TEST SEROLOGI :

DEMAM TIFOID
&
DEMAM DENGUE
E. M. Hidayat, SpPK
Dep. Patologi Klinik FKUPNVJ

DEMAM TIFOID
Pendahuluan
Demam tifoid : demam yang
ditimbulkan oleh infeksi
beberapa Salmonella (S.
para-typhi A, S. paratyphi B,
S. paratyphi C), khususnya
Salmonella typhi (S.typhi).

Pendahuluan (lanjutan)

Gejala demam tifoid

Biasanya mengenai di saluran
cerna
Gejala demam > satu minggu,
Gangguan pencernaan (seperti
konstipasi).
Gangguan kesadaran (pada
penderita sakit berat).

Pendahuluan (lanjutan)

Masa inkubasi 10 14 hari,

disertai gejala sakit kepala,
lemah, konstipasi, bradikardia
dan mialgia.
Hallmark : demam berlangsung
lama (prolonged and persistent
fever) selama 4 8 minggu pada
penderita yang tidak diobati.

Pendahuluan (lanjutan)

Di Indonesia : penyakit endemik,

berhubungan dengan :
tingkat kesehatan,
tingkat pengetahuan tentang
kesehatan
sanitasi yang buruk.
Penyulit pemberantasan penyakit ini
: adanya pembawa kuman yang
sehat (carrier), dimana fecal-carrier
paling penting.

Pendahuluan (lanjutan)

Diperkirakan 10% penderita

yang sudah sembuh, dalam 3
bulan pertama selalu
mengeluarkan kuman melalui
tinja dan urin
2 5% penderita yang sembuh
akan menjadi permanentcarrier.

Etiologi
Salmonella typhi : basil Gram (-)
bersifat aerobik, tidak berspora,
bergerak dengan rambut getar.
Memiliki 3 macam antigen
Antigen O (somatik), sering
disebut
endotoksin.
Antigen H (flagela)
Antigen Vi (antigen permukaan)

Patogenesis
Salmonella typhi masuk melalui
mulut bersama makanan atau
minuman yang tercemar.
kuman menembus mukosa usus,
masuk aliran limfe usus, berbiak
dan akhirnya masuk peredaran
darah melalui ductus thoracicus.

Patogenesis (lanjutan)

Bakteriemia I terjadi 24 72 jam setelah

kuman masuk.
mencapai organ-organ seperti hati,
empedu, limpa, sumsum tulang dan
ginjal.
Bakteriemia ini berlangsung singkat
akibat fagositosis oleh makrofag,
masih terus berkembang di organ
tertentu (empedu) karena ada kapsel Vi.
Proses ini memerlukan waktu 7 10 hari.

Patogenesis (lanjutan)

Dari kandung empedu, kembali ke usus

halus dan jaringan getah bening,
terutama plaque Peyer.
menimbulkan reaksi peradangan,
hiperplasia dan infiltrasi sel mononuklear,
kemudian kuman kembali masuk ke
sirkulasi darah lagi (bakteriemia II).
Pada bakteriemia II dilepaskan
endotoksin.

Pemeriksaan laboratorium
Darah tepi
Anemia normositik normokrom
Leukopenia (3.000 4.000/uL) pada
fase demam
Aneosinofilia pada permulaan
penyakit
Trombositopenia
Limfositosis relatif

Pemeriksaan laboratorium (lanjutan)

Urin
Proteinuria
Reaksi Diazo (Erlich)

Serologi ( Widal, hemaglutinasi, Elisa,

dsb)

Bakteriologik : isolasi kuman. Sampel

darah, aspirasi sumsum tulang, rose
spot, urin, tinja

Test laboratorium untuk

membantu menegakkan
diagnosis

Test serologis (mendeteksi kenaikan

titer/ kadar antibodi terhadap antigen
S.typhi dan menentukan adanya
antigen spesifik dari S.typhi.
Test biakan untuk mendeteksi kuman
S.typhi dari spesimen darah, urin,
feses, sumsum tulang.
Test Polymerase Chain Reaction (PCR)
untuk mendeteksi DNA spesifik S. typhi.

Bahan Biakan / Kultur

darah, urin, feses, sumsum
tulang.
darah : minggu I atau II sakit
urin : minggu II atau III sakit
tinja : minggu II atau III sakit
sumsum tulang : minggu I sakit.

DIAGNOSIS
Diagnosis demam tifoid sulit
ditegakkan tanpa test
laboratorium, sebab gambaran
klinis penyakit ini sangat bervariasi
dan pada umumnya tidak khas
(spesifik).
Diagnosis pasti : test biakan/kultur
bakteri ditemukan S. typhi.

Test Widal
Reaksi aglutinasi, dikembangkan
pertama kali oleh Widal (1896).
Di daerah non endemik, titer H dan O
> 1: 80 menyokong diagnosis
Di daearh endemik, titer H dan O >
1:160 menyokong diagnosis
Kenaikan titer antibodi > 4x pada
pemeriksaan ulangan 1 atau 2 minggu
kemudian menyokong diagnosis

Prinsip Test Widal.

reaksi aglutinasi.
antigen S.typhi/S.paratyphi bila
dicampurkan dengan serum
penderita demam tifoid yang
mengandung antibodi
terhadap S.typhi/S.paratyphi
akan terjadi aglutinasi.

Peralatan dan bahan

pemeriksaan

serum penderita demam tifoid

antigen somatik (O) dan flagelar (H)
larutan NaCl 0.85% (0.9%)
1 microplate plastik dengan sumursumur kecil
mikropipet dengan tips-nya.
mesin penggoyang (shaker
machine)

Antigen Somatik (O)

Salmonella
Salmonella
Salmonella
Salmonella

grup
grup
grup
grup

A (S.paratyphi A): A-O

B (S.paratyphi B): B-O
C (S.paratyphi C): C-O
D (S. typhi)
:O

Antigen flagelar (H)

Salmonella
Salmonella
Salmonella
Salmonella

grup
grup
grup
grup

A : A-H
B : B-H
C : C-H
D (S.typhi) : H

Persiapan Penderita.
Penderita sebaiknya belum
mendapat terapi antibiotik.
Jenis sampel : serum
penderita tersangka demam
tifoid, tidak hemolisis

Pengambilan sampel.
Pengambilan sampel darah
sebaiknya dilakukan pada fase
akut dan fase konvalesen.

Cara Kerja
Test kualitatif dengan Slide
1. teteskan satu tetes (0.04 mL) serum
penderita (tidak diencerkan) di slide.
2. teteskan satu tetes suspensi antigen
yang telah dikocok homogen di
samping tetes serum.
3. campur serum dan suspensi antigen
dengan batang pengaduk, sebarkan
memenuhi lingkaran pengamatan.

Cara kerja (lanjutan)

goyang slide perlahan-lahan dgn

tangan selama 1 (satu) menit
amati adanya aglutinasi pada slide
baik antigen O dan antigen H.
bila terjadi aglutinasi, lanjutkan test
konfirmasi dengan menggunakan
tabung reaksi untuk menentukan
titer antibodi dalam sampel.
nilai titer = pengenceran yang
masih ada aglutinasi.

Test Kuantitatif dengan Cara

Slide
1. pipet serum sampel yang belum
diencerkan
0.08 mL (80 uL), (nilai 1 : 20)
0.04 mL (40 uL), (1 : 40)
0.02 mL (20 uL), (1 : 80)
0.01 mL (10 uL). (1 : 160)
0.005 mL (5 uL) (1 : 320)

Cara test kuantitatif dengan cara slide (lanjutan)

2. untuk pembanding, pipetkan 0.04

mL kontrol (+) dan 0.04 mL kontrol
(-) di tempat terpisah pada slide.
3. teteskan satu tetes suspensi
antigen yang telah dikocok
homogen ke atas sampel serum,
kontrol (+) & kontrol (-).

Cara test kuantitatif menggunakan slide

(lanjutan)

4. campurkan serum dan suspensi

antigen dengan batang pengaduk
(tusuk gigi), mulai dari pengenceran
terkecil ke pengenceran serum
yang lebih besar,
5. sebarkan campuran sampai
memenuhi lingkaran pengamatan.
6. Lakukan juga terhadap kontrol (+)
dan kontrol (-).

Cara test kualitatif dengan cara slide (lanjutan)

1. putar slide dengan tangan atau

rotator selama 2-3 menit.
2. baca hasil reaksi di bawah
penerangan yang baik. Hasil positip
ditandai dengan adanya aglutinasi.
3. nilai titer antibodi sesuai dengan
nilai pengenceran tertinggi yang
didapat.

Interpretasi test Widal harus

hati-hati
Banyak faktor mempengaruhi hasil
test :
Stadium penyakit.
Pemberian antibiotika
Teknik laboratorium
Test tidak spesifik

TUBEX-TF
Suatu pemeriksaan laboratorium
untuk mendeteksi adanya antibodi
IgM di serum sampel terhadap antigen
S.typhi LPS-O9 (lipopolisakarida)
dengan metoda Immunoassay
Magnetic Binding Inhibition (IMBI).
Tingkat inhibisi setara dengan kadar
antibodi IgM S.typhi dalam sampel

Prinsip Test TUBEX-TF

TUBEX TF mendeteksi adanya antibodi
IgM thd antigen LPS-O9 S.typhi di serum
penderita dengan cara menghambat
reaksi antara antigen berlabel partikel
lateks magnetik(brown reagent) dan
antibodi monoklonal berlabel lateks
warna (blue reagents). Ikatan inhibisi
dipisahkan dgn daya magnetik. Hasil
dinyatakan dalam skala warna (color
scale).

Bahan Pemeriksaan
serum atau plasma heparin.
JANGAN menggunakan plasma EDTA atau
plasma sitrat.
Serum lipemik, hemolisis dan ikterik TIDAK
BOLEH digunakan, karena warna merah dari
hemoglobin (pada hemolisis) atau bilirubin
mengganggu warna yang terbentuk.
pembacaan hasil test. Serum sampel
disimpan pada suhu 28 C atau dibekukan (<
-18C) bila belum akan segera diperiksa.

Peralatan & Reagen

Pipet presisi, vortex dan timer (pencatat
waktu)
Komponen dalam TUBEX TF :
TUBEX TF Brown Reagent, mengandung
antigen coated particles.
TUBEX TF Blue Reagent, mengandung
antibody coated particles.
Negative & Positive Control.
Reaction Well Strip & Sealing Tape
TUBEX TF Colored Sticker

persiapan
Biarkan reagen dan serum pada
suhu kamar.
Kocok (homogenisasikan) semua
reagen sebelum digunakan,
check apakah semua sedimen
telah larut.

Prosedur Test (1)

Letakkan TUBEX Reaction Well Strip
dengan posisi tegak, nomor V-shape
well dihadapan kita.
Teteskan 45 uL TUBEX TF Brown
Reagent pada tiap V-shape Well.
Ag LPS-O9 S.typhi akan melekat pd
partikel magnetik warna coklat

Prosedur Test (2)

Tambahkan 45 uL sampel penderita,
TUBEX TF Positive & Negative
Control dan serum penderita pada
V-shape Well (sumur-V),
campur dengan hati-hati dengan
menggunakan pipet (isap-dorong)
sebanyak 10 x, usahakan agar tidak
terjadi busa.

Prosedur Test (lanjutan)

Di V-shape well :
kontrol positip : Anti IgM Mab
S.typhi berikatan dgn Ag LPS-O9.
serum sampel : serum Ab IgM
S.typhi berikatan dengan Ag LPS-O9

Prosedur Test (3)

Inkubasi selama 2 menit
Tambahkan 90 uL TUBEX TF Blue
Reagent ke semua V-shape well.
Di Well kontrol negatip :
Mab IgM S.typhi melekat pada partikel lateks
warna biru berikatan dgn Ag LPS-O9
Di Well serum sampel :
Reaksi Mab IgM S.typhi dgn Ag LPS-O9 diinhibisi oleh Ab IgM S.typhi dari serum

Prosedur test (lanjutan)

Tutup TUBEX Reaction Well dgn
TUBEX sealing Tape
Homogenisasi 2 menit
Letakkan well strip di atas skala
magnetik untuk reaksi separasi
selama 5 menit.
Interpretasi hasil.

Interpretasi hasil
< 2 negatip tidak menunjukkan
infeksi. Kontrol negatip.
3 borderline pengukuran tidak
dapat disimpulkanm ulangi test. Bila
hasil meragukan, lakukan sampling
ulang beberapa hari kemudian
4 positip lemah menunjukkan
infeksi demam typhoid

Interpretasi (lanjutan)
6-10 positip indikasi kuat demam
typhoid aktif. Kontrol positip.
Indeterminate : ketidakjelasan
pengukuran diakibatkan oleh :
1. Protokol test tidak diikuti dgn baik.
Ulangi test
2. Kualitas sampel kurang baik.
Lakukan sampling ulangi test

Pemeriksaan Serologi
Demam Dengue (IgG/IgM)

Pendahuluan
Demam Dengue disebabkan oleh Virus
Dengue yang disebarkan oleh nyamuk,
Stegomyia aegypti (dulu dikenal sebagai
Aedes aegypti) dan Aedes albopictus
Dikenal 4 serotipe virus : Dengue virus 1
Dengue virus 2
Dengue virus 3
Dengue virus 4

Pendahuluan (lanjutan)

virus Dengue, termasuk genus

Flavivirus, famili Flaviviridae.
berbentuk sferis berukuran 40-50 nm,
mempunyai 2 tipe protein :
1) protein struktural (3 macam) :
protein C (core),
protein M (membran),
protein E (envelope)
2) protein non struktural (7 jenis) : NS1,
NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.

Pendahuluan (lanjutan)

Orang yg terinfeksi sering mengalami

demam sub fibril dan sembuh sendiri
Bila terinfeksi kedua kali dengan virus
serotipe lain, keluhan menjadi lebih
berat dan dapat mengalami
dengue hemorrhagic fever (DHF),
dengue shock syndrome (DSS)

Demam Dengue
Di Indonesia, demam dengue
merupakan salah satu masalah
kesehatan masyarakat, karena
selalu menimbulkan wabah yang
muncul pada bulan-bulan tertentu
setiap tahun.

Patogenesis dan Patofisiologi

Setelah gigitan nyamuk, virus
Dengue, berkembang biak di kelenjar
limfe regional, menyebar melalui
sistem limfatik dan sirkulasi darah ke
jaringan lain.
Masa inkubasi demam dengue
berkisar antara 3 14 hari, umumnya
4 7 hari.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)

demam tinggi disertai kejang dan

perdarahan saluran cerna akibat
infeksi sekunder (infeksi ke dua
kalinya) oleh serotipe lain.
demam ringan umumnya terjadi
pada infeksi primer.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)

Hal ini disebabkan antibodi antidengue dari infeksi sebelumnya

berikatan dengan virus Dengue
serotipe lain yang menginfeksi saat ini
membentuk kompleks Ag-Ab yang
akan merangsang penglepasan sitokin
dan mengaktivasi komplemen
(penglepasan anafilatoksin C3a dan
C5a) yang merangsang pengeluaran
histamin.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)

Akibatnya terjadi gangguan fungsi

endotel (antara lain peningkatan
permiabilitas endotel kapiler ).
Terjadi kebocoran / perembesan
plasma ke ruang ekstravaskuler,
sehingga terjadi renjatan (shock)
hipovolemik.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)

Perubahan vaskuler, kerusakan

trombosit, trombositopenia dan
gangguan faktor-faktor pembekuan
menimbulkan gangguan hemostasis
dan terjadi perdarahan.
Berat ringannya gejala tergantung
pada serotipe dan galur virus
Dengue, usia dan sifat genetik
penderita serta derajat viremia.

Diagnostic test
Immunochromatographic assay
Isolation of virus
Antigen detection in fixed tissues
RT-PCR (Reverse TranscriptionPCR)
Hemagglutination-inhibition test

Dengue IgG / IgM Rapid test

Solid phase
immunochromatographic assay.
Sifat Test : rapid, kualitatif deteksi
antibodi IgG dan IgM virus Dengue
di serum atau plasma.
Presumptive diagnosis antara
infeksi primer dan infeksi sekunder.

Prinsip Test
Didesain secara simultan mendeteksi
antibodi IgG dan IgM virus dengue
Mendeteksi semua serotipe dengue
menggunakan campuran protein
envelope recombinant dengue.
Test dilengkapi dengan 3 garis (precoated lines: G (IgG), M (IgM), C
(kontrol).
Garis C harus selalu muncul pd tiap
test

Prinsip Test
Bila sampel diteteskan di sumur sampel,
anti dengue IgG / IgM di serum bereaksi
dgn recombinant Dengue virus
envelope protein-colloidal gold
conjugates membentuk komplek AgAb.
Dengan daya kapilaritas, komplek Ag-Ab
bermigrasi dan sampai ke anti-human
IgG dan/atau IgM yg ada di garis test
dan menimbulkan pembentukan warna

Bahan Test
Dengue IgG/IgM test strip :
Gold conjugates : recombinant
Dengue virus envelope protein-gold
colloid.
Garis G : mouse monoclonal antihuman IgG
Garis M : mouse monoclonal antihuman IgM
Garis kontrol : rabbit anti-Dengue IgG

Bahan Test (lanjutan)

Assay diluent : 100mM phosphate

buffer, Sodium azide
5 uL capillary pipette atau
mikropipet

Pengambilan dan Penyimpanan

Sampel
Serum : ambil darah vena, masukkan
di tabung reaksi tanpa antikoagulan,
biarkan 30 , sentrifuge, pisahkan
serum dari bekuan darah
Plasma : ambil darah vena, masukkan
di tabung reaksi mengandung
antikoagulan (heparin/Na-EDTA/Nasitrat), pisahkan plasma dari sel-sel
darah.

Pengambilan & penyimpanan

sampel
Bila tidak segera diperiksa, simpan
sampel di suhu 2-8 C.
Bila disimpan > 2 minggu,
dianjurkan di bekukan.
Suhu test : suhu kamar.
Sampel mengandung presipitat
harus di jernihkan dulu sebelum test.

Pengambilan & Pengumpulan Sampel (lanjutan)

Sampel
hemolisis,
lipemik,
ikterik,
mengandung faktor rheumatoid
dapat mengganggu test.

Prosedure Test
Siapkan Kit test dan sampel pada
suhu kamar.
Isap sampel (serum/plasma)
menggunakan pipet kapiler sampai
black line (5 uL) atau
menggunakan mikropipet.
Teteskan serum/plasma 5 uL di
sumur bertanda S.

Prosedur Test (lanjutan)

Tambahkan 3-4 tetes assay diluent

ke sumur assay diluent yang
berbentuk bulat
Baca hasil test dalam waktu 15
20. (jangan dibaca sesudah 20 )

Interpretasi Test
Negatif. Hanya tampak garis pink C
Positip.
IgM (+) (infeksi dengue primer) :
tampak 2 garis pink C dan M.
IgG (+)(infeksi dengue sekunder atau
pernah terinfeksi di masa lalu) :
tampak 2 garis pink C dan G.
IgM dan IgG (+) : tampak 3 garis pink
C, M, G.
Invalid : garis C tidak ada

Keterbatasan Test
Test jangan digunakan sebagai satusatunya test untuk mendiagnosis
infeksi dengue (should not be used as
the sole criterion for diagnosis)
Pada infeksi dini, kadar antibodi
mungkin rendah, dan pada beberapa
penderita kadar antibodi terdeteksi
baru pada hari 7 10. Bila gejala klinik
ada lakukan re-test dalam 3 4 hari

Keterbatasan Test (lanjutan)

Reaksi silang mungkin dapat terjadi

dengan grup Flivivirus (virus
dengue, St.Louise encephalitis,
Japanese encephalitis, West Nile
dan yellow fever).
Bila hasil test (-), tetapi gejala
klinik ada, disarankan test lagi
dengan metoda lain.

Expected value
Dengue primer ditandai
ditemukannya IgM 3 5 hari
pasca infeksi.
Dengue sekunder ditandai dengan
peningkatan IgG 1 2 hari setelah
infeksi dan pada sebagian kasus
diikuti dengan peningkatan IgM.

Sensitivitas dan spesifitas test

Sensitivitas : % jumlah kasus (+)
benar dari jumlah semua kasus (+).
Jumlah kasus (+) :102
Jumlah kasus (+) dgn test ini : 93
Sensitivitas test : 93/102 x 100%=
91.2%

Spesifitas test
Spesifitas : % jumlah kasus (-) benar
dari jumlah seluruh kasus (-).
Jumlah kasus (-) : 200
Jumlah kasus (-) dgn test ini : 180
Jumlah kasus (+) palsu 20
Spesifitas test : 180/200 x 100% =
90%