TEST SEROLOGI :

DEMAM TIFOID
&
DEMAM DENGUE
E. M. Hidayat, SpPK
Dep. Patologi Klinik FKUPNVJ

DEMAM TIFOID
Pendahuluan
Demam tifoid : demam yang
ditimbulkan oleh infeksi
beberapa Salmonella (S. paratyphi A, S. paratyphi B, S.
paratyphi C), khususnya
Salmonella typhi (S.typhi).

Pendahuluan (lanjutan)

Gejala demam tifoid

Biasanya mengenai di saluran
cerna
Gejala demam > satu minggu,
Gangguan pencernaan (seperti
konstipasi).
Gangguan kesadaran (pada
penderita sakit berat).

Pendahuluan (lanjutan)

Masa inkubasi 10 14 hari, disertai

gejala sakit kepala, lemah,
konstipasi, bradikardia dan mialgia.
Hallmark : demam berlangsung
lama (prolonged and persistent
fever) selama 4 8 minggu pada
penderita yang tidak diobati.

Pendahuluan (lanjutan)

Di Indonesia : penyakit endemik,

berhubungan dengan :
tingkat kesehatan,
tingkat pengetahuan tentang kesehatan
sanitasi yang buruk.
Penyulit pemberantasan penyakit ini :
adanya pembawa kuman yang sehat
(carrier), dimana fecal-carrier paling
penting.

Pendahuluan (lanjutan)

Diperkirakan 10% penderita yang

sudah sembuh, dalam 3 bulan
pertama selalu mengeluarkan
kuman melalui tinja dan urin
2 5% penderita yang sembuh
akan menjadi permanent-carrier.

Etiologi
Salmonella typhi : basil Gram (-)
bersifat aerobik, tidak berspora,
bergerak dengan rambut getar.
Memiliki 3 macam antigen
Antigen O (somatik), sering disebut
endotoksin.
Antigen H (flagela)
Antigen Vi (antigen permukaan)

Patogenesis
Salmonella typhi masuk melalui
mulut bersama makanan atau
minuman yang tercemar.
kuman menembus mukosa usus,
masuk aliran limfe usus, berbiak
dan akhirnya masuk peredaran
darah melalui ductus thoracicus.

Patogenesis (lanjutan)

Bakteriemia I terjadi 24 72 jam setelah

kuman masuk.
mencapai organ-organ seperti hati,
empedu, limpa, sumsum tulang dan ginjal.
Bakteriemia ini berlangsung singkat akibat
fagositosis oleh makrofag,
masih terus berkembang di organ tertentu
(empedu) karena ada kapsel Vi.
Proses ini memerlukan waktu 7 10 hari.

Patogenesis (lanjutan)

Dari kandung empedu, kembali ke usus

halus dan jaringan getah bening, terutama
plaque Peyer.
menimbulkan reaksi peradangan,
hiperplasia dan infiltrasi sel mononuklear,
kemudian kuman kembali masuk ke
sirkulasi darah lagi (bakteriemia II).
Pada bakteriemia II dilepaskan endotoksin.

Pemeriksaan laboratorium

Darah tepi
Anemia normositik normokrom
Leukopenia (3.000 4.000/uL) pada
fase demam
Aneosinofilia pada permulaan penyakit
Trombositopenia
Limfositosis relatif

Pemeriksaan laboratorium (lanjutan)

Urin
Proteinuria
Reaksi Diazo (Erlich)

Serologi ( Widal, hemaglutinasi, Elisa, dsb)

Bakteriologik : isolasi kuman. Sampel
darah, aspirasi sumsum tulang, rose spot,
urin, tinja

Test laboratorium untuk membantu

menegakkan diagnosis
Test serologis (mendeteksi kenaikan titer/
kadar antibodi terhadap antigen S.typhi
dan menentukan adanya antigen spesifik
dari S.typhi.
Test biakan untuk mendeteksi kuman
S.typhi dari spesimen darah, urin, feses,
sumsum tulang.
Test Polymerase Chain Reaction (PCR)
untuk mendeteksi DNA spesifik S. typhi.

Bahan Biakan / Kultur

darah, urin, feses, sumsum tulang.
darah : minggu I atau II sakit
urin : minggu II atau III sakit
tinja : minggu II atau III sakit
sumsum tulang : minggu I sakit.

DIAGNOSIS
Diagnosis demam tifoid sulit
ditegakkan tanpa test laboratorium,
sebab gambaran klinis penyakit ini
sangat bervariasi dan pada
umumnya tidak khas (spesifik).
Diagnosis pasti : test biakan/kultur
bakteri ditemukan S. typhi.

Test Widal
Reaksi aglutinasi, dikembangkan pertama
kali oleh Widal (1896).
Di daerah non endemik, titer H dan O >
1: 80 menyokong diagnosis
Di daearh endemik, titer H dan O > 1:160
menyokong diagnosis
Kenaikan titer antibodi > 4x pada
pemeriksaan ulangan 1 atau 2 minggu
kemudian menyokong diagnosis

Prinsip Test Widal.

reaksi aglutinasi.
antigen S.typhi/S.paratyphi bila
dicampurkan dengan serum
penderita demam tifoid yang
mengandung antibodi terhadap
S.typhi/S.paratyphi akan terjadi
aglutinasi.

Peralatan dan bahan

pemeriksaan

serum penderita demam tifoid

antigen somatik (O) dan flagelar (H)
larutan NaCl 0.85% (0.9%)
1 microplate plastik dengan sumursumur kecil
mikropipet dengan tips-nya.
mesin penggoyang (shaker machine)

Antigen Somatik (O)

Salmonella
Salmonella
Salmonella
Salmonella

grup
grup
grup
grup

A (S.paratyphi A): A-O

B (S.paratyphi B): B-O
C (S.paratyphi C): C-O
D (S. typhi)
:O

Antigen flagelar (H)

Salmonella
Salmonella
Salmonella
Salmonella

grup
grup
grup
grup

A : A-H
B : B-H
C : C-H
D (S.typhi) : H

Persiapan Penderita.

Penderita sebaiknya belum

mendapat terapi antibiotik.
Jenis sampel : serum penderita
tersangka demam tifoid, tidak
hemolisis

Pengambilan sampel.

Pengambilan sampel darah

sebaiknya dilakukan pada fase akut
dan fase konvalesen.

Cara Kerja
Test kualitatif dengan Slide
1. teteskan satu tetes (0.04 mL) serum
penderita (tidak diencerkan) di slide.
2. teteskan satu tetes suspensi antigen
yang telah dikocok homogen di
samping tetes serum.
3. campur serum dan suspensi antigen
dengan batang pengaduk, sebarkan
memenuhi lingkaran pengamatan.

Cara kerja (lanjutan)

goyang slide perlahan-lahan dgn tangan

selama 1 (satu) menit
amati adanya aglutinasi pada slide baik
antigen O dan antigen H.
bila terjadi aglutinasi, lanjutkan test
konfirmasi dengan menggunakan tabung
reaksi untuk menentukan titer antibodi
dalam sampel.
nilai titer = pengenceran yang masih ada
aglutinasi.

Test Kuantitatif dengan Cara Slide

1. pipet serum sampel yang belum
diencerkan
0.08 mL (80 uL), (nilai 1 : 20)
0.04 mL (40 uL), (1 : 40)
0.02 mL (20 uL), (1 : 80)
0.01 mL (10 uL). (1 : 160)
0.005 mL (5 uL) (1 : 320)

Cara test kuantitatif dengan cara slide (lanjutan)

2. untuk pembanding, pipetkan 0.04 mL

kontrol (+) dan 0.04 mL kontrol (-) di
tempat terpisah pada slide.
3. teteskan satu tetes suspensi antigen
yang telah dikocok homogen ke atas
sampel serum, kontrol (+) & kontrol (-).

Cara test kuantitatif menggunakan slide (lanjutan)

4. campurkan serum dan suspensi

antigen dengan batang pengaduk
(tusuk gigi), mulai dari pengenceran
terkecil ke pengenceran serum yang
lebih besar,
5. sebarkan campuran sampai memenuhi
lingkaran pengamatan.
6. Lakukan juga terhadap kontrol (+)
dan kontrol (-).

Cara test kualitatif dengan cara slide (lanjutan)

1. putar slide dengan tangan atau rotator

selama 2-3 menit.
2. baca hasil reaksi di bawah penerangan
yang baik. Hasil positip ditandai
dengan adanya aglutinasi.
3. nilai titer antibodi sesuai dengan nilai
pengenceran tertinggi yang didapat.

Interpretasi test Widal harus hati-hati

Banyak faktor mempengaruhi hasil test :
Stadium penyakit.
Pemberian antibiotika
Teknik laboratorium
Test tidak spesifik

TUBEX-TF
Suatu pemeriksaan laboratorium untuk
mendeteksi adanya antibodi IgM di serum
sampel terhadap antigen S.typhi LPS-O9
(lipopolisakarida) dengan metoda
Immunoassay Magnetic Binding Inhibition
(IMBI). Tingkat inhibisi setara dengan
kadar antibodi IgM S.typhi dalam sampel

Prinsip Test TUBEX-TF

TUBEX TF mendeteksi adanya antibodi
IgM thd antigen LPS-O9 S.typhi di serum
penderita dengan cara menghambat
reaksi antara antigen berlabel partikel
lateks magnetik(brown reagent) dan
antibodi monoklonal berlabel lateks warna
(blue reagents). Ikatan inhibisi dipisahkan
dgn daya magnetik. Hasil dinyatakan
dalam skala warna (color scale).

Bahan Pemeriksaan
serum atau plasma heparin.
JANGAN menggunakan plasma EDTA atau
plasma sitrat.
Serum lipemik, hemolisis dan ikterik TIDAK
BOLEH digunakan, karena warna merah dari
hemoglobin (pada hemolisis) atau bilirubin
mengganggu warna yang terbentuk.
pembacaan hasil test. Serum sampel
disimpan pada suhu 28 C atau dibekukan (<
-18C) bila belum akan segera diperiksa.

Peralatan & Reagen

Pipet presisi, vortex dan timer (pencatat
waktu)
Komponen dalam TUBEX TF :
TUBEX TF Brown Reagent, mengandung
antigen coated particles.
TUBEX TF Blue Reagent, mengandung
antibody coated particles.
Negative & Positive Control.
Reaction Well Strip & Sealing Tape
TUBEX TF Colored Sticker

persiapan
Biarkan reagen dan serum pada suhu
kamar.
Kocok (homogenisasikan) semua
reagen sebelum digunakan,
check apakah semua sedimen telah
larut.

Prosedur Test (1)

Letakkan TUBEX Reaction Well Strip
dengan posisi tegak, nomor V-shape
well dihadapan kita.
Teteskan 45 uL TUBEX TF Brown
Reagent pada tiap V-shape Well.
Ag LPS-O9 S.typhi akan melekat pd
partikel magnetik warna coklat

Prosedur Test (2)

Tambahkan 45 uL sampel penderita,
TUBEX TF Positive & Negative Control
dan serum penderita pada V-shape Well
(sumur-V),
campur dengan hati-hati dengan
menggunakan pipet (isap-dorong)
sebanyak 10 x, usahakan agar tidak
terjadi busa.

Prosedur Test (lanjutan)

Di V-shape well :
kontrol positip : Anti IgM Mab S.typhi
berikatan dgn Ag LPS-O9.
serum sampel : serum Ab IgM S.typhi
berikatan dengan Ag LPS-O9

Prosedur Test (3)

Inkubasi selama 2 menit
Tambahkan 90 uL TUBEX TF Blue Reagent
ke semua V-shape well.
Di Well kontrol negatip :
Mab IgM S.typhi melekat pada partikel lateks warna
biru berikatan dgn Ag LPS-O9
Di Well serum sampel :
Reaksi Mab IgM S.typhi dgn Ag LPS-O9 di-inhibisi
oleh Ab IgM S.typhi dari serum

Prosedur test (lanjutan)

Tutup TUBEX Reaction Well dgn TUBEX
sealing Tape
Homogenisasi 2 menit
Letakkan well strip di atas skala
magnetik untuk reaksi separasi selama
5 menit.
Interpretasi hasil.

Interpretasi hasil
< 2 negatip tidak menunjukkan
infeksi. Kontrol negatip.
3 borderline pengukuran tidak
dapat disimpulkanm ulangi test. Bila
hasil meragukan, lakukan sampling
ulang beberapa hari kemudian
4 positip lemah menunjukkan
infeksi demam typhoid

Interpretasi (lanjutan)
6-10 positip indikasi kuat demam
typhoid aktif. Kontrol positip.
Indeterminate : ketidakjelasan
pengukuran diakibatkan oleh :
1. Protokol test tidak diikuti dgn baik.
Ulangi test
2. Kualitas sampel kurang baik.
Lakukan sampling ulangi test

Pemeriksaan Serologi
Demam Dengue (IgG/IgM)

Pendahuluan
Demam Dengue disebabkan oleh Virus
Dengue yang disebarkan oleh nyamuk,
Stegomyia aegypti (dulu dikenal
sebagai Aedes aegypti) dan Aedes

albopictus

Dikenal 4 serotipe virus : Dengue

Dengue
Dengue
Dengue

virus 1
virus 2
virus 3
virus 4

Pendahuluan (lanjutan)

virus Dengue, termasuk genus Flavivirus,

famili Flaviviridae.
berbentuk sferis berukuran 40-50 nm,
mempunyai 2 tipe protein :
1) protein struktural (3 macam) :
protein C (core),
protein M (membran),
protein E (envelope)
2) protein non struktural (7 jenis) : NS1,
NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.

Pendahuluan (lanjutan)

Orang yg terinfeksi sering mengalami

demam sub fibril dan sembuh sendiri
Bila terinfeksi kedua kali dengan virus
serotipe lain, keluhan menjadi lebih
berat dan dapat mengalami
dengue hemorrhagic fever (DHF),
dengue shock syndrome (DSS)

Demam Dengue
Di Indonesia, demam dengue
merupakan salah satu masalah
kesehatan masyarakat, karena selalu
menimbulkan wabah yang muncul pada
bulan-bulan tertentu setiap tahun.

Patogenesis dan Patofisiologi

Setelah gigitan nyamuk, virus Dengue,
berkembang biak di kelenjar limfe
regional, menyebar melalui sistem limfatik
dan sirkulasi darah ke jaringan lain.
Masa inkubasi demam dengue berkisar
antara 3 14 hari, umumnya 4 7 hari.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)

demam tinggi disertai kejang dan

perdarahan saluran cerna akibat infeksi
sekunder (infeksi ke dua kalinya) oleh
serotipe lain.
demam ringan umumnya terjadi pada
infeksi primer.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)

Hal ini disebabkan antibodi anti-dengue

dari infeksi sebelumnya berikatan
dengan virus Dengue serotipe lain yang
menginfeksi saat ini membentuk
kompleks Ag-Ab yang akan merangsang
penglepasan sitokin dan mengaktivasi
komplemen (penglepasan anafilatoksin
C3a dan C5a) yang merangsang
pengeluaran histamin.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)

Akibatnya terjadi gangguan fungsi

endotel (antara lain peningkatan
permiabilitas endotel kapiler ). Terjadi
kebocoran / perembesan plasma ke
ruang ekstravaskuler, sehingga terjadi
renjatan (shock) hipovolemik.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)

Perubahan vaskuler, kerusakan trombosit,

trombositopenia dan gangguan faktorfaktor pembekuan menimbulkan gangguan
hemostasis dan terjadi perdarahan.
Berat ringannya gejala tergantung pada
serotipe dan galur virus Dengue, usia dan
sifat genetik penderita serta derajat
viremia.

Diagnostic test

Immunochromatographic assay
Isolation of virus
Antigen detection in fixed tissues
RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)
Hemagglutination-inhibition test

Dengue IgG / IgM Rapid test

Solid phase immunochromatographic
assay.
Sifat Test : rapid, kualitatif deteksi
antibodi IgG dan IgM virus Dengue di
serum atau plasma.
Presumptive diagnosis antara infeksi
primer dan infeksi sekunder.

Prinsip Test
Didesain secara simultan mendeteksi
antibodi IgG dan IgM virus dengue
Mendeteksi semua serotipe dengue
menggunakan campuran protein envelope
recombinant dengue.
Test dilengkapi dengan 3 garis (precoated lines: G (IgG), M (IgM), C
(kontrol).
Garis C harus selalu muncul pd tiap test

Prinsip Test
Bila sampel diteteskan di sumur sampel,
anti dengue IgG / IgM di serum bereaksi
dgn recombinant Dengue virus

envelope protein-colloidal gold

conjugates membentuk komplek Ag-Ab.

Dengan daya kapilaritas, komplek Ag-Ab

bermigrasi dan sampai ke anti-human IgG
dan/atau IgM yg ada di garis test dan
menimbulkan pembentukan warna

Bahan Test
Dengue IgG/IgM test strip :
Gold conjugates : recombinant Dengue
virus envelope protein-gold colloid.
Garis G : mouse monoclonal anti-

human IgG

Garis M : mouse monoclonal anti-

human IgM

Garis kontrol : rabbit anti-Dengue IgG

Bahan Test (lanjutan)

Assay diluent : 100mM phosphate

buffer, Sodium azide
5 uL capillary pipette atau mikropipet

Pengambilan dan Penyimpanan

Sampel
Serum : ambil darah vena, masukkan di
tabung reaksi tanpa antikoagulan,
biarkan 30 , sentrifuge, pisahkan serum
dari bekuan darah
Plasma : ambil darah vena, masukkan di
tabung reaksi mengandung antikoagulan
(heparin/Na-EDTA/Na-sitrat), pisahkan
plasma dari sel-sel darah.

Pengambilan & penyimpanan sampel

Bila tidak segera diperiksa, simpan
sampel di suhu 2-8 C.
Bila disimpan > 2 minggu, dianjurkan di
bekukan.
Suhu test : suhu kamar.
Sampel mengandung presipitat harus di
jernihkan dulu sebelum test.

Pengambilan & Pengumpulan Sampel (lanjutan)

Sampel
hemolisis,
lipemik,
ikterik,
mengandung faktor rheumatoid
dapat mengganggu test.

Prosedure Test
Siapkan Kit test dan sampel pada suhu
kamar.
Isap sampel (serum/plasma)
menggunakan pipet kapiler sampai
black line (5 uL) atau menggunakan
mikropipet.
Teteskan serum/plasma 5 uL di sumur
bertanda S.

Prosedur Test (lanjutan)

Tambahkan 3-4 tetes assay diluent ke

sumur assay diluent yang berbentuk
bulat
Baca hasil test dalam waktu 15 20.
(jangan dibaca sesudah 20 )

Interpretasi Test
Negatif. Hanya tampak garis pink C
Positip.
IgM (+) (infeksi dengue primer) : tampak
2 garis pink C dan M.
IgG (+)(infeksi dengue sekunder atau
pernah terinfeksi di masa lalu) : tampak 2
garis pink C dan G.
IgM dan IgG (+) : tampak 3 garis pink
C, M, G.
Invalid : garis C tidak ada

Keterbatasan Test
Test jangan digunakan sebagai satusatunya test untuk mendiagnosis infeksi
dengue (should not be used as the sole
criterion for diagnosis)
Pada infeksi dini, kadar antibodi
mungkin rendah, dan pada beberapa
penderita kadar antibodi terdeteksi baru
pada hari 7 10. Bila gejala klinik ada
lakukan re-test dalam 3 4 hari

Keterbatasan Test (lanjutan)

Reaksi silang mungkin dapat terjadi

dengan grup Flivivirus (virus dengue,
St.Louise encephalitis, Japanese
encephalitis, West Nile dan yellow
fever).
Bila hasil test (-), tetapi gejala klinik
ada, disarankan test lagi dengan
metoda lain.

Expected value
Dengue primer ditandai ditemukannya
IgM 3 5 hari pasca infeksi.
Dengue sekunder ditandai dengan
peningkatan IgG 1 2 hari setelah
infeksi dan pada sebagian kasus diikuti
dengan peningkatan IgM.

Sensitivitas dan spesifitas test

Sensitivitas : % jumlah kasus (+) benar
dari jumlah semua kasus (+).
Jumlah kasus (+) :102
Jumlah kasus (+) dgn test ini : 93
Sensitivitas test : 93/102 x 100%= 91.2%

Spesifitas test
Spesifitas : % jumlah kasus (-) benar dari
jumlah seluruh kasus (-).
Jumlah kasus (-) : 200
Jumlah kasus (-) dgn test ini : 180
Jumlah kasus (+) palsu 20
Spesifitas test : 180/200 x 100% = 90%