Rekayasa genetika

Bio-mol kul ke 10-11

Erlindha Gangga A

Untuk mempelajari kloning gen dibutuhkan penge tahuan tentang konsep biologi molekuler dan peng gunaan tehnik-tehnik dalam laboratorium

Teknologi DNA telah meluncurkan revolusi

dalam bidang bioteknologi yaitu manipulasi
organisme atau komponen organisme untuk
melakukan tugas tugas praktis untuk
menghasilkan produk yang bermanfaat.
Semuanya melibatkan para peneliti dari
bidang a.l; biologi, mikrobiologi, biologi
molekuler,dan para teknisi peralatan untuk
menunjang kerja para peneliti.

KEMAMPUAN YANG REVOLUSIONER DARI

REKAYASA GENETIKA
Teknik ini menjanjikan berbagai kemampuan yang
revolusioner, antara lain :
Cepat
Dapat diterapkan secara universal
Dapat dilakukan pengendalian yang ketat
terhadap proses manipulasi
Dapat membentuk berbagai kombinasi genetik
baru yang belum diseleksi sebelumnya dengan
metode laboratorium

Cara / Garis besar kloning gen :

1. Membuka sel hidup. Untuk ini terdapat beberapa cara,

yang popular adalah dengan memblender sel dan kemudian menambahkan deterjen ( untuk sel mamalia ).
2. Mengambil informasi genetic ( DNA ) dari sel. Karena molekul DNA ratusan kali lebih panjang dari molekul lain dalam
sel, maka tehnik pemurnian DAN mudah dikembangkan.
3. Salah satu metodanya adalah dengan menggulung DNA
pada sebatang gelas. Batang gelas yang membawa DNA
kemudian diangkat dari campuran sel-sel pecah, dengan
cara seperti kita mengangkat bakmi dengan sumpit.

4. Memotong gen khusus yang diinginkan.

Metode ini dilakukan dengan cara seperti meng edit film. Seperti halnya film, DNA juga terdiri atas
frame untuk menunjukkan urutan yang tepat.
Dalam DNA frame ini merupakan susunan huruf
kode genetik. Bila frame-frame ini disusun pada
kombinasi tertentu, akan menjadi cerita pada film
atau menjadi DNA pada gen. Gunting molekuler
untuk memotong DNA adalah suatu enzim yang
disebut restriction enzym ( enzim pemotong ).

5. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam perantara yang

disebut cloning vehicles yang akan membawa potongan DNA ke
dalam sel hidup lain.
o. Cloning vehicles adalah molekul DNA yang relatif pendek yang
dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel.
o. Menempatkan gen khusus pada kloning vehicle mi rip seperti
menyambung adegan cerita dalam film pendek.
o. Proses penyambungan menghasilkan chimeric DNA molekul
( molekul DNA kimera ), Sebagian adalah gen khusus dan
bagian lainnya adalah gen dari cloning vehicle tersebut.
o. Molekul DNA tersebut juga disebut recombinant DNA molekul
( molekul DNA rekombinan).

Cloning vehicle yang mengandung potongan khusus DNA tadi dimasukkan ke dalam
sel inang yang biasanya adalah organisme
sel tunggal ( seperti bakteri atau ragi ).
membiarkan sel inang untuk memperbanyak
diri membentuk klon dengan kandungan
bermilyar milyar sel yang identik.

Pada umumnya kloning sederhana dari sepotong

DNA berlangsung baik. Seperti halnya film yang
menjadi berguna setelah diproyeksikan. Demuikian
juga informasi dalam DNA yang harus dirubah
kedalam produk yang berguna.
Untuk membuat produk, informasi dalam DNA
ditransfer dari gen ke tempat molekul protein
diproduksi.
Pembuatan produk berdasar informasi yang
disimpan dalam DNA disebut ekspresi gen.

Yang harus kita ketahui, protein adalah

rangkaian molekul yang terdiri dari ratusan
mata rantai asam nukleat.
Suatu tipe dari fungsi protein sebagai balok
penyusun struktur sel, dan tipe lain yang
berfungsi untuk mengontrol reaksi-reaksi
kimia dalam sel.

Sebelumnya, insulin didapatkan dengan cara

memurnikan protein pankreas babi.
Tetapi sekarang dengan tehnik kloning gen,
yaitu : memindahkan gen insuling manusia
ke dalam sel bakteri. Dengan demikian akan
didapatkan produksi insulin dalam jumlah
besar oleh bakteri, cara ini lebih mudah

Contoh tehnik rekombinan : pembuatan insulin

dengan perantara bakteri.
Insulin adalah hormon yang dibutuhkan untuk
mengontrol metabolisme gula dalam tubuh kita.
Pada penderita penyakit kencing manis (diabetict)
terjadi kegagalan dalam mensintesa hormon ini
sehingga diperlukan penambahan insulin dari luar
untuk kelangsungan metabolisme gula dalam tubuh.

TINGKAT KEBERHASILAN KLONING :

Dipengaruhi oleh :
Pemilihan Vektor
Pemilihan sistem kloning, tergantung pada
penentuan tujuan yang ingin dicapai.
Tujuan dari kloning fragmen DNA

Isolasi dan perbanyakan fragmen DNA murni

Preparasi pelacak DNA atau RNA dari urutan spesifik
Sequencing daerah penting pada berbagai genom
Ekspresi dan pemurnian sejumlah protein biologis
Modifikasi genetik species
Modifikasi in Vitro dari urutan DNA yang bermanfaat

Garis besar kloning gen :

Membuka sel hidup, dengan cara memblender ,

skuensing dan destruksi ( memecah sel ).
Mengambil informasi genetik ( DNA ). Karena
molekul DNA panjangnya ratusan kali molekul lain
didalam sel.
Memotong gen (DNA) khusus yang diinginkan
menggunakan enzim restriksi.
Menempatkan potongan DNA spesifik kedalam
perantara yang disebut cloning vehicles yang
akan membawa DNA ke sel hidup yang lainnya.
cloning vehicles

Perangkat Teknik DNA Rekombinan

/ Rekayasa Genetika
:
Enzim

restriksi
Vektor / wahana kloning
Konstruksi dan pengklonan
Konjugasi, transformasi, transduksi

Enzim Restriksi
Adalah : Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan / pe
motongan DNA dibeberapa tempat / lokasi spesifik
dengan jumlah yang terbatas & dapat direproduksi.
Enzim ini disebut juga dengan nama endonuklease restriksi
( Russell, 1980).
Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester asam
nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan target umumnya
sering muncul berkali kali.
fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda dengan
sedikitnya satu ujung untai tunggal.

Sejarah penemuan enzim restriksi

Stewart Linn & Werner Arber (1960)

Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim
nuklease restriksi dalam bakteri E.coli galur B yang
dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan.

Hamilton Smith (1970)

Pertama kali menemukan enzim nuklease
restriksi spesifik yang memutus DNA pada
tempat- tempat tertentu dan dapat
diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzae
yang dikenal dengan nama HindII,

Watson dkk, (1983)

Menemukan nuklease restriksi & metilase
modifikasi dalam dua galur E.coli lain yang
membuka kemungkinan adanya banyak
nuklease yang spesifik untuk suatu tempat

Enzim Restriksi terdiri dari 2 golongan

Enzim gol 1

Memecah DNA pada tempat yang tidak spesifik,

jauh dari tempat pengolahan.
Mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik.
Antara lain : enzim-enzim yang terlibat dalam
sistem restriksi K dan B ( termasuk E.Coli)

Enzim gol 2

Memecah DNA pada tempat yang spesifik.

Telah banyak diisolasi dari mikroorganisme
(Russell, 1980).

Enzim yang pertama kali ditemukan pada tahun

1970 oleh Hamilton Smith dari Universitas John
Hopkens yaitu : Haemophyllus influenza, yang
dapat segera menguraikan pemakan DNA asing.

Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

Vektor / Wahana kloning

Seutas molekul DNA tunggal tempat
dilekatkannya material genetik yang kita
inginkan sebelum di injeksikan ataupun
ditransformasikan kedalam bakteri tertentu.
Wahana kloning yang paling sering di
gunakan adalah plasmid.

Plasmid

Adalah unsur genetik diluar kromosom ( ekstrakromosomal),

yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel
bakteri.
DNAnya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda.
Mendukung gen yang diperlukan untuk replikasi ataupun fungsi
lain yang dipikulnya.
Plasmid mudah dipisahkan dan dimurnikan dari DNA inang
Pada Rhizobium sp. plasmid berguna karena terlibat dalam
proses fiksasi dan untuk mengikat nitrogen.

Adalah molekul yang dapat diturunkan secara stabil

tanpa mengkaitkannya dengan kromosom.
Sangat berarti bagi bidang kedokteran , farmasi, dan
pertanian , karena plasmid membawa resisten terha
dap antibiotik yang berguna bagi manusia dan hewan.
Selain itu dapat menjandikan toksin dan protein lain
yang dapat meningkatkan virulensi patogen.

Jenis plasmid

Plasmid F :

Plasmid faktor R :

Berfungsi dalam proses konjugasi dan dikenal pada

berbagai bakteri.

Plasmid yang membawa gen-gen penyebab resistensi

terhadap antibiotik.

Plasmid Ti :

Pada berbagai Agrobacterium

Fungsi berhubungan dengan tumbuhan inang, yaitu
dengan cara mentransfer satu fragmen DNA (DNA-T)
kedalam sel inang, yang kemudian akan menyebabkan
tumbuhnya tumor pada inang.

Fungsi plasmid

Mendukung replikasi
Sebagai vektor untuk pengklonan DNa
Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten )
Contoh : plasmid resisten p BR. 322.( plasmid R.E Coli ,
yaitu : plasmid yang memberi resisten terhadap
ampicilin dan tetrasiklin. )
DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara melisiskan sel

bakteri dan memisahkan DNA plasmid dari DNA

kromosom.
Plasmid p.BR.322 : merupakan suatu determinan replikasi
plasmid pMBI yang berkaitan dengan col.E.I. gen plasmid
RI ( TN3) resisten dan gen resisten tetrasiklin plasmid pS
(101) sebagai penanda seleksi.

Plasmid

Plasmid resisten

Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui

perbanyakan bakteri

Pemindahan plasmid kedalam gen

Vektor plasmid & Ciri plasmid

Kuliah ke11

Konstruksi dan Pengklonan

. Pengisolasian DNA sumber gen dan vektor

Isolasi DNA sebagai sumber gen menggunakan enzim

endonuklease. diperoleh dari gen yang diinginkan yang
kemudian ditumbuhkan / dikultur kan dalam laboratorium.
Isolasi plasmid dari bakteri (E.coli ) yang membawa 2 gen
penanda e.g.
1. Resistensi terhadap antibiotik ampisilin,
2. Lac Z yang mengkode .galaktosidase yang dapat
menghidrolisis laktosa.

. Penyelipan DNA kedalam vektor ( 3 langkah)

1. Memotong DNA yang ingin diselipkan dan
DNA plasmid dengan enzim restriksi yang
sama. Pada saat pemotongan enzim restrik
si membuat / menciptakan ujung ujung lengket dari kedua DNA.
2. Menyatukan kedua utas DNA dimana ke 2
ujung lengket akan berpasangan
3. Menggabungkan molekul molekul DNA
secara ikatan kovalen menggunakan enzim
Ligase.

. Pemasukan vektor kedalam sel

Sel bakteri akan mengambil plasmid dengan cara trans formasi

(penyerapan DNA dari larutan disekelilingnya).

. Pengklonan sel- sel ( gen DNA asing)

Dalam proses ini bakteri yang telah mengandung plasmid

rekombinan ditempatkan dalam nutrien agar yg mengandung
ampisilin dan x- gal ( gula).
Bakteri akan bereproduksi yang membentuk koloni sel rekombinan.
yang mengandung sel rekombinan resisten antibiotik ampisilin dan
gen lak Z.

. Identifikasi klon gen rekombinan.

Dengan metode hibridisasi asam nukleat :

menggunakan utas DNA / RNA yang pendek
dapat diketahui urutan basanya disebut probe
asam nukleat.
Probe asam nukleat diberi label radio isotop
sehingga pada saat penelusurun dapat dilihat
DNA klon yang komlementr dengan DNA probe
yang berikatan hidrogen secara spesifik.

PCR ( Polymerase Chain Reaction)

Adalah suatu teknik / metode dimana setiap fragmen

DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkalikali,dengan cepat tanpa menggunakan sel.
PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali
dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer
karena DNA polimerase akan menambahkan
nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang sudah
ada sebelumnya dengan bantuan primer.

Manfaat PCR

Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah
Kerjanya sangat spesifik dan ampuh.
Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk
dideteksi
Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrio nik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.

Analisis DNA Hasil Klon

Electroforesis
Southern Blotting
Metode Sanger.

Aplikasi DNA Rekombinan

Dalam Bidang Kedokteran

Dalam Bidang Farmasi
Dalam Bidang Forensik
Dalam Bidang Lingkungan
Dalam Bidang Pertanian
Dalam Bidang pangan

Konjugasi, transformasi, transduksi

Konjugasi

Perpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke

sel bakteri lainnya secara kontak antar sel.
Sel donor akan memberikan informasi genetik
kepada resipien.
Plasmid akan mengontrol formasi filamen
permukaan sel yang dibutuhkan untuk mengadakan
kontak pada waktu terjadinya perkawinan.

Plasmid memiliki sistim khusus untuk

replikasi dan transfer DNA plasmid dan
sistem pengontrolan

Plasmid memiliki faktor F yang merupakan

faktor konjugatif ,

Transformasi

Prosesperpindahan genetik dimana sel

resipien membutuhkan molekul DNA bebas (
DNA yang berada diluar sel atau yang telah
dimurnikan.
Dalam laboratorium transformasi dapat
dilakukan dengan mengisolasi DNA donor
kemudian menambahkannya pada suspensi
selresipien.
Transformasi dapat terjadi secara alami.

Pada prinsipnya transformasi akan terjadi

bila sel resipien mampu menerima DNA yang
telah diisolasi dari sel donor.
Transformasi dapat terjadi pada bakteri
Gram positif ataupun Gram negatif
Transformasi dapat dipindahkan dari sel
bakteri kepada sel tanaman.

Transduksi

Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh

virus dari sel inang .
Transduksi terbagi 2

Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa

virus tertentu.gen inang langsung diintegrasi
kedalam genomvirus.lalu ditransfer ke resipien
selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen )
Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga
lengkap

Transduksi umum : gen gen inang yang berasal

dari suatu genom akan menjadi bagian dari
partikel DNA virus yang sudah matang darisuatu
tempat atau penambahan pada genom virus.
Virus yang telah mengalami transduksi tidak
mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel
bakteri telah menggantikan tempat penting pada
gen virus.