BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Alat dan Bahan

3.1.1.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya alat refluks,
maserator, rotary evaporator (IKA HB 10), mikroskop, tabung reaksi, gelas
kimia, kuvet, dan spektrofotometri UV-Vis (Genesys 10).
3.1.2.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan yaitu sampel bunga kecombrang, pelarut nheksan, etanol, metanol, asam asetat, reagen skrining fitokimia, natrium karbonat
7,5% b/v, reagen Folin-Ciocalteu, dan asam galat.
3.2. Determinasi Tumbuhan
Determinasi bahan dilakukan di Laboratorium Herbarium MIPA
Universitas Padjajaran Jatinangor Bandung.
3.3. Penyiapan Bahan
Penyiapan bahan yang dilakukan meliputi pengumpulan bahan, sortasi
kering, pencucian, sortasi basah, penirisan, perajangan, pengeringan, dan
pembuatan serbuk simplisia kering.
3.4. Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
3.2.1.
Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap bunga kecombrang yang
masih dalam keadaan segar dan bubuk simplisia bunga kecombrang. Pemeriksaan
yang dilakukan meliputi bentuk, bau, dan warna.
3.2.2.
Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap bubuk simplisia bunga
kecombrang yaitu untuk melihat karakteristik penanda yang dimiliki oleh bunga

10

11

kecombrang tersebut. Pemeriksaan dilakukan dengan menambahkan larutan

kloralhidrat LP, dipanaskan, kemudian diamati dibawah mikroskop.
3.2.3.
Penetapan Kadar Air
Sebelum dilakukan penetapan kadar air terhadap sampel dilakukan terlebih
dahulu penjenuhan toluen yaitu dengan mencampurkan toluen lebih kurang 200
mL dan 2 mL air ke dalam labu, hubungkan alat. Panaskan labu dengan hati-hati
selama beberapa menit sampai terlihat pemisahan di tabung penerima.
Penyulingan dihentikan jika sudah tidak terjadi penambahan volume air pada
tabung penerima. Setelah itu masukkan sejumlah serbuk simplisia ke dalam labu.
Panaskan labu hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih suling
dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes per detik hingga sebagian air tersuling.
Kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah air
semua tersuling, cuci bagian dalam pendingin dengan toluen sambil dibersihkan
dengan sikat tabung yang disambungkan pada sebuah kawat tembaga dan telah
dibasahi dengan toluen. Lanjutkan penyulingan selama 5 menit. Biarkan tabung
penerima dingin hingga suhu kamar. Jika ada tetes air yang melekat pada
pendingin tabung penerima, gosok dengan karet yang diikatkan pada sebuah
kawat tembaga dan basahi dengan toluen hingga tetesan air turun. Setelah air dan
toluen memisah sempurna baca volume air. Hitung kadar air dalam % (DepKes
RI, 2008).
3.2.4.
Penetapan Kadar Abu
1. Penetapan Kadar Abu total
Lebih kurang 2-3 gram bubuk simplisia dan timbang seksama,
masukkan ke dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijarkan dan
ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, dan

12

timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara
(DepKes RI, 2008).
2. Penetapan Kadar Abu Larut Air
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu didihkan dengan 25 mL
air selama 5 menit, kumpulkan bagian yang larut air, saring melalui kertas
saring bebas abu, cuci dengan air panas, pijarkan hingga bobot tetap,
timbang. Hitung kadar abu yang larut air terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara (DepKes RI, 2008).
3. Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu didihkan dengan 25 mL
asam klorida encer P selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut
asam, saring melalui krus kaca pasir atau kertas saring bebas abu, cuci
dengan air panas, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu
yang tidak larut asam terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
(DepKes RI, 2008).
3.2.5.
Penetapan Kadar Sari
1. Penetapan Kadar Sari Larut Air
Timbang seksama lebih kurang 5 gram serbuk simplisia masukkan ke
dalam labu bersumbat tambahkan 100 mL air jenuh kloroform, kocok
berkali-kali selama 6 jam pertama biarkan selama 18 jam. Saring, uapkan
20 mL filtrat hingga kering dalam cawan dangkal beralas datar yang telah
dipanaskan pada suhu 105 C dan ditara, panaskan sisa pada suhu 105 C
hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam % sari larut air (DepKes RI,
2008).
2. Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Timbang seksama lebih kurang 5 gram serbuk simplisia, masukkan ke
dalam labu bersumbat, tambahkan 100 mL etanol 95% P, kocok berkalikali selama 6 jam pertama, biarkan selama 18 jam. Saring cepat untuk

13

menghindarkan penguapan etanol, uapkan 20 mL fitrat hingga kering

dalam cawan dangkal beralas datar yang telah dipanaskan pada suhu 105
C dan ditara, panaskan sisa pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Hitung
kadar dalam % sari larut etanol (DepKes RI, 2008).

3.2.6.
Penetapan Susut Pengeringan
Timbang seksama 1-2 gram simplisia dalam botol timbang dangkal
bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu penetapan dan ditara.
Ratakan bahan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga
merupakan lapisan setebal lebih kurang 5-10 mm, masukkan dalam oven, buka
tutupnya, keringkan pada suhu penetapan hingga bobot tetap. Sebelum setiap
pengeringan biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam desikator
hingga suhu ruang (DepKes RI, 2008).
3.5. Skrining Fitokimia
Skrining atau penapisan fitokimia yang dilakukan meliputi pemeriksaan
golongan senyawa alkaloid, flavonoid, tanin-polifenol, steroid-triterpenoid,
kuinon, dan saponin. Pemeriksaan skrining fitokimia dilakukan terhadap simplisia
dan ekstrak bunga kecombrang.
3.3.1.
Pemeriksaan Golongan Senyawa Alkaloid
Simplisia dan ekstrak ditambahkan dengan amonia encer digerus dalam
mortir, ditambahkan beberapa mL kloroform sambil terus digerus. Saring, filtrat
dikocok dengan asam klorida 2 N. Lapisan asam dipisahkan, kemudian dibagi
menjadi 3 bagian. Bagian pertama digunakan sebagai blanko. Bagian kedua
ditetesi dengan pereaksi Mayer, kemudian diamati ada atau tidaknya endapan
putih. Bagian ketiga ditetesi dengan pereaksi Dragendorf, kemudian diamati ada
atau tidaknya endapan berwarna jingga coklat.

14

3.3.2.
Pemeriksaan Golongan Senyawa Flavonoid
Simplisia dan ekstrak digerus dalam mortir dengan sedikit air, masukan ke
dalam tabung reaksi yang berisi logam seng dan larutan HCl 2 N. Campuran
dipanaskan beberapa saat, saring. Filtrat ditambah amil alkohol dan dikocok kuatkuat. Adanya flavonoid akan menyebabkan filtrat berwarna merah yang dapat
ditarik oleh amil alkohol.
3.3.3.
Pemeriksaaan Golongan Senyawa Tanin-polifenol
Simplisia dan ekstrak digerus dalam mortir dan dipanaskan dengan air di
atas penangas air, kemudian disaring panas-panas. Filtrat dibagi menjadi 2 bagian,
bagian pertama ditetesi dengan pereaksi besi (III) klorida. Terbentuknya warna
biru hitam menunjukkan adanya polifenolat alam. Bagian kedua ditambahkan
dengan larutan gelatin 1%. Adanya endapan putih menunjukan bahwa dalam
simplisia terdapat tanin.
3.3.4.
Pemeriksaan Golongan Senyawa Steroid-triterpenoid
Simplisia dan ekstrak disari dengan eter, uapkan hingga kering. Pada
residu diteteskan pereaksi Lieberman-Buchard. Terbentuknya warna ungu
menunjukan bahwa dalam simplisia terkandung senyawa kelompok steroidtriterpenoid.

3.3.5.
Pemeriksaan Golongan Senyawa Kuinon
Simplisia dan ektrak digerus dan dipanaskan dengan air, saring. Filtrat
ditetesi larutan NaOH. Terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukan
adanya senyawa kelompok kuinon.
3.3.6.
Pemeriksaan Golongan Senyawa Saponin
Simplisia dan ekstrak ditambahkan air dan digerus dalam mortir hingga
lumat, pindahkan ke dalam tabung reaksi dan tambahkan lagi sedikit air dan

15

panaskan. Setelah dingin tabung dikocok kuat-kuat selama beberapa menit.

Pembentukan busa sekurang-kurangnya setinggi 1 cm dan setelah beberapa menit
busa tidak hilang dengan penambahan asam menunjukan adanya saponin.
3.6. Ekstraksi
Proses ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi dan refluks. Serbuk
bunga kecombrang diekstraksi terlebih dahulu dengan n-heksan. Residu
diekstraksi kembali masing-masing dengan etanol, metanol, dan asam asetat.
Masing-masing filtrat diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotavapor.
Ekstrak yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk pengujian total fenol.
3.7. Penetapan Total Phenolic Content (TPC)
Penetapan total phenolic content dari ekstrak etanol, metanol, dan asam
asetat diperiksa dengan metode Folin-Ciocalteu. Sebanyak 300 l sampel
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, tambahkan 5 mL reagen Folin - Ciocalteu
dan 4 mL natrium karbonat 7,5 % b/v. Campuran didiamkan selama 52 menit pada
suhu kamar, kemudian periksa absorbansi campuran pada panjang gelombang 750
nm. TPC merupakan kadar senyawa fenolik dalam suatu bahan yang dinyatakan
dalam gram (g) ekivalen asam galat (GAE) per 100 gram ekstrak. Nilai TPC
ekstrak dinyatakan ekivalen dengan asam galat yang digunakan sebagai
pembanding untuk pembuat kurva baku (Chan., et al. 2008).
3.8. Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan metode statistik non parametrik. Analisis
data dilakukan dengan uji Kruskal-Wallis dan Mann-Whitney. Metode statistik ini
untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan yang bermakna antara metode
ekstraksi dan variasi pelarut terhadap kadar polifenolat ekstrak bunga
kecombrang.
3.9. Jadwal Pelaksanaan

16

Tabel 3.1 Jadwal Kegiatan

N
o
3
4
5
6
7
8

Kegiatan
Pengumpulan
bahan
Pemeriksaan
mutu simplisia
Skrining
fitokimia
Ekstraksi
Penetapan
total fenol
Pengolahan
data

Maret
April
Mei
Juni
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3