TUGAS MAKALAH BIOANALISIS HPLC METHOD FOR THE DETERMINATION OF FLUVOXAMINE IN HUMAN PLASMA AND URINE FOR APPLICATION

TO PHARMACOKINETIC STUDIES

Oleh: WAHYU RELLY SETIAWAN AWALIA ANNISAFIRA 102210101052 112210101065

BAGIAN KIMIA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2014

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Fluvoxamine (FL) adalah selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) yang merupakan senyawa baru dari 2-aminoetil oksim eter dari gugus aralkylketon. Senyawa ini disebut sebagai 5-metoksi-4-(trifluoromethyl) valerophenone (E)-O-(2-aminoethyl) oxime maleat. Fluvoxamine dapat diserap dengan baik setelah pemberian oral dan konsentrasi plasma maksimum dicapai dalam sekitar 2-8 jam. Berarti waktu paruhnya (t1/2) adalah sekitar 19 dan 22 jam pada dosis tunggal dan ganda, dan tidak mengalami peningkatan secara signifikan pada orang tua. Tidak ada tingkatan toksisitas yang ditetapkan, tetapi pencapaian steady state akan tercapai setelah pemberian sebanyak 100

mg/hari. Fluvoxamine secara ekstensif dimetabolisme di hati, dan kurang dari 4% yang diekskresikan tidak berubah. Rute utama dari metabolisme adalah oxidative demethylation (sekitar 42-50% dari total metabolisme), deaminasi oksidatif (15-23%), pemutusan ikatan =N-O (12%) dan N-asetilasi (8%). Fluvoxamine tidak memiliki metabolit dengan aktivitas psikotropika. Oleh karena itu, sedikit kemungkinan adanya metabolit untuk menyebabkan masalah yang merugikan. Beberapa metode analisis kuantitatif telah dipublikasikan, seperti metode GC dan spektrofotometri yang digunakan untuk penentuan FL dari bentuk sediaan farmasi. Selain itu, metode elektroforesis juga telah dijelaskan. Metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dapat pula digunakan untuk penentuan FL dalam plasma. Peneliti sebelumnya juga telah meneliti metode HPLC dengan ultraviolet untuk deteksi FL dan metabolitnya. Penemuan tujuh selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) pada serum manusia menggunakan metode HPLC dengan deteksi ultraviolet, kromatografi gas, kromatografi lapis tipis dan deteksi menggunakan berbagai detektor (UV, fluoresensi, detektor elektrokimia, detektor nitrogen-fosfor dan MS) juga telah dipelajari.

Gambar. 1. Struktur kimia dari fluvoxamine (a), NQS (b) dan tryptamine, IS (c)

Penentuan FL dalam plasma tikus dengan menggunakan HPLC dengan pre-kolom derivatisasi dan deteksi fluoresensi menggunakan 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole juga telah dijelaskan. Pra-kolom untuk metode HPLC secara langsung telah dilakukan untuk penentuan anti-depressants clovoxamine dan FL dalam plasma. Metode kromatografi lapis tipis atau HPLC telah digunakan untuk penentuan FL pada plasma manusia. Berdasarkan penjelasan diatas, metode HPLC dengan deteksi ultraviolet dapat digunakan untuk menentukan FL pada plasma dan urine manusia dengan cara derivatif yang dibentuk dari NQS. NQS biasanya bereaksi dengan amina primer dan sekunder. Berdasarkan penelitian, FL merupakan turunan NQS dan telah ditentukan dengan menggunakan detektor UV. Metode ini divalidasi dengan melihat spesifisitas, akurasi, presisi dan sensitivitas. Hal itu penting untuk menentukan LOD pada kisaran ng/ml rendah. Metode ini efisien dalam menganalisis plasma dan urin dalam jumlah besar untuk studi farmakokinetik efek terapi FL.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana penentuan farmakokinetik FL dalam plasma dan urin manusia menggunakan metode HPLC? 2. Bagaimana validasi penentuan FL dalam plasma dan urin manusia menggunakan metode HPLC?

1.3 Tujuan

1. Penentuan farmakokinetik FL dalam plasma dan urin manusia menggunakan metode HPLC 2. Menentukan validasi FL dalam plasma dan urin manusia menggunakan metode HPLC

BAB II METODE

2.1. Percobaan 2.1.1 Bahan dan reagen Bahan yang digunakan dalam penetian ini adalah FL, Tryptamine (internal standar, IS), NQS, pelarut organik HPLC-grade, air suling dan sampel darah vena dilarutkan ke asam ethylene diamine tetra acetic dan disentrifugasi (4500 g selama 15 menit). Plasma dan sampel urin kemudian dibekukan pada suhu -20C sampai digunakan analisis. 2.2. Instrumentasi Kromatografi yang digunakan adalah HPLC (TX, USA) Model P 4000, memilki volume loop rheodhyne 20 l, detektor yang digunakan adalah UV. Pemisahan dilakukan dalam kolom Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm id, 5 m; pemisahan Thermo, TX, USA), dengan kolom pelindung (4 mm x 3 mm id, Phenomenex) yang dikemas dengan bahan yang sama. Hasilnya di plot dan diolah menggunakan software sistem otomasi SN 4000. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril : air (80:20 v / v). Kecepatan alir yaitu pada 1 ml / menit. Panjang gelombang yang digunakan 450 nm. 2.3. Larutan Standar Larutan FL (1 mg / ml) dibuat dalam pelarut metanol. Larutan baku standar FL yang diperoleh dari plasma dan urin dari relawan yang sehat diencerkan hingga diperoleh konsentrasi 5, 10, 25, 50, 100, 125 dan 145 ng / ml dan 2, 5, 10, 20, 25, 75, 100 ng / ml. Larutan standar disimpan pada suhu +4C. Larutan IS dibuat pada konsentrasi 1 mg / ml. Larutan IS (1 g / ml) diencerkan dengan menggunakan pelarut metanol. Larutan reagen NQS 0,2% (b/v) dibuat dengan menggunakan pelarut aquadest. Larutan buffer borat 0,025 M dibuat dengan menggunakan sodium tetraborated pada pH 8,5 dengan larutan 0.1N sodium hidroksida. 2.4. Preparasi sampel Sampel diambil 0,25 ml dari plasma dan urin sampel yang dikumpulkan dari relawan manusia, dipipet ke dalam labu 12 ml, kemudian disentrifuge. Dalam larutan standar internal (20 l, 1 g / ml), 2 ml asetonitril ditambahkan kedalamnya. Setelah divortex selama 3 menit, tabung disentrifugasi selama 20 menit. Kemudian diambil 1,5 ml supernatan dari masing-masing sampel kemudian dipindahkan ke tabung 5 ml lain dan diuapkan sampai kering di bawah aliran gas nitrogen pada suhu 40C. Residu yang dihasilkan, ditambahkan 300 l buffer borat dan 200 l larutan NQS. Campuran kemudian

dikocok. Larutan kemudian didiamkan selama 30 menit didalam bak berisi air pada suhu 70C, kemudian didinginkan sampai suhu kamar dan ditambahkan 100 l dari 0,1 N larutan asam klorida. Campuran diekstraksi tiga kali dengan 1,5 ml diklorometana: n-butanol (4:1 v / v). 4 ml larutan sampel diuapkan sampai kering di bawah aliran gas nitrogen pada suhu 40C. Residu dilarutkan dalam 200 l dari fase gerak, dan 20 l disuntikkan ke dalam sistem HPLC.

2.2. Validasi Assay 2.2.1. Linearitas Tujuh konsentrasi FLsebagai standar (5, 10, 25, 50, 100, 125 dan 145 ng / ml untuk plasma dan 2, 5, 10, 20, 25,75 dan 100 ng / ml untuk urin) dikalibrasi dengan diekstraksi dan diuji. Sehingga dihasilkan linearitas dari kurva kalibrasi dengan memplot rasio puncak FL dan IS versus konsentrasi FL dengan kuadrat-analisis regresi linier. 2.2.2. Presisi dan akurasi Presisi dan akurasi yang dihasilkan dari konsentrasi FL rendah, sedang dan tinggi dianalisis dari sampel plasma dan urin dengan beberapa replikasi. Presisi ditentukan dari hasil replikasi masing-masing sampel pada 1 hari (n = 5). Presisi ditentukan dengan replikasi pada lima hari berturut-turut (n = 5). Konsentrasi masing-masing sampel ditentukan dengan menggunakan standar kalibrasi disusun pada hari yang sama. 2.2.3. Kepekaan Sensitivitas ditentukan dengan batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ, konsentrasi terendah standar terukur). 2.2.4. Spesifisitas Blangko plasma manusia dan urine, yang diperoleh dari tiga relawan sehat, dinilai dengan prosedur seperti dijelaskan di atas dan dibandingkan dengan masing-masing sampel plasma dan urin untuk mengevaluasi spesifisitas metode ini. Berbagai antidepresan dan antihipertensi lain (milnacipran, venlafaxine, mirtazapine, amitryptiline, citalopram, norfluoxetine, amineptine, tranylcypromine, desipramine, Maprotiline, anilin,

cyclohexylamine, lisinopril dan amlodipine) juga diuji sebagai pembanding. Waktu retensi untuk obat ini ditentukan di bawah kondisi kromatografi untuk uji FL. 2.2.5. Recovery Recovery ditentukan dari plasma dan urine pada tiga konsentrasi FL yang berbeda. Telah diketahui bahwa sejumlah FL ditambahkan ke plasma dan kemudian ditambahkan standar internal. Setelah derivatisasi, proses kromatografi, daerah puncak

dibandingkan dengan daerah puncak yang diperoleh dari larutan FL pada konsentrasi yang sama. 2.2.6. Stabilitas Stabilitas FL dan larutan standar internal diuji pada suhu kamar selama 2, 6, 12 dan 24 jam dan setelah didinginkan (4C) selama 24 jam. Stabilitas Freeze-thaw sampel plasma ditentukan dengan tiga kali freezethaw. Sampel plasma dan urin pada konsentrasi 5 dan 75 ng / ml dibekukan pada -20C selama 24 jam dan dicairkan pada suhu kamar. Setelah benar-benar cair, sampel didinginkan lagi dan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Untuk stabilitas jangka pendek, tiga tingkat konsentrasi plasma dan urin sampel disimpan pada suhu kamar selama periode (6 dan 10 jam). Stabilitas jangka panjang dievaluasi setelah pembekuan sampel plasma pada -20C selama 3 bulan.

2.3. Studi klinis FL diberikan dalam dosis tunggal 50 mg (35-40 tahun relawan wanita tua sehat). Selanjutnya sampel darah yang diambil dan dimasukkan ke dalam tabung asam ethylene diamine tetra acetic pada 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 14, 16, 24, 36 dan 48 jam setelah pemberian. Sampel plasma segera dipisahkan dengan sentrifugasi pada 4500 rpm. Sampel plasma dan urin disimpan pada suhu -20C sampai waktu pengujian.

BAB III HASIL DAN DISKUSI

3.1. Optimasi kondisi reaksi Reaksi antara FL dan NQS dalam buffer borat pH 8,5 menghasilkan produk yang berwarna oranye dengan serapan maksimum pada 450 nm ( Gambar. 2 ). Parameter percobaan yang berbeda mempengaruhi intensitas warna yang dihasilkan dan intensitas warna yang maksimal. Pertama, variasi pH dibatasi pada rentang pH (7-10) menggunakan buffer borat dan fosfat. Karena rentang absorbansi hanya dalam medium alkali, sehingga pH dibatasi dalam kisaran 7-10 menggunakan larutan buffer. Pembacaan absorbansi tertinggi untuk FL diperoleh pada pH 8,5 menggunakan buffer borat ( Gambar 3.). Buffer borat diketahui lebih unggul, karena absorbansinya tertinggi (max, 450 nm). Pengaruh suhu pemanasan dan waktu yang berbeda diuji menggunakan water bath pada empat temperatur yang berbeda 50-80C. Optimasi dari derivatisasi dilakukan dengan menggunakan standar larutan FL dan IS. Derivatisasi tertinggi dan konstan diperoleh pada suhu 70C dengan waktu reaksi 30 menit. Di suhu kamar, reaksi lebih lambat. Pelarut yang berbeda seperti metanol, etanol, asetonitril, kloroform, diklorometana, n-butanol dan etil asetat dipelajari sebagai derivatif. Absorbansi maksimum diperoleh diklorometana : nbutanol.

Gambar. 2. Reaksi antara FL dan NQS

Gambar. 3. Pengaruh pH pada reaksi FL dengan NQS

Gambar. 4. Kromatogram (A) plasma manusia blangko, (B) plasma ditambahkan 100 ng / ml FL (b) dan 80 ng / ml IS (a), (C) sampel darah yang diambil pada jam ke-4 setelah pemberian 50 mg FL dari relawan sehat dengan 80 ng / ml IS, (D) urin ditambahkan 50 ng / ml FL (b) dan 80 ng / ml IS (a), dan (E) urin blangko

Gambar. 4. (Lanjutan)

3.2. Kondisi kromatografi Metode pengembangan difokuskan pada optimalisasi persiapan sampel, pemisahan kromatografi kolom dan deteksi. Beberapa tes dilakukan untuk mengoptimalkan komponen fase gerak untuk mendapatkan puncak dan resolusi kromatografi yang baik. Hasil tes menunjukkan bahwa sistem pelarut air dapat meningkatkan bentuk puncak FL. Pemisahan senyawa target yang baik dan jangka waktu pendek diperoleh dengan menggunakan sistem fase gerak acetonitrile air 80:20 v / v dengan laju alir 1 ml / menit. Waktu retensi FL (4,807 menit) cukup singkat. Di sisi lain, fase gerak asetonitril-air bukan merupakan sistem buffer seperti yang digunakan dalam metode HPLC yang telah dilaporkan sebelumnya. Oleh karena itu, pembilasan kolom setelah analisis tidak diperlukan. Pemisahan kromatografi dilakukan pada kolom C18 fase terbalik dengan fase gerak yang terdiri dari acetonitrile dan air (80:20 v / v). Nilai max FL-NQ derivatif adalah 450 nm berdasarkan penyerapan spectra UV-Vis. Kromatogram diperoleh dari blangko plasma manusia dan plasma ditambahkan FL (100 ng / ml) dan IS yang ditunjukkan pada Gambar. 4 A dan B. Gambar. 4 C merupakan kromatogram plasma yang diperoleh

pada jam ke-5 setelah pemberian dosis tunggal FL secara oral dari sukarelawan sehat dan pada urine ditunjukkan pada gambar ( Gambar. 4 D ).

3.3. Validasi Assay 3.3.1. Linearitas Kurva kalibrasi dari FL pada berbagai konsentrasi dari 5-145 ng / ml untuk plasma dan 2-100 ng / ml untuk urin memiliki kurva yang linier, sama bagusnya dengan paper lain yang telah dilaporkan. Persamaan kurva kalibrasi adalah sebagai berikut ( Tabel 1):

A = peak area ratio (FL / standar internal) dan C = FL konsentrasi (ng / ml)

Tabel 1 Hasil analisis regresi dari data linearitas FL

3.3.2. Presisi dan akurasi Metode ini menunjukkan presisi dan akurasi yang sangat baik. Data presisi dan akurasi untuk FL dari sampel plasma dan urin ditunjukkan pada Tabel 2. Presisi intra-dan inter-day yang telah diukur menghasilkan 0,43 dan 5,26% untuk plasma, 0,47 dan 11,29% untuk urin. 3.3.3. Kepekaan Batas nilai deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari FL yang dapat dideteksi (rasio signal-to-noise 3) di sampel plasma manusia dan urin masing-masing 1,4 dan 1 ng / ml. Batas kuantifikasi FL dalam plasma manusia dan sampel urin masing-masing adalah 5 dan 2 ng / ml. Tujuan derivatisasi adalah untuk mengetahui konsentrasi rendah dan untuk meningkatkan sensitivitas. Analisis ini memiliki kuantifikasi dan limit deteksi masing-masing 1,4 dan 5 ng / ml untuk plasma, yang memiliki hasil yang lebih baik dari paper-paper yang lain.

3.3.4. Recovery ekstraksi Recovery ekstraksi rata-rata FL dari plasma manusia dan urin masing-masing adalah 96,66 0,69 dan 96,73 2,17%. Recovery relatif rata-rata untuk IS di 80 ng / ml adalah 95,58 (n = 7). Recovery data ditunjukkan pada Tabel 3. Rata-rata recovery untuk plasma adalah 96,27% dan 96,68% untuk urin, hal ini memiliki hasil yang lebih baik daripada yang dilaporkan pada penelitian lain oleh Yasui-Furukori et al. dan Eap dan Baumann dimana masing-masing recovery-nya masing-masing adalah 94,8 dan 50-66%,. 3.3.5. Spesifisitas Kontrol plasma manusia dan urine, yang diperoleh dari tiga relawan sehat, dinilai dengan prosedur seperti dijelaskan di atas dan dibandingkan dengan masing-masing sampel plasma dan urin untuk mengevaluasi spesifisitas dari metode. Milnacipran, venlafaxine, mirtazapine, amitryptiline, citalopram, norfluoxetine, amineptine, tranylcypromine, desipramine, maprotiline, lisinopril dan amlodipine. Waktu retensi untuk obat ini ditentukan dengan kromatografi, dan ditemukan tidak mengganggu waktu retensi FL dan IS. 3.3.6. Stabilitas Larutan stok dari FL dan IS stabil selama minimal 15 hari bila disimpan pada 4C. Larutan derivatif FL-dan IS-NQ stabil selama 12 jam pada suhu kamar dan 5 hari pada 4C. Stabilitas FL pada -20C dalam plasma manusia dan urin juga dinilai di sampel FL setelah penyimpanan pada suhu kamar selama 24 jam, setelah tiga proses pembekuan dan pencairan. Tidak ada perubahan signifikan dalam FL dan konsentrasinya dalam sampel plasma dan urin manusia jika disimpan pada suhu -20C setelah tiga kali siklus freeze-thaw atau pada suhu kamar selama 24 jam. Untuk jangka pendek, stabilitas FL dalam plasma dan urin adalah selama minimal 1 bulan untuk plasma dan 2 minggu untuk urin. Dalam studi stabilitas jangka panjang, sampel plasma dan urin dengan FL dapat disimpan masing-masing selama 3 dan 2 bulan.

3.4. Aplikasi Metode ini berhasil digunakan untuk menentukan konsentrasi FL dalam plasma dan urin setelah pemberian oral pada relawan wanita sehat berusia 35-40 tahun dengan pemberian dosis 50 mg. Konsentrasi plasma maksimum FL (Cmax) dan waktu untuk mencapai nilai ini (tmax) adalah 58 ng / ml dan 5,2 jam. Waktu paruh (t1/2) dan AUC obat adalah masing-masing sebesar 15,4 jam dan 665 ng h / ml, ( Gambar. 5) . Berarti waktu (h) dihitung keseluruhan adalah 22,2 jam ( Tabel 4) . Sekitar 3% dari obat ini diekskresikan,

dalam waktu 15 jam setelah pemberian secara oral ( Gambar. 6) . Parameter farmakokinetik diperoleh dengan menggunakan metode yang diusulkan dalam studi sebelumnya. Selain itu, volume yang rendah pada plasma dan urin (0,25 ml) dapat digunakan dalam metode yang diusulkan, yang dapat menguntungkan dalam studi farmakokinetik klinis. Pada metode lain memerlukan 1,5 atau 1 ml plasma.

Tabel 2 Presisi dan akurasi FL plasma dan urin (n = 5)

Tabel 3 Recovery FL dari plasma dan urin sampel (n = 7)

Gambar. 5. Profil konsentrasi plasma-waktu FL dalam relawan sehat setelah penggunaan oral dosis tunggal 50 mg

Gambar. 6. Ekskresi Kumulatif FL dalam urin dari sukarelawan yang sehat penggunaan oral dosis tunggal 50 mg

Tabel 4 Parameter farmakokinetik untuk FL di relawan yang sehat

BAB IV KESIMPULAN

Sebagai

kesimpulan,

metode

HPLC

baru

telah

dikembangkan

dengan

reproduktifitas dan sensitivitas tinggi untuk penentuan FL dalam penelitian ini. Menurut penelitian, FL telah diderivatisasi dengan NQS dan ditentukan dengan menggunakan detektor UV-Vis untuk pertama kalinya. Metode HPLC digambarkan menggunakan ekstraksi cair-cair untuk persiapan sampel dan kuantifikasi FL dalam plasma manusia dan sampel urin. Data validasi menunjukkan presisi dan akurasi yang baik. Pengujian ini dapat dikatakan reprodusibel dan akurat. Sebagai kesimpulan, penelitian ini menjelaskan sensitifitas dan akurasi metode HPLC untuk kuantifikasi FL yang dapat memonitor konsentrasi plasma selama studi klinis farmakokinetik pada manusia.

PUSTAKA

T.U. Sevgi,. 2006. HPLC method for the determination of fluvoxamine in human plasma and urine for application to pharmacokinetic studies. Instambul: Department of Analytical Chemistry

LAMPIRAN