PERCOBAAN VI

PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM BAHAN MAKANAN SECARA

SPEKTROFOTOMETRI
A. Tujuan
Memahami

dan

melakukan

penetapan

kadar

protein

secara

spektrofotometri
B. Dasar Teori
1. Protein
Istilah protein berasal dari kata proteos yakni bahasa Yunani yang
berarti utama. Istilah ini dapat digunakan karena protein merupakan zat
paling penting dalam setiap organisme. Protein ini merupakan molekul
makro dengan berat molekul antara lima ribu hingga jutaan gram per mol.
Protein terdiri atas rantai-rantai panjang asam amino yang terikat satu sama
lain dengan ikatan peptide. Hal inilah yang membuat protein ini lebih
kompleks daripada karbohidrat dan lemak dalam hal berat molekul dan
keanekaragamannya. Protein adalah bagian dari semua sel hidup dan
merupakan bagian terbesar dalam tubuh sesudah air (Sandjaja, 2009).
Dalam kehidupan, protein memegang peranan penting. Proses kimia
dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim suatu
protein yang dapat berfungsi sebagai biokatalis. Disamping itu hemoglobin
dalam butir-butir darah merah yang disebut eritrosit. Eritrosit berfungsi
sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru menuju keseluruh bagian tubuh
yakni salah satu jenis protein. Demikian pula zat-zat yang berperan untuk
melawan bakteri penyakit atau yang disebut dengan antigen yang
merupakan pula jenis protein (Poedjiadi, 2006)
Protein yang diperoleh dari makanan yang berasal dari hewan atau
tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut dengan protein hewani,
sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan disebt dengan protein
nabati. Beberapa makanan sumber protein yakni daging, telur, susu, ikan,
beras, kacang, kedelai, gandum, jagung dan buah-buahan (Sandjaja, 2009).
2. Analisis Protein pada Makanan

Penentuan kadar protein dalam bahan makanan dengan tujuan yang

beragam, diantaranya untuk menentukan kadar protein total dalam bahan
makanan, menentukan tingkat kualitas protein yang dipandang dari sudut
gizi dan menelaah protein sebagai salah satu bahan kimia seperti yang
dilakukan pada bidang biokimia. Penentuan kadar protein total dalam
bahan makanan dapat dilakukan dengan beberapa metode antara lain yakni
dengan metode spektrofotometri UV, metode Kjeldahk, Lowry, Metode
Biuret, metode turbidimetri, metode pengecatan dan penentuan protein
dengan titrasi formal (Maharani, 2010).
Protein merupakan zat makanan yan amat penting bagi tubuh karena
disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi
sebagai zat pembangun dan pengakhir. Protein merupakan sumber sejumlah
asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang tidak dimiliki
oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein juga mengandung fosfor dan
belerang. Sebagai zat pembangun, protein merupakan bahan pembentuk
jaringan baru yang selalu terjadi didalam tubuh. Pada masa kehamilan
protein membentuk jaringan baru dan embrio. Fungsi utama protein bagi
tubuh adalah untuk membentuk jaringan dan mempertahankan jaringan
yang telah ada (Husni, 2008).
Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan
bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu, yaitu:
a. Protein globular
Protein globular rantai atau rantai-rantai polipeptida berlipat
rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat yang padat, protein
globular biasanya larut didalam sistem larutan (air) dan segera
berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik.
Hampir semua enzim merupakan protein globular, seperti protein
transport pada darah, antibodi, dan protein penyimpan nutrien.
(Lehninger, 1982)
Protein globular umumnya berbentuk bulat atau elips dan
terdiri dari atas rantai polipeptida yang berlipat. Pada umumnya gugus
R polar terletak disebelah luar rantai polipeptida, sedangkan gugus R
yang hidrofob terletak disebelah dalam molekul protein.

(Poedjiadi, 2006)
b. Protein Serabut
Bersifat tidak larut didalam air, merupakan molekul serabut
panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu,
dan tidak berlipat menjadi bentuk globular. Hampir semua protein
serabut memberikan peranan struktural atau pelindung. Protein serabut
ysng khas -keratin pada rambut dan wol, fibroin dari sutra dan
kolagen dari urat (Lehninger, 1982).
Peneraan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan
adalah dengan menentukan jumlah nitrogen (N) yang terkandung oleh
suatu bahan makanan. Cara penentuan ini dikembangkan oleh Kjeldahl,
seorang ahli kimia Denmark pada tahun 1883. Dalam penentuan protein
seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan.
Akan tetapi hal ini secara teknis sulit sekali dilakukan dan mengingat
jumlah kandungan senyawa lain selain protein dalam bahan biasanya
sangat sedikit, maka penentuan jumlah N total ini tetap dilakukan untuk
mewakili jumlah protein yang ada. Kadar protein yang dapat ditentukan
berdasarkan cara Kjeldahl ini dengan demikian sering disebut sebagai
kadar protein kasar (Sumarni, 2002).
Pengukuran kadar protein dapat dilakukan secara kuantitatif dan
kualitatif. Cara kuantitatif dapat dilakukan dengan cara spektrofotometri
UV dan kolorimetri, cara Kjeldahl dan titrasi Formol. Cara tak langsung
ada dua metode, pertama yakni berdasarkan pengikatan zat warna misalnya
Bradfrod, Nynhidrin, Brom Cresol Grren. Sedangkan metode yang lain
adalah berdasarkan pengikatan dengan tembaga, seperti metode Biuret,
Lowry, metode BCA (Bicin Croninic Acid) dan juga metode FeCl3.
(Katili, 2009)
3. Spektrofotometri
Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan
pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laajur larutan
berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan
monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detector fototube. Alat yang
digunakan disebut dengan spektrofotometer. Komponen utama dari

spektrofotometer yakni sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator,

kuvet, detector, penguat dan indikator (Poedjiadi, 2006)
Penetapan kadar protein secara biuret dilakukan dengan bantuan alat
spektrofotometer. Prinsipnya adalah pengukuran serapan cahaya oleh ikatan
kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu2+
dalam suasana basa. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm, ini merupakan panjang gelombang serapan maksimum
untuk warna ungu.
Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari
metode biuret adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa.
Reaksi biuret terdiri dari campuran protein sodium hidroksida (berupa
larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini.
Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lainnya (Carpette, 2005).

C. Alat dan Bahan

1. Alat
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.

Batang pengaduk
Corong kaca
Gelas kimia 50 mL dan 100 mL
Kaca arloji
Kuvet
Labu takar 25 mL; 100 mL; 250 mL
Pipet ukur 15 mL; 100 mL
Pipet tetes
Propipet
Spektrofotometri uv-vis
Timbangan analitik

2. Bahan
a.
b.
c.
d.
e.

Albumin standar
Aquades
NaOH 0,5 M
Pereaksi biuret
Sampel
1) Susu kedelai
2) Susu sapi
3) Telur ayam ras
4) Telur ayam kampung
5) Telur bebek
6) Telur puyuh

D. Bagan kerja
1. Penentuan kalibrasi
1 mL albumin standar (5g/dL)

Aquades ad. Tanda batas

Diambil

1 mL

2 mL

3 mL

4 mL

5 mL

200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm 1000 ppm

+ biuret 3 mL
+ aquades ad. tanda batas

2. Penentuan protein

Air

sampel

+ 1 gram putih telur

+ NaOH 0,5 M sebanyak 5 mL

+ aquades ad. Larut
+ biuret 3 mL
Didiamkan t = 10 menit
Suhu 37 - 38C
Diinkubator

Diukur absorbansi

3. Pembuatan pereaksi biuret

Larutan A

Larutan B

+ CuSO4 0,375 g

+ NaOH 10% 10 g

+ KH4C4 1,5 g

+ Aquades 50 mL

+ Aquades 50 mL

Dicampurkan

Dihomogenkan

E. Hasil Pengamatan
1. Tabel Hasil Pengamatan
a. Tabel panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang (nm)

Absorbansi

540
545
550
555
560

0,096
0,098
0,099
0,098
0,096

b. Tabel kurva standar

Konsentrasi (ppm)

Absorbansi

200
400
600
800
1000

0,021
0,082
0,099
0,118
0,207

c. Tabel kadar protein

No

Sampel

Absorbansi

Kadar (%)

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Susu kedelai
Telur bebek
Susu Sapi
Telur ayam kampung
Telur ayam ras
Telur puyuh

0.240
0.019
0,749
0,030
0,022
0,003

12,59
1,76
37,54
2,30
1,91
0,98

2.

Perhitungan
a. Pembuatan larutan baku
1). 200 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
2000 ppm . 1 mL = M2 . 10 mL
M2 = 200 ppm
2). 400 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
2000 ppm . 2 mL = M2 . 10 mL
M2 = 400 ppm
3). 600 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
2000 ppm . 3 mL = M2 . 10 mL
M2 = 600 ppm
4). 800 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
2000 ppm . 4 mL = M2 . 10 mL
M2 = 800 ppm
5). 1000 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
2000 ppm . 5 mL = M2 . 10 mL
M2 = 1000 ppm
b. Uji kuantitatif
Nilai
A = - 0,017
B = 0,000204
r = 0,9565
Persamaan regresi kurva baku ialah y = 0,000204x 0,017

1). Susu kedelai

2). Telur bebek

3). Susu sapi

4). Telur ayam kampung

5). Telur ayam ras

6). Telur puyuh

3. Grafik
a. Kurva panjang gelombang maksimum

b. Kurva baku standar albumin

4. Reaksi

+ CuSO4 + NaOH

+ Na2SO4 + H2O

F. Pembahasan
Percobaan ini mengenai penentuan kadar protein dalam bahan makanan
secara spektrofotometri yang bertujuan untuk memahami dan dapat
melakukan penetapan kadar protein seara spektrofotometri. Protein merupakan
zat makanan yang paling kompleks, terdiri dari karbon, hidrogen, oksigen,
nitrogen, sulfur dan basa forfor. Protein merupakan makromolekul polipeptida
yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan
peptida. Fungsi protein yaitu sebagai bahan bakar energi bagi tubuh, sebagai
zat pembangun dan memberbaiki sel-sel yang rusak, untuk pertumbuhan,
pemeliharaan jaringan, pembentukan senyawa tubuh yang esensial. Protein
juga mampu membentuk antibodi, sebagai transportasi nutrien dan regulasi
keseimbangan air. Fungsi protein yang tidak kalah penting yakni sebagai
katalik (mempercepat laju reaksi). Protein dalam bahan pangan umumnya
ditemukan pada kacang-kacangan, produk daging, telur, susu dan makanan
laut.
Penentuan kadar protein pada percobaan kali ini dilakukan dengan cara
menentukan panjang gelombang maksimum untuk pembuatan kurva kalibrasi
terlebih dahulu. Panjang gelombang maksimum merupakan panjang
gelombang dimana didapatkan absorbansi maksimum pada sampel. Pemilihan
panjang gelombang maksimum ini, ditentukan dengan maksud untuk
mendapatkan absorbansi maksimum dari suatu larutan baku pada konsentrasi
tertentu sehingga didapatkan kepekaan yang tinggi untuk dapat ditentukan
kurva kalibrasinya. Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas
antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik
dengan transmitan, dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa
pembatasan, yaitu sinar yang digunakan dianggap monokromatis, penyerapan
terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama, senyawa
yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain
dalam larutan tersebut, tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi, dan indeks
bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan kurva kalibrasi menunjukkan
hubungan antara konsentrasi baku dan absorbansi sehingga diperoleh

persamaan regresi linier. Persamaan regresi ini digunakan untuk menghitung

kadar protein didalam sampel. Larutan standar yang digunakan dalam
percobaan ini adalah albumin standar. Albumin standar digunakan bertujuan
sebagai pembanding antara sampel yang akan diuji. Larutan stok adalah
larutan yang dibuat diawal dengan konsentrasi tinggi untuk mempermudah
pembuatan larutan seri konsentrasi dengan pengenceran. Tujuan dibuatnya
larutan stok adalah untuk menghindari penimbangan yang berulang-ulang
dalam setiap pembuatan larutan seri konsentrasi dan mempermudah
pengerjaan. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan membuat seri
konsentrasi dengan menggunakan albumin standar yang diencerkan dengan
aquadest dengan penambahan pereaksi biuret. Tujuan dari pengenceran ini
yaitu untuk menurunkan konsentrasi albumin, karena jika terlalu tinggi maka,
albumin yang akan bereaksi dengan biuret akan terlalu pekat sehingga
mengganggu proses pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer. Setelah
pembuatan larutan seri konsentrasi albumin standar maka dibuat blanko
standar yang berisi pereaksi biuret dengan aquades, fungsi dari blanko yaitu
untuk mengukur serapan pereaksi yang digunakan sehingga jumlah serapan
protein sendiri adalah nilai absorbansi larutan standar atau sampel
(mengandung pereaksi) dikurang dengan serapan pereaksinya. Sedangkan
larutan seri konsentrasi berfungsi untuk menentukan kurva kalibrasi dimana
masing-masing larutan seri konsentrasi tersebut akan dibaca absorbansinya
dengan spektrofotometer sehingga dapat ditentukan panjang gelombang
maksimum dan kurva kalibrasinya.
Pada penentuan kurva kalibrasi ini didapatkan nilai a = -0,17; b =
0,000204; dan nilai r = 0,9565, sehingga didapat persamaan regresi linear y =
0,000204x 0,017. Koefisien korelasi menunjukkan adanya hubungan
proporsional antara absorbansi dan konsentrasi larutan. Nilai r positif
menunjukkan korelasi yang berbanding lurus antara konsentrasi terhadap
absorbansinya pada rentang konsentrasi larutan standar tersebut. Koefisien
korelasi (r) dikatakan baik apabila mendekati 1. Nilai r yang diperoleh pada
percobaan berada dalam rentang nilai antara -1 R 1 dan mendekati 1,

sehingga dapat dikatakan linearitas data yang diperoleh antara konsentrasi dan
absorbansi cukup baik dan metode tersebut dapat digunakan untuk analisis
kadar protein.
Prinsip dari spektofotometri berdasarkan hukum Lambert-Beer adalah
apabila cahaya monokromatik melalui suatu media maka serapan cahaya
tersebut diserap dan sebagian dipancarkan. Energi cahaya yang diserap
kemudian akan diubah menjadi listrik dan fotosel yang akan dicatat, dimana
besarnya energi listrik sebanding dengan sinar atau cahaya yang masuk
sehingga semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap.
Metode biuret merupakan metode yang digunakan untuk menunjukkan
adanya senyawa-senyawa yang mengandung ikatan peptida (gugus amida).
Uji biuret merupakan jenis pengujian untuk identifikasi protein secara umum.
Berarti uji Biuret akan selalu memberikan hasil positif untuk semua jenis
protein. Keuntungan dari metode biuret ini adalah bahan yang digunakan
relatif murah akan tetapi kelemahan dari metode ini adalah sensitivitas
terhadap bahan yang diidentifikasi rendah sehingga diperlukan bahan dalam
jumlah yang tidak sedikit.
Reagen biuret terdiri dari CuSO4, KI, Na-sitrat, Na2CO3 dan NaOH.
CuSO4 sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks
dengan protein. KI berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+
sehingga tidak mengendap. Na-sitrat dan Na2CO3 berfungsi sebagai buffer dan
NaOH berfungsi sebagai penyedia suasana basa. Suasana basa akan membantu
membentuk Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Hal ini
membantu untuk membentuk kompleks dengan nitrogen dari karbon dari
ikatan peptida dalam larutan basa. Perubahan pada warna sampel uji akan
memberikan hasil yang positif atau negatif.
Prinsipnya adalah pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks
berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu2+ dalam
suasana basa. Terjadinya warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu 2+ dan N,
dimana Cu2+ sebagai asam lewis dan N sebagai basa lewis. Makin panjang
suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan makin

pekat. Reagen Biuret adalah larutan berwarna biru muda, yang berubah
menjadi ungu bila bercampur dengan larutan yang mengandung protein.
Sebuah kompleks berwarna ungu terbentuk ketika ion tembaga dari reagen
biuret bereaksi dengan ikatan peptida pada rantai polipeptida. Uji biuret ini
dapat digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan peptida dalam
suatu senyawa sehingga uji biuret dapat dipakai untuk menunjukan adanya
senyawa protein.
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menimbang sampel dan
kemudian diencerkan dengan aquades pada labu. Fungsi penambahan aquadest
ini adalah sebagai pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel,
kemudian ditambah NaOH 0,5 M untuk membantu melarutkan sampel, NaOH
dapat menyebabkan hidrolisis ikatan peptida dari polimer protein sehingga
sampel dapat larut dalam aquades. Setelah itu, ditambah dengan pereaksi
biuret dan didiamkan 10 menit kemudian ditambahkan aquades dan
dihomogenkan. Tujuan dari didiamkan adalah untuk memberi waktu bagi
pereaksi biuret untuk bereaksi dengan protein dalam sampel dan tujuan dari
penambahan biuret adalah agar Cu2+ yang terdapat pada biuret dapat
membentuk ikatan kompleks ungu dengan protein pada sampel. Tujuan
penghomogenan adalah untuk mempercepat reaksi antara protein dengan
pereaksi biuret dengan cara meningkatkan kontak antara protein dengan ion
Cu2+ yang terdapat pada pereaksi biuret. Selanjutnya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang maksimum 550 nm dan kemudian ditentukan kadar
protein total.
Dari hasil pengukuran kadar protein total pada sampel, didapatkan kadar
protein total pada susu kedelai, telur bebek, susu sapi, telur ayam kampung,
telur ayam ras dan telur puyuh yang didapat dari perhitungan berturut-turut
adalah 12,59%, 1,76%, 37,54%, 2,30%, 1,91%, 0,98%. Berdasarkan data yang
diperoleh kadar protein dari yang paling besar ke yang terkecil yaitu susu sapi,
susu kedelai, telur ayam kampung, telur ayam ras, telur bebek, telur puyuh,
hal ini tidak sesuai dengan literatur yang menyatakan kadar protein dari tinggi
ke rendah yaitu telur ayam kampung, telur puyuh, telur bebek, telur ayam ras,

susu sapi, susu kedelai. Kesalahan yang

terjadi dikarenakan saat

penghomogenan tidak homogen secara sempurna dan adanya koloid pada susu
yang mengakibatkan absorbansi yang diperoleh tidak tepat sehingga kadar
yang diperoleh kurang tepat.

G. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Kadar protein susu kedelai adalah 12,59%

Kadar protein susu sapi adalah 37,54%
Kadar protein telur ayam kampung adalah 2,30%
Kadar protein telur ayam ras adalah 1,91%
Kadar protein telur bebek adalah 1,16%
Kadar protein telur puyuh adalah 0,98%

DAFTAR PUSTAKA
Carpette. 2005. An Introduction to Practical Biochemistry. Mc Graw Hill Book
Company: Great Britany
Husni, Elidahanum. 2008. Analisa Zat Pengawet dan Protein dalam Makanan Siap
Saji Sosis. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi Vol. 13 No.1
Katili, Abu Bakar Sidik. 2009. Struktur dan Fungsi Protein Kalogen. Jurnal
Pelangi Ilmu Vol. 2 No. 5
Lehninger, Albert L, 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Penerbit Erlangga:
Jakarta.
Maharani, Endang Triwahyuni dan Yusrin. 2010. Kadar Protein Kista Artemia
Curah yang dijual Petambak Dikota Kembang dengan Variasi Suhu
Penyimpanan. Jurnal Pra Sidang Seminar Nasional Vol. 1 No. 1
Poedjiadi, Anna. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia Press:
Jakarta
Sandjaja. 2009. Kamus Gizi. Penerbit Buku Kompas: Jakarta
Sumarni. 2002. Estimasi Kadar Protein Dalam Bahan Pangan Melalui Analisis
Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino. Jurnal Majalah Farmasi
Indonesia Vol. 1 No. 13