Produksi, Pemurnian, dan Karakterisasi

Pektinase dari Bacillus sp. DT17

1)
Fhani Meliana

1206212413, Teknologi Bioproses

ABSTRAK
Pektinase atau dikenal sebagai poligalatrunase adalah suatu enzim yang memiliki kemampuan
untuk memecah dan mentransformasi pektin. Pektin adalah zat yang menstabilisasi dinding sel
pada sel tanaman. Beberapa buah membentuk pektin selama periode pembuahan. Dalam produksi
pektin secara ekstraseluler, ditemukan bakteri Bacillus sp. DT 17 dapat memproduksi pektin dan
telah dikarakteristik sebagai pektin liase (EC.4.2.2.10).

Keyword: presipitasi, SDS Page, pektinase, purifikasi, ion exchange chromatography, gel filtration
chromatography

Deksripsi Pektinase
Pektinase digunakan untuk mengkatalis
degradasi polimer pektin yang terdapat pada
dinding sel tanaman (Fogarty & Kelly, 1982).
Pektinase diproduksi oleh beberapa
organisme seperti bakteri (Hirokoshi, 1972;
Karbassi & Vaughn 1980), jamur (Aguilar &
Huitron 1990) dan kapang (Gainvors & Belarbi
1993). Pada produksi pektinase, isolat yang
digunakan adalah isolat tanah dan
mengisolasi Bacillus mesofilik yang
memproduksi alkalofilik dan pektinase
termotoleran. Melalui optimasi kondisi
pertumbuhan, Bacillus sp. DT 17 dapat
memproduksi jumlah pektin liase lebih tinggi
(53 unit/ml) dibandingkan dengan literatur
yang lain. Menggunakan gel filtration dan ion
exchange cromatography, enzim pektin
dipurifikasi dan ditemukan massa molekulnya
yaitu 106 kDa. Enzim pektinase yang telah
dimurnikan menunjukkan aktivitas maksimal
pada suhu 60
0
C dan pH 8.0. Keberadaan
konsentrasi 100 mM CaCl
2
dan
mercaptoethanol secara signifikan
meningkatkan aktivitas enzim yang telah
dimurnikan. Pektinase memiliki lahan aplikasi
yang luas pada industri tekstil, penanganan
limbah buah. Enzim ini dimurnikan sehingga
homogen dan berpotensi untuk digunakan
pada level komersial.
Proses Pemunian
Pada proses pemurnian secara umum,
tahapan yang harus dilalui adalah Recovery,
Isolation, Purification, dan Polishing. Pada
pemurnian pektinase, Bacillus sp.DT7 diisolasi
pada isolat tanah kemudian masuk ke tahap
purifikasi. Pektinase dari Bacillus sp DT7
dimurnikan pada 1 liter YEP culture broth
(kondisi pertumbuhan 37
0
C dalam 17 jam).
Kemudian disaturasi menggunakan (NH
4
)SO
4

kemudian dibagi dua yaitu saturasi 0-40%
dan 40-100%.
Presipitasi
Presipitat dilarutkan pada jumlah minimum
buffer Tris HCl (0.01 M, pH 7.5) dan didialisis
pada buffer yang sama. Metode untuk
membuat protein terpresipitasi dengan
mengubah sifat pelarut sehinga
mempengaruhi kelarutan protein. Presipitat
protein merupakan molekul-molekul protein
yang teragregasi cukup besar untuk dapat
terlihat.

Gambar 1. Presipitasi Protein
(Sumber: Kashyap, 2000)
Ion Exchange Chromatography
Anion Exchanger, DEAE Sephacel disusun
menjadi kolom kaca, dan kolom
disetimbangkan dengan buffer Tris HCl (10
mM, pH 7.5) dan dimasukkan sample
sebanyak 3 ml. Kolom dicuci dengan buffer
Tris - HCl yang berisi NaCl berbagai
konsentrasi 0, 50, 100, dan 150 mM.
Kemudian fraksi diambil pada volume 2,5 ml
lalu fraksi protein diukur melalui
spektrofotometri pada 280 nm dan aktivitas
pectinase diuji.

Gambar 2. Purifikasi pektinase menggunakan
ion exchange chromatography
(Sumber: Kashyap, 2000)

Gel Filtration Chromatography
Kolom kaca disusun dengan Sephadex G 150
(35 x 1,5 cm, volume bed 60 ml). Sample
dimasukkan pada kolom ini dan elusi protein
dilakukan dengan buffer Tris HCl (10 mM,
pH 7,5). Setelah volume kekosongan (20 ml),
diambIil fraksi 1,5 ml. Absorbansi sample
protein dan aktivitas pektinase diteliti
menggunakan metode yang telah dijelaskan.
Pemurnian Pektinase
Pektinase dari Bacillus sp. DT7 dimurnikan
menjadi homogen melalui beberapa langkah.
Pertama dimurnikan secara parsial dengan
penambahan padatan ammonium sulfat ke
supernatant. Kemudian dilakukan salting,
kemudian aktivitas pektinase ditemukan
pada fraksi saturasi garam 40 100%.
Selanjutnya protein dielusi dengan NaCl
bergradien 0 2 M. Kebanyakan protein
memiliki 2 peak besar namun pektinase
dideteksi hanya pada fraksi pertama.
Menggunakan DEAE Sephacel
cromatography pemurnian 67,2 lipatan dari
enzim telah dicapai dan aktivitas spesifiknya
menjadi 730 U/mg. Kemudian konsentrasi
diolah lebih lanjut dan protein dielusi dengan
buffer Tris HCl pH 7,5. Aktivitas pektibase
dideteksi pada fraksi 21 30, fraksi ini
disatukan, dikonsentrasikan dan didialisis
terhadap 0.01 M buffer Tris HCl. Fase
purifikasi ini mengahasilkan pemurnian 131.8
lipatan pektinase dan aktivitas spesifiknya
menjadi meningkat mencapai 1433 U/mg
protein.

Gambar 3. Profil elusi protein dan aktivitas
pektinase pada Sephandex G150.
(Sumber: Kashyap, 2000)

SDS Page
Deteksi aktivitas pektinase pada fraksi 21 30
menghasilkan bahwa enzim ini memiliki berat
molekul yang tinggi. Ketika pektinase yang
telah dimurnikan menggunakan
elektroforesis 10% SDS Page, pita tunggal
diamati dan mengindikasikan pemurnian
protein telah selesai. Menggunakan protein
standard, ukuran enzim yang telah
dimurnikan berada pada kisaran 106 kDa atau
lebih tinggi dari pektinase dari Fusarium
oxysporium (58 kDa), Penicillium frequentans
(20 kDa) dan Bacillus stearothermophillus (24
kDa) (Karbassi & Vaughn 1980).

Gambar 4. SDS Page dari pektinase pada 10%
gel, 50 V.
Jalur 1: berat molekul protein standard, jalur
2: ammonium sulfat mempresipitasi protein,
jalur 3: DEAE-Sephacel mengelusi, dan jalur
4L Sephadex G150
(Sumber: Kashyap, 2000)

REFERENSI
D. R. Kashyap, S. Chandra, A. Kaul and R.
Tewari. 2000. Production, purification, and
charaterization of pectinase from Bacillus sp.
DT7. India. Departement of Microbiology,
Panjab University, India.