Efisiensi Saccharomyces cerevisiae dan bakteri asam laktat strain untuk mengikat

aflatoksin M1 di UHT susu skim

Departemen Teknik Pangan, Sekolah Ilmu Hewan dan Teknik Pangan, Universitas So Paulo,
Av. Duque de Caxias Norte, 225, CEP 13635-900, Pirassununga, SP, Brazil
ABSTRAK
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kemampuan strain Saccharomyces
cerevisiae dan kolam tiga bakteri asam laktat (BAL) strain (Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus delbrueckii spp bulgaricus. dan Bifidobacterium lactis), sendiri atau dalam
kombinasi, untuk mengikat aflatoksin M1 (AFM1) di UHT (ultra-tinggi suhu) susu skim
dibubuhi 0,5 ng AFM1 mL? 1. Semua kolam LAB (1010 sel mL? 1) dan S. Cerevisiae (109
sel mL? 1) sel yang panas dibunuh (100? C, 1 jam) dan kemudian digunakan untuk
memeriksa pengaruh waktu kontak (30 menit atau 60 menit) pada toksin yang mengikat
dalam susu skim pada 37? C. Persentase rata-rata dari AFM1 terikat oleh kolam LAB dalam
susu adalah 11,5? 2,3% dan 11,7? 4,4% selama 30 menit dan 60 menit, masing-masing.
Dibandingkan dengan kolam renang LAB, sel S. cerevisiae memiliki tinggi (P <0,05)
kemampuan untuk mengikat AFM1 dalam susu (90,3? 0,3% dan 92,7? 0,7% selama 30 menit
dan 60 menit, masing-masing), meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan antara waktu
kontak dievaluasi. Bila menggunakan S. cerevisiae LAB kolam renang, peningkatan yang
signifikan (P <0,05) diamati pada persentase AFM1 terikat (100,0%) selama 60 menit. Hasil
uji coba ini menunjukkan bahwa sel-sel S. cerevisiae panas dibunuh, sendiri atau dalam
kombinasi dengan kolam renang LAB digunakan, memiliki aplikasi potensial untuk
mengurangi konsentrasi AFM1 dalam susu.
INTRODUCE
Aflatoksin adalah metabolit sekunder dari berat molekul rendah dihasilkan oleh jamur
berfilamen, terutama Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus dan Aspergillus nomius,
dibedakan dengan mereka distribusi yang luas dalam makanan dan sifat beracun diucapkan
(Moss, 1998). Saat ini ada 18 senyawa yang sama dijelaskan oleh aflatoksin istilah, tetapi
yang paling umum dan beracun adalah aflatoksin B1 (AFB1) (Murphy, Hendrich, Landgren,
& Bryant, 2006). Ketika AFB1 di pakan terkontaminasi yang dicerna oleh ternak, termasuk
sapi perah, itu adalah biotransformed dalam hati untuk aflatoksin M1 (AFM1), seorang
terhidroksilasi metabolit yang diekskresikan dalam air susu, jaringan dan cairan biologis
hewan (Prandini et al., 2009). Meskipun AFM1 adalah sekitar 10 kali lebih sedikit toksigenik
dari AFB1, sitotoksik yang, genotoksik dan efek karsinogenik telah dibuktikan pada beberapa
spesies (Murphy et al., 2006). Badan Internasional untuk Penelitian Kanker (2002) telah
mengklasifikasikan AFM1 sebagai milik Grup 1, karsinogen manusia.
Susu adalah nutrisi utama bagi perkembangan anak-anak, yang kepekaan terhadap aflatoksin
yang luar biasa dan berpotensi lebih besar dari orang dewasa (Galvano, Galofaro, dan
Galvano, 1996). Memperhitungkan risiko kesehatan yang berhubungan dengan paparan
aflatoksin diet tingkat, beberapa negara telah mengadopsi batas toleransi untuk AFM1 di susu
(Prandini et al., 2009), namun batas regulasi sangat berbeda (Van Egmond & Jonker, 2004).

Sementara di Brazil dan Amerika Serikat yang tingkat maksimum dari AFM1 dalam susu
cairan 0,5 mg L? 1 (Agncia Nacional de vigilancia sanitaria 2011, hlm. 72e73), yang Uni
Eropa telah membentuk sepuluh kali lipat batas bawah (0,05 mg L? 1) untuk AFM1 dalam
susu mentah, susu panas dirawat dan susu untuk pembuatan produk susu (Komisi Eropa,
2006). Idealnya, cara terbaik untuk mencegah kontaminasi aflatoksin dalam rantai makanan
adalah penerapan praktek pertanian meningkat dan kontrol kondisi penyimpanan produk.
Namun, kesulitan praktis untuk secara efektif mencegah kontaminasi, bersama dengan
stabilitas dari aflatoksin dalam kondisi pengolahan makanan normal, telah menyebabkan
Investigasi metode dekontaminasi untuk produk makanan yang bisa aman, efektif, ramah
lingkungan dan penyajian biaya-manfaat (Wu et al., 2009). Penggunaan mikroorganisme
menawarkan alternatif yang menarik untuk kontrol atau penghapusan aflatoksin dalam bahan
makanan (Alberts, Gelderblom, Botha, & Van Zyl, 2009). Saccharomyces cerevisiae adalah
yang paling efektif untuk mengikat AFB1 (Shetty & Jespersen, 2006), meskipun beberapa
bakteri asam laktat (LAB) strain telah menunjukkan kemampuan yang berbeda untuk
mengikat AFM1 di larutan buffer fosfat dan susu (Bovo, Corassin, Rosim, & Oliveira, 2012;
El-Nezami, Kankaanp, Salminen, & Ahokas, 1998; Haskard, El-Nezami, Kankaanp,
Salminen, & Ahokas, 2001; Kabak & Var, 2008; Pierides, El-Nezami, Peltonem, Salminen, &
Ahokas, 2000). Tidak ada laporan sebelumnya tentang penggunaan S. cerevisiae untuk
dekontaminasi susu yang mengandung AFM1. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini
adalah untuk mengevaluasi kemampuan strain S. cerevisiae, sendiri atau dalam kombinasi
dengan kolam tiga yang tersedia secara komersial Strain LAB, untuk mengikat AFM1 di
UHT (suhu tinggi ultra) skim susu dibubuhi 0,5 mg AFM1 L? 1, selama masa kontak 30
menit dan 60 menit.
2. Material and methods
2.1. S. cerevisiae and LAB strains
Tersedia secara komersial kering regangan bir ragi (S. cerevisiae,
SAFLAGER W37 / 70, Fermentis Ltd, Perancis) dan tiga strain LAB
(Lactobacillus delbrueckii spp bulgaricus. LB 340, Lactobacillus rhamnosus
HOWARU? dan BI07 Bifidobacterium lactis FLORA-FIT disumbangkan
oleh Danisco Ltd, Brasil) yang digunakan dalam percobaan. strain LAB
sebelumnya telah dievaluasi dan menunjukkan persentase individu
penghapusan AFM1 dalam susu UHT pada 37? C mulai 24,5-33,5%
(Bovo et al., 2012).
Ragi liofilisasi yang diaktifkan dengan air steril dan
dibudidayakan di 23? C, menurut rekomendasi dari Fermentis Ltd.
Jumlah sel ragi dalam suspensionwas ditentukan oleh cahaya
mikroskop menggunakan ruang Neubauer dimodifikasi. suspensi
diencerkan dengan air steril sampai mencapai konsentrasi sel
1.0? 109 sel mL? 1.
LAB individu strain liofilisasi yang diaktifkan di MRS (de
Man, Rogosa dan Sharpe) kaldu (Acumedia ?, Lansing, MI, USA) dan
diinkubasi pada 37? C sampai mencapai setidaknya 1,0? 109 koloni membentuk
unit (CFU) mL? 1, sebagaimana ditentukan oleh pengenceran serial dan pour plate
menghitung (Wehr & Frank, 2004) setelah inkubasi pada 37? C selama 24 jam
dalam kondisi anaerob. Volume nyaman setiap berbudaya
kaldu dicampur untuk mencapai kolam dari tiga strain LAB mengandung
konsentrasi sel total 1,0? 1010 sel mL? 1. Semua S.
cerevisiae dan LAB sel panas tewas, sedang tidak aktif oleh

mendidih pada 100? C selama 1 jam sebelum tes mengikat, untuk menghindari
mungkin fermentasi susu selama waktu kontak.
2.2. Afatoxin M1 binding assays
Kemampuan S. cerevisiae dan LAB strain untuk mengikat AFM1 adalah
dievaluasi dengan menggunakan UHT komersial sampel susu skim sebelumnya
dievaluasi untuk AFM1 untuk mengkonfirmasi tingkat di bawah batas deteksi
metode (0,01 ng mL? 1), dibubuhi 0,5 ng mL? 1. standar AFM1
solusi (Supelco ?, Bellefonte, PA, USA) diencerkan dalam
asetonitril untuk mendapatkan 2,5 mg mL? 1 solusi kerja,
yang dikalibrasi menurut Scott (1990). Dua ratus
mikroliter larutan kerja dipindahkan ke Erlenmeyer,
diuapkan sampai kering di bawah N2 dan kemudian 1 L UHT skim
susu ditambahkan ke tabung. Sampel susu berduri diaduk, terus
pada 37? C selama 15 menit, dan segera digunakan dalam tes mengikat
dengan S. cerevisiae dan strain LAB
Alat tes AFM1 mengikat dilakukan dalam rangkap tiga sebagai
dijelaskan oleh Pierides et al. (2000) dengan beberapa modifikasi.
Volume nyaman kaldu budaya yang mengandung 109 sel
S. cerevisiae, 1010 sel LAB kolam renang, atau 109 sel S. cerevisiae 1010
sel LAB renang dipindahkan ke tabung Eppendorf dan disentrifugasi
(Microcentrifuge CT-14000, Cientec, Piracicaba, SP, Brazil)
pada 1800 g selama 15 menit. Supernatan dibuang dan
pelet bakteri atau ragi dicuci dua kali dengan ultra murni steril
air (Milli-Q, Millipore, Bedford, MA, USA). Setelah, pelet yang
disuspensi dalam 1,0 mL UHT susu skim mengandung AFM1, vortexed
selama 3 menit dan diinkubasi pada 37? C selama 30 menit atau 60 menit. berikut
waktu kontak, tabung disentrifugasi lagi pada 1800 g untuk 15 menit, menjadi supernatan
(lapisan susu) dihapus karena analisis
AFM1. Prosedur yang sama seperti dijelaskan di atas dilakukan pada
rangkap tiga kontrol positif (hanya berduri susu skim mengandung 0.5
AFM1 mg L? 1), kontrol negatif (hanya S. cerevisiae, LAB kolam renang atau S.
cerevisiae LAB kolam renang) dan kontrol susu skim non-berduri.
2.3. Analysis of afatoxin M1 in milk
Ekstraksi dan pemurnian supernatant dari mengikat
tes untuk penentuan AFM1 dilakukan seperti yang dijelaskan oleh
Fernandes, Correa, Rosim, Kobashigawa, dan Oliveira (2012), dengan
beberapa adaptasi yang diusulkan oleh produsen immunoaffinity yang
kolom (NeoColumn ?, Neogen, Neogen Europe Ltd,
Scotland, UK). Identifikasi dan kuantifikasi residu AFM1
dicapai dengan menyuntikkan 20 ml ekstrak sampel dalam tinggi
kromatografi cair kinerja (HPLC), menggunakan Shimadzu
(Kyoto, Jepang) kromatografi cair 10VP dengan fluoresensi 10 AXL
detektor (eksitasi pada 366 emisi nmand atas 428 nm). A
Sinergi Fusion kolom (4,6? 150 mm, 4 mm, Phenomenex, Torrance,
CA, USA) dan pra-kolom Shim-Pack (4? 10 mm, 5 mmCLC
G-BPO) yang digunakan. Para systemwas stabil selama satu jam pada aliran

tingkat 1 mL / menit pada suhu kamar dengan ponsel isokratik

fase yang mengandung air, asetonitril dan metanol (60:20:20).
Dengan kondisi tersebut, waktu retensi untuk AFM1 adalah sekitar
5.7 min. Kurva kalibrasi dari AFM1 disusun dengan menggunakan
solusi standar AFM1 (Sigma, St Louis, MO, USA) sebelumnya
dievaluasi menurut Scott (1990), pada konsentrasi 0.5,1.0, 2.5,
5.0 dan 10,0 ng mL? 1. Batas penentuan analitis
Metode adalah 0,01 ng mL? 1, dianggap sebagai jumlah minimum
AFM1 yang bisa menghasilkan kromatografi puncak tiga kali lipat
baseline standar deviasi.
Para belowwas Persamaan yang digunakan untuk menentukan persentase AFM1
terikat oleh mikroorganisme diuji dalam setiap uji. Surat B, C, E Dand
adalah bidang utama puncak kromatografi kontrol positif, nonspiked
skim kontrol susu, sampel dianalisis dan negatif kontrol,
masing-masing.
A
_
B _ C _ D _ E_
B_C
_
*100

2.4. Statistical analysis

Analisis statistik tes mengikat AFM1 dilakukan di
General Linear Model SAS? (SAS, 2004) dengan menggunakan uji Tukey
perbedaan yang signifikan antara mikroorganisme diuji (S.
cerevisiae, LAB dan S. cerevisiae LAB) dan waktu kontak pada P <0,05.
3. Results and discussion

Tabel 1 menunjukkan tingkat AFM1 di UHT skim sampel susu di

mengikat tes dengan sel S. cerevisiae panas dibunuh, sendiri atau dalam
kombinasi dengan sel LAB kolam renang. Tingkat AFM1 dalam susu skim berduri
sampel (0,5 ng AFM1 mL? 1) diobati dengan sel LAB kolam renang (1.010 sel
mL 1?) selama 30 dan 60 menit berkisar antara 0.442? 0.022 untuk
0,443? 0,011 ng mL? 1. Untuk susu diobati dengan sel S. cerevisiae (109
sel mL? 1) selama waktu kontak yang sama, atau S. cerevisiae LAB
sel selama 30 menit, konsentrasi rata-rata AFM1 adalah 0,037? 0.004
ke 0,048? 0,002 ng mL? 1 dan 0.042? 0,003 ng mL? 1, masing-masing.
Sampel susu diobati dengan S. cerevisiae sel LAB kolam renang selama 60 menit
tidak tingkat terdeteksi AFM1.
Persentase AFM1 terikat di UHT susu skim oleh
mikroorganisme dipelajari setelah waktu kontak yang berbeda disajikan
pada Tabel 2. LAB renang menunjukkan persentase rata-rata AFM1 terikat
11.5? 2,3% dan 11,7? 4,4% selama 30 menit dan 60 menit, masing-masing.

HASIL
Dibandingkan dengan kolam renang LAB, sel S. cerevisiae memiliki tinggi (P <0,05)
kemampuan untuk mengikat AFM1 dalam susu (90,3? 0,3% dan 92,7? 0,7% untuk
30 menit dan 60 menit, masing-masing), meskipun tidak ada perbedaan

(P> 0,05) antara waktu kontak dievaluasi. bila menggunakan

S. cerevisiae LAB kolam renang, peningkatan yang signifikan (P <0,05) adalah
diamati dalam persentase AFM1 terikat dalam waktu kontak,
yang nilai adalah 91,7? 0,5% (30 menit) dan 100,0% (60 menit).
Persentase AFM1 terikat oleh kolam LAB diperoleh di
penelitian ini berada dalam perjanjian dengan yang dilaporkan oleh Pierides et al.
(2000), yang mengamati bahwa sel-sel panas membunuh L. rhamnosus terikat
18,8% dari AFM1 di dilarutkan susu bubuk skim dan 26,0% dari
racun di dilarutkan susu bubuk setelah 16 jam dari kontak.
Peltonen, El-Nezami, Haskard, Ahokas, dan Salminen (2001) juga
persentase mengikat serupa yang ditemukan (5.6e25.7%) bila menggunakan 15 LAB
strain untuk menghilangkan AFB1 dari larutan buffer fosfat.
Dengan demikian, Kabak dan Var (2008) mengamati perbedaan
mengikat persentase untuk AFM1 oleh layak (7.85e25.94%) dan nonviable
sel (12.85e27.31%) dari Lactobacillus dan Bifidobacterium
strain selama 4 jam.
Dengan temuan studi ini dan lain-lain yang dikutip, jelas bahwa
viabilitas bakteri bukan merupakan prasyarat untuk menghilangkan AFM1 oleh LAB.
Meskipun mekanisme aksi mikroorganisme ini pada
aflatoksin belum dijelaskan lagi, telah hipotesis
terjadinya persatuan fisik dengan komponen dinding sel bakteri,
terutama untuk polisakarida dan peptidoglikan, bukan
melalui kovalen mengikat atau degradasi oleh mikroorganisme
metabolisme (Lahtinen, Haskard, Ouwehand, Salminen, & Ahokas,
2004; Shetty & Jespersen, 2006). Namun, kedua polisakarida
HASIL
dan peptidoglikan dinding sel bakteri diharapkan sangat
dipengaruhi oleh perlakuan panas, menyebabkan denaturasi protein
dan meningkatkan sifat hidrofobik permukaannya. Hal ini dianggap
bahwa gangguan tersebut masih memungkinkan aflatoxin untuk mengikat bakteri
dinding sel, dan juga untuk komponen membran plasmatic yang
yang tidak tersedia ketika dinding sel utuh (Haskard et al., 2001).
Jadi integritas komponen dinding sel bakteri adalah penting dalam
proses penghapusan aflatoksin. Hernandez-Mendoza, GuzmandePea, dan Garcia (2009) menyimpulkan bahwa kedua sel bakteri
dinding dan fragmen dimurnikan mereka mampu menghapus AFB1 yang
dari media, tetapi ketika kehilangan atau kerusakan dinding sel
(total atau sebagian) terjadi sebagai respons terhadap pengobatan enzimatik,
penurunan yang signifikan dalam kapasitas penghapusan diamati.
Dalam penelitian kami, sel S. cerevisiae terikat 90,3? 0,3% dan
92,7? 0,7% dari AFM1 konten dalam susu skim selama 30 menit dan 60 menit,
masing-masing. Tidak ada laporan sebelumnya tentang penggunaan S. cerevisiae untuk
dekontaminasi susu mengandung AFM1, meskipun tingkat penghapusan
dari AFB1 dari feed hampir 90% diperoleh oleh penulis lain
(Devegowda, Arvind, & Morton, 1996; Santin et al, 2003.). itu
Mekanisme yang terlibat dalam S. cerevisiae kemampuan untuk mengikat aflatoksin
masih belum jelas. Saat ini diterima bahwa dinding sel ragi memiliki
kemampuan untuk menyerap toksin (Bueno, Casale, Pizzolitto, Solano, &

Olivier, 2006; Parlat, Ozcan, & Oguz, 2001; Raju & Devegowda,
2000). Bueno et al. (2006) dan Lee et al. (2003) menyimpulkan bahwa
kedua sel S. cerevisiae layak dan non-layak memiliki adsorben yang sama
kemampuan untuk mengikat AFB1, yang sesuai dengan data
penghapusan AFM1 oleh S. cerevisiae dalam susu seperti yang dilaporkan dalam penelitian
ini.
Ketika sel-sel panas membunuh S. cerevisiae digunakan dengan LAB, yang
efisiensi penyisihan AFM1 sedikit meningkat dalam kontak 30 menit
waktu, dan sepenuhnya efektif (100%) ketika diinkubasi selama 60 menit.
Tidak ada studi sebelumnya mengevaluasi penggunaan seiring S.
cerevisiae dan LAB untuk menghilangkan AFM1. Peningkatan mengikat
persentase dapat dijelaskan oleh efek aditif antara S.
cerevisiae dan LAB sel, karena adanya sejumlah besar
Sel-sel yang tersedia untuk penyerapan AFM1. Meskipun tingkat rendah
AFM1 dalam susu dapat dicapai dengan pencegahan melalui pengendalian
Tingkat kontaminasi AFB1 dalam pakan, hasil kami menunjukkan bahwa nonviable
sel S. cerevisiae dan LAB strain mungkin berguna untuk
benar-benar menghapus AFM1 dari susu mengandung sampai 0,5 ng mL? 1,
tanpa perubahan dalam rasa atau keasaman susu melalui fermentasi.
Namun, tidak hanya strain, waktu kontak dan kelangsungan hidup
sel dapat mempengaruhi pada pembentukan dan stabilitas S. cerevisiae
dan / atau e LAB kompleks aflatoksin. Faktor-faktor lain seperti
konsentrasi mikroorganisme dalam susu, kadar AFM1, pH dan
Suhu inkubasi dapat mengubah efisiensi mikroorganisme
untuk menghilangkan aflatoksin dari produk makanan (Bovo et al, 2012.;
El-Nezami, Mykknen, Haskard, Salminen, & Salminen, 2004; Tempat teduh
et al., 2003). Dengan demikian penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki
pengaruh variabel dalam kemampuan S. cerevisiae atau sel LAB
untuk mengikat AFM1 dalam susu.
KESIMPULAN
Sel-sel S. cerevisiae panas-dibunuh, sendiri atau dalam kombinasi dengan
LAB kolam renang yang digunakan, memiliki efisiensi tinggi (> 90%) untuk mengikat AFM1
di UHT milks dalam waktu yang relatif singkat, karena tidak ada perbedaan dalam
racun mengikat antara waktu kontak 30 atau 60 menit. Sehubungan Dengan Itu
metode penghapusan aflatoksin menggunakan S. cerevisiae, LAB dan S.
cerevisiae LAB, terutama mereka strain yang sudah saat ini
digunakan dalam produk makanan, memiliki aplikasi potensial untuk mengurangi
tingkat AFM1 dalam susu. Namun, penelitian tambahan diperlukan untuk
menyelidiki mekanisme yang terlibat dalam proses penghapusan
racun oleh S. cerevisiae dan / atau LAB dan faktor-faktor yang mempengaruhi
stabilitas penyerapan toksin bertujuan aplikasi komersial
dalam industri susu.