Bakteri Transformasi

Keseluruhan Gambar
pMSH1 Transformasi
Penyisipan G / MmSOD gen ke dalam Escherichia DH5a E.

Plasmid
Plasmid
kecil (1-1000 kb)
melingkar
Extrachromosomal
DNA

Pertumbuhan adalah independen dari siklus sel inang; amplifikasi produk gen
Jenis vektor kloning digunakan untuk membawa gen tidak ditemukan dalam kromosom inang
bakteri yang

Mengapa Plasmid adalah Vektor Kloning Baik
kecil ukuran (mudah untuk memanipulasi dan mengisolasi)
melingkar (lebih stabil)
independen dari replikasi sel inang
beberapa salinan mungkin ada (memfasilitasi replikasi)
sering memiliki ketahanan antibodi (deteksi mudah)


Transformasi
Proses mentransfer fragmen DNA asing ke dalam sel (host) penerima untuk pertumbuhan dan
replikasi
sel inang kami: DH5a E. coli
DNA asing kami: G & MmSOD (yang terkandung dalam pMSH1 plasmid)


Keseluruhan Proses Transformasi
1. Vektor plasmid harus dipotong dengan endonuklease restriksi (enzim restriksi)
2. DNA ligase bergabung dengan fragmen DNA & DNA vektor
3. Sel inang dibuat kompeten sehingga dapat plasmid dapat memasukkan
4. Sel kompeten adalah mereka mampu mengambil plasmid
5. Umumnya terjadi melalui kejutan panas dan penambahan kation divalen untuk permeabilize
membran
6. Sel berubah tumbuh pada media seleksi

Transformasi produk ligasi
Proses mentransfer DNA ke dalam sel eksogen adalah panggilan "transformasi"
Pada dasarnya ada dua metode umum untuk mengubah bakteri. Yang pertama adalah metode
kimia menggunakan CaCl2 dan kejutan panas untuk mempromosikan masuknya DNA ke dalam sel.
Metode kedua disebut elektroporasi berdasarkan gelombang pendek muatan listrik untuk
memfasilitasi penyerapan DNA.


Kompeten sel persiapan
Pilih koloni tunggal dari E. coli DH5 sebuah
Tumbuh dalam media LB tanpa antibiotik; menetaskan
pada 37 C 12 - 16 jam
Pada keesokan harinya menyegarkan budaya sampai
OD600 0,5 (sekitar 2 jam)
Terus es 10 '
Panen sel dengan sentrifugasi (5000 rpm 10 ')
Resuspend dalam 495 ml TFB dingin 10 'di atas es
Centrifuse (5000 rpm 10 ')
Resuspend di 125 ml es dingin TFB + 8,8 ml DMSO 10 '

Transformasi
Tambahkan 10 ml campuran ligasi ke sel kompeten, campur lembut, dan menetaskan di atas es
selama 30 menit.
2. Keluarkan tabung dari es dan segera menempatkan mereka di blok C 42 panas selama 45 detik.
Kembali tabung untuk es dan menetaskan selama 5 menit.
3. Tambahkan 1 mL media 2YT ke sel, (transfer ke
elang tabung steril), dan menetaskan pada 37 C (dengan gemetar) selama satu jam.
4. Lempeng budaya seluruh (100 ml, 75 ml dan 50 ml setiap piring) di piring LB yang mengandung
antibiotik yang tepat
5. Menetaskan semalam pada 37 C

Transformasi oleh elektroporasi
Campur reaksi transformasi:
Pertumbuhan di piring agar-agar


Seleksi
Sebuah media selektif digunakan untuk menentukan mana sel-sel bakteri mengandung
memasukkan plasmid resisten antibiotik dan yang tidak
Sebagai contoh, bakteri yang mengandung plasmid dengan resistensi terhadap antibiotik
tertentu (kanamisin dan higromisin) akan tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik yang


Beberapa kemungkinan produk dari reaksi transformasi:
Seleksi Media

Skrining rekombinan
Pada contoh di atas, koloni tidak berarti keberadaan DNA rekombinan dalam plasmid.

Transformasi sukses
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Hasil dan Kualitas DNA Plasmid
jumlah Plasmid salinan
Hosti regangan digunakan
Budaya media, seleksi, dan budaya waktu
Ingin panen selama fase log pertumbuhan

Transformasi Aplikasi