TUGAS KELOMPOK VII

METODE PEMISAHAN
TAHUN AJARAN 2014/2015

Di susun Oleh:
Ardipa Saputra Komang

(1208105007)

Ni Made Yuliarti

(1208105014)

Aqro Wijaya Kusuma

(1208105024)

Karen Kromonadi

(1208105032)

Dwi Anggraeni Putri Suandi

(1208105042)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2014

1. Suatu seri larutan standar polyvinylpyridine dengan berat molekul berbeda dianalisis

dengan metode kromatografi eksklusi ukuran. Data yang dihasilkan dalam table berikut.

Jika waktu retensi sampel 8,45, hitung berat molekul sampel polyvinylpyridine.
Jawab:

Keterangan:
BM = Berat Molekul
tr
= Waktu Retensi
Ps
= Kerapatan Pelarut
Sr
= Volume Retensi

2.

Berikan saran bagaimana kondisi pemisahan yang baik untuk campuran 2-asam amino
benzoat (pKa1= 2,08, pKa2= 4,96), benzylamine (pKa= 9,35), dan 4-methyl phenol
(pKa=10,26) dengan metode elektroforesis zona kapiler.
Jawab:
Elektroforesis Zona Kapiler/ Capillary Zone Electrophoresis (CZE) merupakan metode yang

paling sederhana dari elektroforesis kapiler. Elektroforesis ini digunakan untuk memisahkan
asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan
pada kolom kapiler berisi buffer. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi
yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda.
Alat-alat yang digunakan pada elektroforesis kapiler diantaranya:
1. Kolom kapiler (dengan silika, jendela optis agar bisa diamati prosesnya dari luar)Dua buah
elektroda.
2. Power supply (bisa diatur untuk bertegangan tinggi)
3. Detector (sinar UV)
4. Larutan buffer beserta dua buah tempat penyimpanannya.

Pada gambar diatas dapat dijelaskan bahwa pada elektroforesis kapiler digunakan dua
buah tabung (media pendukung) berbentuk U yang ke dalamnya dimasukkan larutan protein
yang akan dianalisis larutan buffer sebagai larutan pembawa komponen. Kemudian elektroda
dipasangkanpada ujung kaki tabung agar dapat terjadinya aliran listrik. Ketika arus listrik
dialirkan dan terjadi pergerakan molekul-molekul protein pada kedua batas larutan ke arah
elektroda.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah
terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Medium pendukung
bersifat relatif stabil (inert). Komposisinya akan menyebabkan terjadinya penyerapan, migrasi
elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa yang ingin dipisahkan. Untuk meminimalisasikan
terjadinya penguapan, maka elektroforesis dapat dilakukan pada medium pendukung yang
dicelupkan dengan larutan buffer. Larutan buffer (penyangga) berfungsi untuk menstabilkan pH
medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa
hal, yaitu :
a) Komposisi
Komposisi Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan
mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan
karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik
dengan karbohidrat. Selain buffer borat juga terdapat buffer asetat yang
dapat digunakan untuk elektroforesis DNA.
b) Konsentrasi
Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa
meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga
memperlambat

geraknya.

Kekuatan

ion

tinggi

dalam

buffer

akan

meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya

dipilih 0,05 -0,10M.
c) pH
Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah,
sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan
geraknya

juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada

senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa.

PRINSIP KERJA
Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan positif
(+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) pada kutub

positif (+).

Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalah
elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen
(tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses
kromatografi..

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif akan bergerak searah
dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam campuran terdapat dua jenis
komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2) komponen netral (N), maka komponen
negatif akan bergerak menuju kutub positif (+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam.
Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, serta muatan dari
masing-masing komponen. Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi jika komponen memiliki
muatan tinggi dan ukuran rendah, dengan kata lain memiliki densitas muatan yang tinggi.
Densitas muatan sendiri adalah perbandingan anatara muatan dengan ukuran yang dimiliki oleh
suatu komponen.
Pada elektroforesis zona kapiler terjadi proses Electro Osmotic Flow (EOF) yang terjadi
ketika kapiler pada elektroforesis diberi tegangan yang akan mengakibatkan terjadinya
perpindahan muatan ke arah kutub negatif (-). Perpindahan yang terjadi disebut "Electro Osmotic
Flow (EOF)". Pergerakan elektrolit yang tidak dipengaruhi oleh EOF disebut"elektroforetik" .
Prinsip kerja EOF dapat dilihat pada gambar berikut.

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa terjadinya pemisahan antara muatan positif
dengan muatan negatif disebabkan karena adanya lapis rangkap listrik. Lapis rangkap listrik
terjadi akibat pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler. Sebelum diberi
tegangan, permukaan kapiler akan bermuatan netral, setelah diberi tegangan, maka ion negatif
akan menempel pada permukaan sebagai lapis pertama. Ion positif akan mengikuti ion negatif
membentuk lapisan pada permukaan, dalam hal ini ion positif akan membentuk lapisan kedua.
Sistem ini disebut lapis rangkap listrik, sehingga migrasi dapat terjadi.

Pada gambar 2 diatas, diperlihatkan pengaruh pH terhadap EOF, ion zwiter seperti peptida telah
dipisahkan kedalam dua kondisi pH, pada pH tinggi EOF besar dan peptida bermuatan negatif
sehingga perpindahan elektroforesis menuju kearah elektroda positif (anoda),

Pada saat aliran pada pipa kapiler diberikan suatu pendorong yaitu tekanan maka akan
terlihat perbedaan kecepatan aliran yaitu pada lintasan tengah pipa lebih cepat dibanding dengan
pada dinding, hal ini terjadi karena ada gaya friksional(gesek) liquid terhadap dinding kapiler
(sistem hidrodinamik). Gambar bagian atas menunjukkan sistem yang dikendalikan secara
elektris, gaya dorong pada EOF terdistribusi secara uniform(merata) sepanjang pipa tersebut,
sehingga tidak ada pengaruh tekanan, distribusi kecepatan merata kecuali pada bagian yang
dekat sekali pada dinding pipa kapiler.

Keterangan:
EOF : mobilitas Elektroosmotik (EOF) yang bertambah secara vektorial
ep: mobilitas analat atau mobilitas elektroforetik (EMF)
eap: mobilitas aktual= ep + EOF

Pada prinsipnya dapat dikatakan bahwa pada elektroforesis zona kapiler dimana spesi
bermuatan (+) akanmencapai katoda paling cepat karena EOF& EMF arahnya sama, spesi netral
bergerak ke katoda dengan kecepatan ditentukan oleh aliran elektroosmotik, sedangkan spesi
bermuatan (-) bergerak paling lambat karena EOF& EMF berbeda arah. Sehingga elektroforesis
kapiler dapat memisahkan spesi bermuatan (+), (-), dan netral dalam satu kali injeksi/analisis.

PROBLEM SOLVING:
Berdasarkan penjelasan yang telah diuraikan di atas, maka dapat diketahui kondisi
pemisahan yang baik untuk campuran 2-asam amino benzoat (pKa1= 2,08, pKa2= 4,96),
benzylamine (pKa= 9,35), dan 4-methyl phenol (pKa=10,26) dengan metode elektroforesis zona
kapiler.
Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, serta muatan molekul.
Molekul dipengaruhi oleh medan listrik. Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi jika
komponen diberikan tekanan yang tinggi dan komponen tersebut berukuran rendah.Terjadinya
migrasi disebabkan akibat terbentuknya lapis rangkap listrik. Lapisan rangkap listrik terjadi
akibat pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler. Sebelum diberikan
tegangan, permukaan kapiler akan bermuatan netral, setelah diberi tegangan, maka ion negatif
akan menempel pada permukaan sebagai lapis pertama. Ion positif akan mengikuti ion negatif
membentuk lapisan pada permukaan, dalam hal ini ion positif akan membentuk lapisan kedua
(lapisan rangkap listrik)
Salah satu hal yang berperan dalam terjadinya pemisahan pada metode elektroforesis
ialah adanya larutan buffer (penyangga) yang berfungsi untuk menstabilkan pH pada medium
pendukung yang dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal,
diantaranya: pH (pH 8-9 yang merupakan pH optimal protein agar protein tidak terdenaturasi),
komposisi, serta konsentrasidari larutan buffer tersebut. Buffer tidak saja untuk mempertahankan
pH,tetapi juga memberikan ion yang dapat membantu sifat konduktivitas.Apabila kekuatan ion
buffer rendah, maka migrasi yang terjadi akan cepat. Namun apabila kekuatan ion buffer tinggi,
maka migrasi yang terjadi akan semakin lambat. Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah
arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga
akanmemperlambat geraknya.Hal ini disebabkan karena jumlah muatan positif semakin sedikit,
sehingga peluang untuk terjadinya ikatan antar molekul semakin sedikit pula.Kekuatan ionyang
tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas yang terjadi juga
meningkat. Adapun konsetrasi buffer yang biasanya dipilih ialah 0,05 -0,10M.
Pada soal diketahui pKa dari masing-masing sampel. Kita ketahui bahwa pKa berbanding
lurus dengan pH. Dimana semakin tinggi pKa, maka semakin tinggi pH (basa).

Berikut dijelaskan kondisi pemisahan yang baik untuk campuran 2-asam amino benzoat
(pKa1= 2,08, pKa2= 4,96), benzylamine (pKa= 9,35), dan 4-methyl phenol (pKa=10,26) dengan
metode elektroforesis zona kapiler :
a) 2-asam amino benzoat diketahui memiliki 2 pKa.
pKa = pKa1 + pKa2
2
pKa = 2,08 + 4,96
2
pKa = 3,52 (suasana asam, lebih banyak mengandung ion positif)
Kondisi pemisahan yang baik untuk 2-asam amino benzoatialah dengan adanya
pemberian tegangan yang tinggi pada kolom kapiler. Apabila tegangan diberikan diantara dua
elektroda, maka arus akanditentukan oleh tahanan dalam medium.
a) Voltase
Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara
keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient
potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
b) Aliran listrik
Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion
buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akanmeningkatkan jumlah
muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan
sebanding dengan waktunya.
c) Tahanan
Medium elektroforesa yang menimbulkan aliran ion sebanding dengan jenis medium,
jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak
antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan
konsentrasi ion dalam buffer.
Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, serta muatan dari
masing-masing komponen. Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi jika komponen diberikan
tekanan yang tinggi dan komponen tersebut berukuran rendah. Sebelum diberikan tegangan,
permukaan kapiler akan bermuatan netral, setelah diberi tegangan, maka ion negatif akan
menempel pada permukaan sebagai lapis pertama. Kemudian Ion positif akan mengikuti ion

negatif membentuk lapisan pada permukaan. Dalam hal ini ion positif akan membentuk lapisan
rangkap listrik yang menyebabkan migrasi dapat cepat terjadi. Dengan adanya larutan buffer,
maka ion-ion positif pada 2-asam amino benzoatakan berikatan secara terus menerus dengan ionion negatif dari buffer hingga kekuatan ion buffer menjadi rendah sehingga proses migrasi dapat
berlangsung cepat.
Seperti yang kita ketahui bahwa asam amino merupakan senyawa yang bersifal polimer
yang memiliki rantai peptida yang sangat panjang. Dengan digunakannya elektroforesis zona
kapiler, maka dapat dilakukan suatu pemisahan dikarenakan elektroforesis jenis ini dapat
digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Dengan pemberian tegangan yang
tinggi, 2-asam amino benzoat dapat dipisahkan.
b) benzylamine, pKa= 9,35 (suasana basa, lebih banyak mengandung ion negatif)
Kondisi yang baik dalam pemisahan elektroforesis zona kapiler ialah apabila larutan
buffer berada pada pH dengan kondisi yang optimum. Adapun pH optimum larutan buffer untuk
dapat terjadinya pemisahan pada elektroforesis zona kapiler ialah pH 8-9. Kita ketahui bahwa
benzylamine memiliki pH yang bersifat basa (pH 9). Karena pH larutan buffer dan benzylamine
saling mendekati, maka adanya larutan buffer dalam proses pemisahan ini hanya berperan
sebagaipenyumbang ion yang dapat membantu terjadinya ikatan ionik.Dengan kondisi pH
tersebut proses pemisahan akan lebih mudah terjadi.
c) 4-methyl phenol, pKa=10,26(suasana lebih basa dari benzylamine, sehingga lebih banyak
mengandung ion negatif dari benzylamine)
Pada pemisahan senyawa 4-methyl phenol, kondisi yang baik hampir sama dengan
pemisahan senyawa benzylamine. Akan tetapi, perlu diadakannya sedikit penurunan terhadap
konsentrasi larutan buffer karena disebabkan oleh pKa dari 4-methyl phenol lebih tinggi daripada
bezylamine yaitu 10,26. Konsentrasi larutan buffer yang sedikit rendah akan menyebabkan
menurunnya kekuatan ion buffer, sehingga jumlah arus listrik yang terbawa juga akan menjadi
menurun dan bagian aliran yang dibawa oleh sampel mengalami peningkatan, sehingga proses
migrasi berlangsung cepat.

DAFTAR PUSTAKA
Fitri, Ade. 2014. Kromatografi Ekslusi. http://adefitri2702.blogspot.com/ (diakses pada tanggal
18 Desember 2014)
Arsita, Widya. 2012. Makalah Elektroforesis. https://www.academia.edu/9068128/makalah_
elektroforesis (diakses tanggal 20 Desember 2014)