IsolasiDNA Dan RNA

ISOLASI DNA DAN RNA
Prinsip yang mendasari tehnik isolasi DNA dan RNA

- DNA dan RNA merupakan materi penyimpan informasi tentang identitas
organisme. Materi tersebut diperoleh dari induknya dan dapat diturunkan
ke anaknya
- Setiap sel yang mampu melakukan pembelahan memiliki materi genetik.
Untuk mendapatkan (mengisolasi) materi genetik tersebut harus dilakukan
pemecahan sel.
- Untuk mempelajari karakter molekuler suatu gen, sering memerlukan
pendekatan dengan menggunakan organisme model
- Organisme model yang sederhana adalah bakteri yakni E. coli dan yeast
(S. cerevisiae).
- Untuk mempelajari tentang materi genetik manusia sering dipakai model
dengan menggunakan sel yang berasal dari mencit, tikus atau Kultur sel
manusia
- Sel prokariotik, bakteri, dan tumbuhan memiliki dinding sel, sedangkan sel
hewan hanya memiliki membran sel.
10/7/2014
TekLabGen/Rarastp/BioUGM
Prinsip dari isolasi

DNA atau RNA
yakni membebaskan
DNA dari
bahan penyusun sel
lainnya
(lipid, protein,
karbohidrat dan
biomolekul lainnya).
Untuk membebaskan
materi genetik,
sel harus dipecah
(membran
lipid dibuat lisis dan
enzim perusak
asam nukleat
(nuklease) harus
di nonaktifkan.
10/7/2014
Sel yang menyusun tubuh umumnya memilki inti sel yang berisi materi genetik
DNA dan RNA. Sel tubuh dapat berada dalam kondisi interfase (sintesis DNA)
atau mitosis (pembelahan sel). Pada saat isolasi DNA genom sel bisa berada
dalam berbagai fase siklus sel,
10/7/2014
DNA genom banyak mengandung protein yang berinteraksi dengan DNA, antara
lain protein histon, enzim DNA maupun RNA polimerase, protein regulator dll.
10/7/2014
10/7/2014
10/7/2014
Tahapan teknik isolasi asam nukleat (DNA dan RNA). Larutan fenol diperlukan
untuk mengendapkan protein yang tercampur dengan asam nukleat.
10/7/2014
DNA yang terlarut dalam bufer dapat dipresipitasikan dengan garam sodium
asetat dan ethanol dingin. Apabila jumlah DNA cukup banyak maka dapat diambil
dengan batang gelas. Apabila DNA tidak dapat diambil dengan batang gelas
maka dapat diendapkan dengan sentrifugasi.
10/7/2014
Prinsip teknik isolasi DNA bakteri (E. coli).
10/7/2014
Dalam menggunakan bakteri sebagai organisme uji, maka diperlukan pembuatan

media untuk memperbanyak sel bakteri (materi genetiknya). Berikut adalah
contoh media cair yang sering dipakai untuk menumbuhkan bakteri.
10/7/2014
10
Salah satu cara penentuan konsentrasi (jumlah sel) untuk mendapatkan kondisi
ideal dalam isolasi DNA.
10/7/2014
11
Pemanenan sel bakteri dengan teknik sentrifugasi.
10/7/2014
12
Prinsip isolasi DNA plasmid pada E. coli.
10/7/2014
13
Jumlah kopi plasmid bisa ditingkatkan dengan menambahkan chloramfinicol pada

media tumbuh,
10/7/2014
14
Salah satu cara memecah dinding sel bakteri dengan cara melisikan sel. Setelah
sel lisis maka DNA dapat dipisahkan dari ekstrak sel.
10/7/2014
15
Bentuk alami dari DNA plasmid, dapat berupa super koil (terpilin) atau sirkuler.
10/7/2014
16
Hasil interpetasi gambaran elektroforesis dari migrasi DNA plasmid

yang memiliki ukuran sama namun struktur yang bervariasi
antara keadaan relaksasi dan superkoil.
10/7/2014
17
Analisis fragmen DNA yang dipotong oleh enzim endonuklease restriksi.
10/7/2014
18
Isolasi DNA virus diawali dengan tahapan pemanenan partikel virus setelah
Virus diinfeksikan pada bakteri (bakteriophage)
10/7/2014
19
Teknik pengendapan partikel virus.
10/7/2014
20
Tahapam isolasi DNA bakteriofag.
10/7/2014
21
Teknik purifikasi DNA atau RNA dengan menggunakan reagen ss-phenol,

chloroform untuk mengikat dan mempresipitasikan protein (pada lapisan tengah),
sedangkan DNA atau RNA ada dilapisan atas. Untuk membersihkan DNA dari
protein dapat juga digunakan proteinase (mendegradasi protein). Apabila DNA
akan dibebaskan dari RNA maka perlu perlakuan dengan RNAse (enzim yang
mendegradasi RNA), sedangkan apabila RNA yang diperlukan, maka bisa
dibebaskan dari DNA dengan menggunakan DNAse.
10/7/2014
22
Setelah mengalami purifikasi DNA atau RNA diendapkan dengan garam (NaCl
atau Na asetat) dan ethanol dingin.
10/7/2014
23
Pengambilan supernatan yang tidak diperlukan dengan teknik hisap vakum.

Cara ini memudahkan mendapatkan pelet yang terendapakan setelah
sentrifugasi.
10/7/2014
24
Presipitan DNA atau RNA murni dapat dilarutkan dengan bufer (TE). Dengan
volume tertentu tergantung banyak sedikitnya DNA. Konsentrasi DNA dapat
ditentukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang () 260 nm. OD 1
setara dengan 50 ug/ml DNA atau 40 ug/ml RNA. Kemurnian DNA dapat
dilihat dengan perbandingan nilai absorbansi pada 260/280 nm dengan nilai
indeks mendekati 2. Kemurnian DNA juga dapat dilihat dengan teknik
elektroforesis.
10/7/2014
25
Teknik menghomogenkan (melarutkan) pelet (DNA) kedalam pelarutnya dengan

menggunakan vorteks.
10/7/2014
26
Pemotongan DNA kromosom dengan enzim endonuklease restriksi pada

berbagai tempat.
10/7/2014
27
DNA hasil amplifikasi dipotong pada ikatan fosfodiester yang memiliki urutan nukleotida
tertentu (misal GAGGTC). Reaksi dikatalisis oleh enzim endonuklease restriksi tertentu
yang memotong pada kedua ujung dan bagian tengah potongan DNA. Hasilnya berupa dua
pita (fragmen) DNA dengan panjang pasang basa yang berbeda.
10/7/2014
28
Prinsip amplifikasi potongan DNA dengan teknik PCR (polymerase chain reaction)
10/7/2014
29
Analisis hasil isolasi DNA atau RNA dengan elektroforesis gel agarosa
- DNA dan RNA merupakan biomolekul yang memiliki muatan negatif
yang dihasilkan oleh ikatan fosfodiester.
-Tehnik elektroforesis merupakan metode standar yang digunakan

untuk analisis, identifikasi dan pemurnian fragmen (potongan) DNA.
-Tehnik ini juga dapat dipakai untuk analisis RNA dan oligonukleotida
- Gel elektroforesis yang dapat dipakai untuk analisis DNA atau RNA
terdiri dari agarose atau poliakrilamid.
- Gel agarose terbuat dari polisakarida yang diekstrak dari Algae,
sehingga tidak berbahaya jika mengenai tubuh.
- Agarosa untuk keperluan analisis DNA atau RNA memiliki tingkat

kemurnian yang tinggi
10/7/2014
30
Pembuatan gel agarose cukup sederhana hanya dengan melarutkan serbuk

agar dengan bufer (TBE = tris-borat EDTA) dan memanaskannya hingga
terlarut kemudian dimasukkan kedalam cetakan.
10/7/2014
31
Konsentrasi agarosa untuk analisis

DNA atau RNA adalah 0,5 hingga
2%.
Makin tinggi konsentrasi agarosa
maka makin kecil pori-pori gel yang
terbentuk, sehingga panjang DNA
yang dapat dipisahkan makin
rendah.
Gel agarosa memiliki kisaran
pemisahan DNA cukup luas yakni
antara 200 50.000 bp, Namun
resolusi yang dihasilkan cukup
rendah.
10/7/2014
32
Resolusi gel agarosa (kemampuan

pemisahan fragmen DNA) lebih
tinggi apabila konsentarsinya
meningkat (2%).
10/7/2014
33
Pemisahan potongan DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis gel agarosa.

Dasar dari teknik ini adalah dalam medan listrik DNA yang bermuatan negatif
(karena adanya gugus fosfat) akan bergerak menuju elektroda positif dan
kecepatannya sesuai dengan panjang pendeknya potongan DNA.
10/7/2014
34
Sidik jari DNA untuk golongan darah ABO dengan mengamplifikasi allel A
dan B.
10/7/2014
35
Hasil potongan DNA dengan enzin endonuklease restriksi tertentu pada suatu
gen marker dapat digunakan sebagai sidik jari DNA untuk menunjukkan
hubungan kekerabatan.
10/7/2014
36
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
PROSEDUR ISOLASI RNA DARI

SAMPEL CAIR
(Micro to Midi RNA isolation Kit / invitrogen )
Kedalam 200 sample tambahkan 200 RNA lysis solution yang
mengandung 1%(v/v) 2-mercaptoethanol (freshly prepared), kemudian
tambahkan 200 100% ETOH, campur dengan baik.
Masukkan ke RNA spin cartridge. Centrifuge 12000g 15dtk 25C. buang
cairan di bawah.
tambahkan 700 Wash bufferI ke cartridge, centrifuge 120000g 15dtk 25C.
Buang cairan dibawah.
Tempatkan spin cartridge ke RNA wash tube bersih. Tambahkan 500
Wash buffer II yang sudah mengandung ETOH ke cartridge. Centrifuge
12000g 15dtk 25C. Buang cairan di bawah.
Tambahkan 500 Wash buffer II yang sudah mengandung ETOH ke
cartridge. Centrifuge 12000g 15dtk 25C. Buang cairan di bawah.
Centrifuge 1 menit untuk mengeringkan membran.
Pindahkan cartridge dari wash tube ke RNA recovery tube
Tambahkan 50 RNAse free water ke cartridge membrane, biarkan 1 menit,
kemudian centrifuge 12000g 2 mnt 25C.
Ulangi langkah 7 sekali lagi. Amankan cairan elusi (dalam collection tube).
Simpan -70C.
10/7/2014
37
Teknik Isolasi RNA
10/7/2014
38
Teknik isolasi mRNA
10/7/2014
39
Teknik isolasi mRNA dengan kolom

kromtografi yang mengandung oligo
(dT).
10/7/2014
40
mRNA dapat dibebaskan

dari kolom dengan cara
elusi.
10/7/2014
41
mRNA dapat diubah menjadi

cDNA dengan menggunakan
primer oligo (dT), enzim reverse
transkriptase dan dNTP.
10/7/2014
42
Perkembangan teknologi memungkinakan isolasi DNA maupun RNA berlangsung

Lebih cepat (+ 1 jam) dengan menggunakan kit.
Kit DNA Extraction

Tissue Lysis. Detergents lyse membranes.
Proteinase K breaks down proteins.
Sample loading onto column. Nucleic acids bind

to membrane and other components flow through.
Column washing. Removes any contaminants.
Elution of DNA. DNA is released from column

and ready for use in downstream applications.
10/7/2014
43
REFERENSI
Materi dan Gambar
Brooker RJ(1999) Genetics: Analysis and Principles. Addison-Wesley

Davis LG, Kuehl WM, Battey, JF (1994) Basic Methods in Molecular Biology.
Second Edition. Prentice-Hall International Inc.
Brown TA(1993) Gene Cloning an introduction. Third edition. Chapman & Hall.
Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning.
A laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
10/7/2014
44

IsolasiDNA Dan RNA

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

IsolasiDNA Dan RNA

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

ISOLASI DNA DAN RNA

Prinsip yang mendasari tehnik isolasi DNA dan RNA

Prinsip dari isolasi

Prinsip teknik isolasi DNA bakteri (E. coli).

Dalam menggunakan bakteri sebagai organisme uji, maka diperlukan pembuatan

Pemanenan sel bakteri dengan teknik sentrifugasi.

Prinsip isolasi DNA plasmid pada E. coli.

Jumlah kopi plasmid bisa ditingkatkan dengan menambahkan chloramfinicol pada

Hasil interpetasi gambaran elektroforesis dari migrasi DNA plasmid

Analisis fragmen DNA yang dipotong oleh enzim endonuklease restriksi.

Teknik pengendapan partikel virus.

Tahapam isolasi DNA bakteriofag.

Teknik purifikasi DNA atau RNA dengan menggunakan reagen ss-phenol,

Pengambilan supernatan yang tidak diperlukan dengan teknik hisap vakum.

Teknik menghomogenkan (melarutkan) pelet (DNA) kedalam pelarutnya dengan

Pemotongan DNA kromosom dengan enzim endonuklease restriksi pada

-Tehnik elektroforesis merupakan metode standar yang digunakan

- Agarosa untuk keperluan analisis DNA atau RNA memiliki tingkat

Pembuatan gel agarose cukup sederhana hanya dengan melarutkan serbuk

Konsentrasi agarosa untuk analisis

Resolusi gel agarosa (kemampuan

Pemisahan potongan DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis gel agarosa.

PROSEDUR ISOLASI RNA DARI

Teknik Isolasi RNA

Teknik isolasi mRNA

Teknik isolasi mRNA dengan kolom

mRNA dapat dibebaskan

mRNA dapat diubah menjadi

Perkembangan teknologi memungkinakan isolasi DNA maupun RNA berlangsung

Kit DNA Extraction

Sample loading onto column. Nucleic acids bind

Column washing. Removes any contaminants.

Elution of DNA. DNA is released from column

Brooker RJ(1999) Genetics: Analysis and Principles. Addison-Wesley

Anda mungkin juga menyukai