RINGKASAN BUKU KULTUR SEL

CELL CULTURE BASICS

Kelompok II:

Alifah Ismawati

(1206212382)

Chandra Dwi Prakoso

(1206212445)

Farisa Imansari

(1206212426)

Fhani Meliana

(1206212413)

Firnanda Rizky Riasta

(1206212464)

Maylina Chandra

(1206212451)

Ramadhan Iskandar

(1206212400)

Sandra Monica

(1206212432)

Sri Dwi Aryani

(1206212395)

Teknologi Bioproses
Departemen Teknik Kimia
Fakultas Teknik Universitas Indonesia
Desember 2014

Daftar Isi

Teknik Aseptik.................................................................................................................... 2
Pendahuluan................................................................................................................... 2
Area Kerja yang Steril.................................................................................................... 2
Kesterilan Pribadi........................................................................................................... 3
Reagen Steril dan Media................................................................................................ 3
Penanganan Steril........................................................................................................... 3
Daftar Periksa Teknik Aseptik.......................................................................................... 4
Area Kerja....................................................................................................................... 4
Kebersihan Pribadi.......................................................................................................... 4
Reagen dan Media.......................................................................................................... 4
Penanganan..................................................................................................................... 5
Kontaminan Biologis........................................................................................................... 5
Pendahuluan................................................................................................................... 5
Bakteri............................................................................................................................ 6
Yeast............................................................................................................................... 6
Kapang............................................................................................................................ 7
Virus............................................................................................................................... 8
Mikoplasma.................................................................................................................... 8
Kontaminasi Silang........................................................................................................ 9
Penggunaan Antibiotik................................................................................................... 9

Teknik Aseptik
Pendahuluan
Kesuksesan dari kultur sel bergantung pada besarnya usaha untuk menjaga sel bersih dari
kontaminasi oleh mikroorganisme seperti bakteri, jamus, dan virus. Suplai, medium, dan
pereaksi yang tidak steril, serta partikel udara yang mengandung mikroorganisme, inkubator
yang tidak bersih, dan permukaan kerja yang kotor merupakan sumber-sumber kontaminasi
biologi.

Teknik aseptik, didesain untuk memberikan penghalang antara mikroorganisme pada

lingkungan dan kultur sel yang steril, bergantung atas seperangkat prosedur untuk mengurangi
kemungkinan terjadinya kontaminasi dari sumber-sumber tersebut. Elemen dari teknik aseptik
yaitu area kerja yang steril, kebersihan personal yang baik, pereaksi dan media yang steril, dan
penanganan pengerjaan yang steril.

Area Kerja yang Steril

Cara yang paling simpel dan paling murah untuk mengurangi kontaminasi dari partikel udara
dan aerosol (contohnya debu, spora, kulit yang berganti, bersin) adalah dengan menggunakan
tudung sel kultur.

Tudung kultur sel harus disiapkan secara tepat dan ditempatkan di area yang membatasi
sel kultur bebas dari aliran udara yang bersumber dari pintu, jendela, dan peralatan
lainnya, dan tanpa melaluinya.

Permukaan kerja harus rapi dan hanya berisi alat-alat yang dibutuhkan pada prosedur;
juga tidak boleh digunakan sebagai area penyimpanan.

Sebelum dan sesudah pengerjaan, permukaan kerja harus melalui proses disinfeksi,
dan area sekeliling dan peralatan harus dibersihkan secara rutin.

Untuk pembersihan rutin, lap permukaan kerja dengan menggunakan 70% etanol
sebelum dan ketika melakukan pengerjaan, terutama setelah terjadi pertumpahan.

Anda juga bisa menggunakan sinar ultraviolet untuk mensterilkan udara dan mengenai
permukaan di dalam tudung sel kultur saat menggunakan.

Menggunakan pemanaas Bunsen untuk membakar tidak diperlukan dan tidak

direkomedasikan pada tudung sel kultur.

Biarkan tudung sel kultur dijalankan setiap saat, matikan hanya ketika tidak akan
digunakan pada waktu yang lama.
2

Kesterilan Pribadi

Cuci tanganmu sebelum dan sesudah bekerja dengan kultur sel.

Selain

untuk

melindungimu

dari

bahan

berbahaya,

menggunakan alat pelindung diri juga mengurangi kemungkinan

kontaminasi dari ganti kulit serta kotoran dan debu dari pakaian
anda

Reagen Steril dan Media

Reagen komersial dan media melalui kualitas kontrol yang ketat

untuk memastikan sterilisasinya, tapi mereka dapat menjadi
terkontaminasi saat penanganan. Ikuti petunjuk dibawah untuk
penanganan sterilisasi untuk mencegah kontaminasi mereka.
Selalu mensterilkan setiap reagen, media, atau larutan yang
disiapkan di laboratorium menggunakan prosedur sterilisasi
(misalnya autoklaf, filter sterilisasi).

Penanganan Steril

Selalu bersihkan tangan Anda dan tempat kerja Anda dengan

70% etanol.

Lap bagian luar wadah, labu, plat, dan piring dengan 70%
etanol sebelum menempatkan mereka dalam kap kultur sel

Hindari media dan reagen mengalir langsung dari botol atau

labu.

Menggunakan kaca steril atau pipet plastik sekali pakai dan

pipettor untuk bekerja dengan cairan, dan menggunakan
setiap pipet hanya sekali untuk menghindari kontaminasi
silang. Jangan membuka bungkus pipet steril sampai mereka
akan digunakan. Jauhkan pipet di area kerja Anda.

Selalu tutup botol dan labu setelah digunakan dan segel plat
multi-baik dengan selotip atau menempatkan mereka dalam
kantong

dapat

ditutup

kembali

untuk

mencegah

mikroorganisme dan kontaminan airborn dari memperoleh

masukan
-

Jangan membuka tabung steril, botol, cawan petri, dll sampai

anda

siap

untuk

menggunakannya

dan

jangan
3

membiarkannya terbuka ke lingkungan. Kembali tutup

segera setelah anda selesai.
-

Jika anda mengangkat cap atau penutup, maka harus

meletakkannya di permukaan kerja, letakkan tutup dengan
pembuka menghadap ke bawah

Gunakan hanya gelas steril dan peralatan lainnya.

Hati-hati untuk tidak berbicara, bernyanyi, atau bersiul

ketika Anda melakukan prosedur steril.

Lakukan

percobaan

Anda

secepat

mungkin

untuk

meminimalkan kontaminasi.

Daftar Periksa Teknik Aseptik

Checklist berikut menyediakan daftar singkat petunjuk dan prosedur untuk memandu kita
mencapai sebuah teknik aseptic yang solid. Untuk tinjauan mendalam teknik aseptik, mengacu
pada Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Freshney, 2000).
Area Kerja
Apakah penutup kultur sel sudah diatur secara benar?
Apakah penutup kultur sel berada pada area yang bebas draft dan lalu lintas?
Apakah permukaan area kerja sudah dirapikan, dan apakah area tersebut hanya
berisi item-item yang diperlukan untuk eksperimen?
Apakah permukaan area kerja sudah diseka dengan etanol 70% sebelum bekerja?
Apakah Anda secara rutin membersihkan dan mensterilisasi inkubator, pendingin,
lemari es, dan peralatan laboratorium lainnya?
Kebersihan Pribadi
Sudahkan Anda mencuci tangan?
Apakah Anda memakai peralatan pelindung personal?
Jika Anda memiliki rambut yang panjang, sudahkah diikat ke belakang?
Apakah Anda menggunakan sebuah pipet untuk pekerjaan dengan liquid?
Reagen dan Media
Apakah Anda mensterilkan setiap reagen, media, dan larutan yang telah Anda
siapkan di laboratorium menggunakan prosedur yang sesuai?

Apakah Anda membersihkan bagian luar botol, labu, dan pelat dengan etanol 70%
sebelum menempatkannya di permukaan kerja Anda?
Apakah semua botol, labu, dan wadah lainnya tertutup saat tidak digunakan?
Apakah semua pelat disimpan dalam kantong steril yang dapat ditutup kembali?
Apakah reagen Anda terlihat keruh? Terkontaminasi? Apakah mereka
mengandung partikel mengambang? Memiliki bau busuk? Warna yang tidak
biasa? Jika ya, apakah Anda mendekontaminasi dan membuangnya?
Penanganan
Apakah Anda bekerja perlahan dan berhati-hati, sadar akan teknik aseptik?
Apakah Anda membersihkan permukaan dari semua item termasuk pipettor, botol,
dan labu dengan etanol 70% sebelum menempatkan mereka dalam kap kultur sel?
Apakah menempatkan penutup secara terbalik pada area kerja?
Apakah Anda menggunakan pipet kaca steril atau pipet plastik steril sekali pakai
untuk menggunakan semua cairan?
Apakah Anda menggunakan pipet steril hanya sekali untuk menghindari
kontaminasi silang?
Apakah Anda berhati-hati untuk tidak menyentuh ujung pipet apapun yang tidak
steril, termasuk tepi luar uliran botol?
Apakah Anda segera mengepel tumpahan, dan membersihkan area tersebut dengan
etanol 70%?

Kontaminan Biologis
Pendahuluan
Kontaminasi dari kultur sel ini merupakan masalah yang paling umum yang ditemui di
laboratorium kultur sel, kadang-kadang dengan konsekuensi yang sangat serius. Kontaminan
kultur sel dapat dibagi ke dalam dua kategori utama, kontaminan kimia seperti pengotor dalam
medium, sera, dan air, endotoksin, pemberi elastis, dan deterjen, kontaminan biologis seperti
bakteri, molds, ragi, virus, mycoplasma, serta kontaminasi silang oleh sel lini lainnya.
Sementara tidak mungkin untuk menghilangkan kontaminasi sepenuhnya, namun mungkin
untuk mengurangi frekuensinya dan dampaknya dengan mengetahui sumber dari kontaminan
dan dengan mengikuti prosedur teknik aseptic. Bagian ini menjelaskan tipe-tipe dari
kontaminasi biologis.
5

Bakteri
Bakteri merupakan mikroorganisme yang besar dan bersel tunggal yang ada di mana-mana.
Mereka biasanya memiliki diameter beberapa mikrometer, dan dapat memiliki variasi bentuk,
mulai dari bentuk bola hingga batang dan spiral. Karena kehadiran mereka, ukuran, dan tingkat
pertumbuhan dan cepat, bakteri bersama dengan ragi dan jamur merupakan kontaminan
biologis yang paling sering ditemui dalam kultur sel. Kontaminasi bakteri dapat dideteksi
melalui inspeksi visual dari kultur selama beberapa hari sehingga kemudian menjadi terinfeksi,
kultur yang telah terinfeksi biasanya tampak keruh, kadang-kadang terdapat lapisan tipis pada
bagian permukaan. Penurunan Ph secara tiba-tiba pada medium kultur juga kerap ditemui.
Dengan kemampuan mikroskop yang rendah, bakteri muncul seperti butiran kecil yang
bergerak diantara sel dan pengamatan dengan mikroskop resolusi tinggi dapat memberikan
informasi bentuk dari bakteri. Gambar di bawah menunjukkan 293 kultur sel yang
terkontaminasi oleh E.coli.

Gambar 2.2 Gambar kontras fase simulasi 293 sel terkontaminasi E. coli. Ruang antara selsel terlihat kecil, butiran berkilauan di bawah mikroskop daya rendah, tetapi bakteri individu
tidak mudah dibedakan (panel A). Pembesaran lebih lanjut dari daerah tertutup oleh kotak
hitam memisahkan sel individu E. coli, yang biasanya berbentuk batang dan memiliki panjang
sekitar 2 m dan diameter 0,5 m. Setiap sisi kotak hitam di panel A adalah 100 m.

Yeast
Yeast merupakan mikroorganisme eukariotik uniseluler yang termasuk dalam kingdom fungi,
ukurannya mulai dari beberapa mikrometer (biasanya) sampai 40 mikrometer (jarang). Sama
6

seperti kontaminasi yang diakibatkan bakteri, kontaminasi yang diakibatkan jamur juga
mengakibatkan kultur menjadi keruh, terutama terjadi ketika kontaminasi tingkat lanjut.
Terdapat perubahan pH ketika kultur terkontaminasi oleh yeast, pada awal kontaminasi tidak
terjadi perubahan pH. Ketika kultur bertambah beratnya, maka perubahan pH mulai terjadi.
Pada keadaan mikroskopis, yeast berbentuk bulat atau spherical particles.
Gambar dibawah ini menunjukkan kultur 293 sel yang terinfeksi yeast pada waktu 24 jam
setelah plating.

Gambar 2.3 Gambar simulasi fase kontras dari 293 sel kultur yang terkontaminasi yeast. Yeast
pengkontaminasi terlihat sebagai partikel kosong, mengerucut menjadi partikel lebih kecil saat
mereka bereplikasi.

Kapang
Kapang merupakan organisme eukariotik, termasuk dalam kingdom fungi yang tumbuh dengan
mikrofilamen multiseluler yang disebut dengan hyphae (hifa). Didalam mikrofilamen ini
terdapat nukleus yang mengandung gen-gen identik yang disebut mycelium (miselium). Sama
seperti kontaminasi yang terjadi akibat yeast, kontaminasi akibat kapang pun dapat
7

meningkatkan pH. Pada tahap awal kontaminasi, pH akan stabil. Ketika berat kultur meningkat,
terjadi peningkatan pH juga pada kultur hingga merubah kultur menjadi lebih keruh.
Pada keadaan mikroskopis, miselium terlihat sangat tipis, filamen terlihat hanya seuntai dan
terkadang seperti rumput yang penuh dengan spora. Ketika pada fase dorman kapang, spora
dari kapang dapat bertahan hidup pada lingkungan yang keras dan tidak sesuai dengan
pertumbuhan mereka. Spora tersebut akan aktif ketika menemui kondisi yang tepat untuk
pertumbuhannya.

Virus
Virus adalah agen penginfeksi mikroskopok yang mengambil alih aktivitas sel inang untuk
bereproduksi. Ukuran virus yang sangat kecil membuat mereka sangat sulit untuk dideteksi
dalam kultur dan untuk mengeluarkannya dari reagen yang digunakan dalam laboratorium
kultur sel. Karena kebanyakan virus memiliki memiliki keketatan tinggi untuk inang, mereka
biasanya tidak berpengaruh terhadap sel dalam kultur selain sel inangnya. Bagaimanapun,
menggunakan kultur sel yang terinfeksi virus dapat menghadirkan resiko kesehatan serius
terhadap personil laboratorium, terutama jika kultur tersebut adalah sel manusia atau primata.
Infeksi virus pada kultur sel dapat dideteksi dengan mikroskop elektron, immunostaining
dengan antibodi, uji ELISA atau PCR dengan primer virus yang sesuai.

Mikoplasma
Mikoplasma adalah bakteri sederhana yang miskin akan dinding sel dan mereka dianggap
sebagai organisme pereplikasi diri terkecil. Karena ukurannya yang sangat kecil (umumnya
kurang dari satu micrometer), mikoplasma sangat sulit dideteksi sampai mereka mendapatkan
kepadatan yang sangat tinggi dan menyebabkan kultur sel memburuk; hingga kini mereka
sering tidak terlihat menunjukkan infeksi. Beberapa mikoplasma dengan pertumbuhan lambat
mungkin bertahan didalam kultur sel tanpa menyebabkan kematian sel, tetapi mereka dapat
mengubah perilaku dan metabolisme sel inang dalam kultur. Infeksi mikoplasma kronis
mungkin menunjukkan diri mereka dengan pengurangan laju ploriferasi sel, pengurangan
densitas kejenuhan, dan penggumpalan dalam kultur suspense. Bagaimanapun, satu-satunya
cara terjamin untuk mendeteksi kontaminasi mikoplasma adalah dengan pengujian kultur
terperiode menggunakan pewarnaan fluoresens (contoh:Hoechst 33258), ELISA, PCR,
immunostaining, autoiradiography atau uji mikrobiologi.
8

Gambar 2.4. Fotomikrografi sel kultur bebas mikoplasma (bingkai A) dan sel terinfeksi
dengan mikoplasma (bingkai B dan C). kultur diuji menggunakan MycoFluorTM Mycoplamsa
Detection Kit, mengikuti protocol kit. Dalam sel yang diinfeksi dengan mikoplasma, reagen
MycoFluorTM mewarnai inti dan mikoplasma, tetapi intensitas relatif fluoresens inti kabur pada
mikoplasma atau dekat inti. Bagaimanapun, mikoplasma terpisah dari inti terang sudah terlihat
(bingkai B). Dalam sel hidup, reagen V tidak bias mengakses ke inti tetapi siap mewarnai
mikoplasma yang berasosiasi dengan luar sel (bingkai C). Gambar diatas didapatkan
menggunakan eksitasi 365 nm dan 100/1,3 Plan Neoflaur pasangan lensa objektif dengan
45030 nm filter bandpass.

Kontaminasi Silang
Walaupun tidak lazim seperti halnya kontaminasi mikrobial, kontaminasi silang yang luas dari
banyak sel lini dengan HeLa dan sel lini lain yang bertumbuh dengan cepat merupakan sebuah
masalah yang terbentuk dengan akibat yang serius. Mendapatkan sel lini dari pustaka sel yang
mempunyai reputasi yang baik, secara periodik memeriksa karakteristik sel lini, dan melakukan
teknik aseptik yang baik merupakan langkah-langkah yang dapat membantu untuk
menghindari kontaminasi silang. Melakukan DNA fingerprinting, analisis karyotype, dan
isotype dapat memastikan ada atau tidaknya kontaminasi silang pada kultur sel yang kita
lakukan.

Penggunaan Antibiotik
Antibiotik tidak boleh digunakan secara rutin pada kultur sel, karena penggunaannya yang
secara berkelanjutan akan mendorong pembentukan strain yang resisten terhadap antibiotik
9

dan memberikan kontaminasi rendah untuk waktu lama, yang dapat berkembang menjadi
kontaminasi keseluruhan segera sesudah antibiotik tersebut dihilangkan dari media, dan
mungkin dapat menyembunyikan infeksi mycoplasma dan kontaminan lain yang samar. Lebih
jauh lagi, beberapa antibiotik kemungkinan besar dapat bereaksi silang dengan sel dan
mengganggu proses seluler yang berada dibawah pengamatan.
Antibiotik hanya boleh digunakan ketika terpaksa dan hanya dalam penggunaan jangka
pendek, dan harus dihilangkan sesegera mungkin. Jika penggunannya dalam jangka
panjang, kultur yang bebas antibiotik harus dijaga secara bersamaan sebagai kontrol untuk
infeksi yang samar.

10