. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke
kisaran

40-60C

selama

20-40

detik

untuk

memberikan

kesempatan

bagi

primer

untuk

menempel pada DNA template di tempat yang

komplemen dengan sekuen primer.
c. Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu
kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 7072C. Pada tahap ini DNA polymerase akan
memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya,
jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A
adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya).
Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke
ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada
panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara
kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
(Anonymousb , 2012)

II.4 Manfaat PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan

untuk:
a. Amplifikasi urutan nuk leotida.
b. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA
yang mengalami mutasi.
c. Bidang kedokteran forensik.
d. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan
finger print.
(Mahmuddin, 2010)

III.

III.1

METODOLOGI

Alat, Bahan, dan Fungsi

Alat :

Pipet Mikro : untuk memindahkan cairan

bervolume kecil.

Cawan Petri : Untuk meletakkan specimen

Mortar : untuk menumbuk specimen

Fortex : untuk menghomogenkan larutan

Sentrifiuse : untuk memisahkan larutan.

Freezer : untuk inkubasi

Elektroforesis : untuk menguji keantitas DNA

Bahan :

Daun Srikaya : Sebagai bahan praktikum

PVP : sebagai bahan penyerap fenol

CTAB : untuk melisis membrane

Chisam : untuk mendegradasi protein

DNA pallet : hasil presipitasi DNA yang

menggumpal

Isopropanol dingin : untuk menggumpalkan DNA

TE (Tris EDTA) : untuk meresuspensi

Nitrogen Cair : untuk mempermudah proses

penumbukan menjadi bubuk

III.2

Buffer Pencuci : sebagai larutan penyangga

Langkah Kerja (Diagram Alir)

Buffer ekstraksi

Timbang sample

CTAB (1 ml)

0.3gr + PVP 1%

+ mercaptoetamol

N2 cair (-196C)

+inkubasi 30 (65C)

Chisam 500 l

Sentrifuse 10000 Prm 10

Ambil Supernatan

Chisam 1X volume supernatant (1 : 1)

Sentrifuse 6000 rpm 10

Isopropanol 0,45X volume supernatant

Inkubasi freezer 30

DNA pellet
+Buffer Pencuci 200l

+RNAse 1l (35C)
+Resuspensi dengan elution buffer 20-50l

Simpan unuk elektroforesis

Elektroforesis

siapkan gel agarose 0,32gr/40ml

Siapkan DNA + loading dye

Siapkan elektroforesis tank dengan

larutan TBE
Ready

III.3

Analisa Perlakuan
Pertama, kita memotong daun srikaya kecil-kecil

dengan membuang tulang daunnya terlebih dahulu. Daun

tersebut kemudian ditumbuk dengan mortar dengan diberi
nitrogen cair untuk mempercepat proses penumbukan
menjadi bubuk dan telah diberikan PVP 1%, buffer
ekstraksi , mercaptoetamol, dan diinkubasi selama 30
menit. Setelah itu diberi chiasm dan difortex serta
disentrifuse selama 10 menit. Supranatan diambil
kemudian difortex kembali dan ditambahkan chiasm dan
supranatant (1:1), lalu disentrifuse kembali selama 10
menit. Kemudian tambahkan isopropanol 0,45X volume
supernatant dan diinvert, serta diinkubasi pada freezer
selama 30 menit, sentrifuse kembali lalu isopropanol
dibuang. Selanjutnya akan didapatkan DNA pellet dan

diberi buffer pencuci 2X, ditambah RNAse 1l dan

resuspensi dengan elution buffer, kemudian simpan dalam
freezer untuk elektroforesis.

IV.

IV.1

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar Hasil Elektroforesis

IV.2

Analisa Gambar Hasil Elektroforesis

Dari gambar di atas, dapat kita ketahui banyak DNA

yang terdapat dalam bahan tersebut. Hal ini ditunjukkan

dengan banyaknya jumlah pita berfluorescence orange
yang terdapat dalam ganbar memiliki ketebalan yang
cukup tebal. Sehingga dapat kita simpulkan bahwa bahan
tersebut mengandung banyak DNA.

V.

PENUTUP

V.1 Kesimpulan
Isolasi

DNA

merupakan

suatu

proses

untuk

mendapaykan DNA murni yang selanjutnya

digunakan untuk keperluan pemeriksaan.

V.2 Saran
Sejauh ini praktikum sudah berjalan lancar dan cukup
baik.

akan

DAFTAR PUSTAKA

Anonymousb.2012.http://sciencebiotech.net/mengenal=pcr-polymerase-chainreaction/.diakses pada 24 November

2012
Anonymousa.2012.http://takdirsaili.wordpress.com/2012/
02/03/analisis-molekuler-tingkatkekerabatan/.diakses

pada

24

November 2012
Brown, T.A. 2002. DNA in genomes, 2nd ed.
Cambell, 2002. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA
Tanaman

Mahmuddin.2010.http://mahmuddin.wordpress.com/201
2/08/31/polymerase-chain-reactionpcr/.diakses pada 24 November 2012
Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya
(Vis, UV dan IR)