Laporan Praktikum Nama : Syahdiana Saragih Mikrobiologi Nim : J3L111003 Kelas : KIM A/P2 Kelompok : 1( Satu) Hari/Tanggal : Rabu, 23 Oktober 2013 Waktu : 13.00-16.20 WIB PJP : Harry Noviardi, M.SI Asisten : Ramdhani Yeny Anggraini Yesi septiani
PEWARNAAN GRAM DAN PEWARNAAN SPORA PADA BACILLUS DAN ESCHERCIA COLI
ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2013
Pendahuluan Mikroorganisme yag ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat- sifat yang khas, begitu juga dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasikan ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. ( Volt W A. Dan Margaret F W 1989). Pewarna gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasikan bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah erfiksasi dikenai larutan-larutan berikut :zat pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol, dan zat pewarna tandinganberupa zat warna safranin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Christian Gram (1853- 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884, untuk membedakan antara pneumokokus danklebsiella pneumonieae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positig dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci denan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air safranin akan tampak berwarna merah. Perbedan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dindingselnya ( pelezar M J 1989). Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan costridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisi secara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal ( letak spora diantara ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) ( Dwidjoseputro, 2005). Tujuan Praktikum bertujuan untuk mengetahui cara pewarnaan gram dan spora serta mengetahui jenis gram dan ada tidaknya spora pada Escherchia Coli dan Bacillus. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini ialah mikroskop, kaca objek, pipet tetes, kawat ose, pembakar spirtus, gelas piala, kasa asbes, botol semprot dan hot plate. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini ialah biakan bakteri Escherchia Colidan Bacillus, alkohol, kristal ungu, larutan iodin, safranin, malacite green, kertas serap dan aquades. Prosedur kerja Pewarnaan Gram dilakukan dengan biakan bakteri diambil dengan kawat ose dan dioleskan di kaca objek, dan dibiarkan kering. Kemudian setelah kering difiksasi di atas pembakar spirtus hingga bakteri melekat pada kaca objek yang ditandai dengan bakteri yang berwarna keruh. Setelah itu bakteri ditetesi larutan kristal ungu selama kurang lebih satu menit, dan dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah kering bakteri kemudian ditetesi iodin kurang lebih 1 menit, dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah kering bakteri ditetesi alkohol selama kurang lebih 30 detik, dan dicuci kembali dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah dicuci dan dikeringkan, ditetesi safranin selama 30 detik, kemudian dicuci dan dikeringkan menggunakan kertas serap, setelah itu diamati dengan perbesaran 1000X. Pewarnaan spora dilakukan dengan biakan bakteri diambil dengan kawat ose dan dioleskan di kaca objek. Dan dibiarkan sampai kering, setelah kering kemudian difiksasi di atas pembakar spirtus hingga bakteri melekat pada kaca objek yang ditandai dengan bakteri yang berwarna keruh. Bakteri kemudian ditetesi malacite green dan diuapkan di atas penangas air 2 sampai 3 menit, setelah dingin dicuci dengan aquades. Kemudian bakteri ditetesi safranin selama kurang lebih 30 detik, setelah itu dibilas, dan dikeringkan dengan kertas serap, kemudian diamati dengan perbesaran 1000X. Data dan Hasil Pembahasan Berdasarkan hasil pengamatan didapat data seperti yang terlihan pada tabel berikut ini : Tabel 1 Pewarnaan gram pada bakteri Bakteri Gram (+/-) Warna Escherchia Coli - Merah muda Bacillus + Ungu
Gambar 1 pewarnaan gram pada bakteri bacillis sp
Gambar 2 pewarnaan gram pada bakteri Escherchia Coli Tabel 2 Pewarnaan spora bada bakteri Bacillus Bakteri Gram (+/-) Warna Bacillus + Merah muda
Gambar 3 hasil pewarnaan spora pada bakteri bacillus sp Pembahasan Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati (Karmana 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup. Pada praktikum kali ini dilakukan dua teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri dan pewarnaan pada spora. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan tujuan agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan mikroorganisme di kaca preparat. Pemberian Kristal ungu bertujuan untuk memberi warna pada bakteri. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 96% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian safranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol.Pada bakteri di preparat menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri gram positif dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan safranin. Hasil uji bakteri E-Colli dan bakteri agar miring atau Bacillus spdapat mempertahankan warna primernya walaupun mengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan alkohol sehingga bakteri E-Colli dan bakteri Bacillus sp merupakan kelompok bakteri gram positif.Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjosapuro 2005). Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas. Preparat diuapkan diatas air mendidih dengan tujuan untuk memperbesar pori-pori bakteri agar pada saat pewarnaan dapat menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air dialirkan dari atas, yang bertujuanuntuk menghilangkan malacite green dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaan safranin bertujuan untuk counterstein yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain dari pada endospora. Hasil uji bakteri Bacillus sp menghasilkan bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat warna malachite green dansafranin dimana pada hasil pewarnaan akan menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah pada sel vegatitifnya (Lay 1994). Simpulan Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa bakteri gram positif terdapat pada bakteri Bacillus sp karena gram positif dapat mempertahankan warna awalnaya.sedangkan gram negatifnya terdapat pada bakteri E-Colli, karena gram negatif kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol. Daftar pustaka Dwidjoseputro.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia Karmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media Pratama Lay.1994.Mikrobiologi Umum.Herna,Penerjemah.Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: General Microbiology. Pelezar chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta Margareth F W. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga