Nama : Maslakahtun Nisakdiyah

NRP

: 1513100035
Resume Journal

A NAP-AAO3 Regulatory Module Promotes Chlorophyll Degradation via ABA Biosynthesis

in Arabidopsis Leaves
PENDAHULUAN
Penuaan adalah tahap akhir perkembangan daun dan menyebabkan kematian seluruh
organ yang diatur secara fisiologis, biokimia, dan tingkat molekuler, Penuaan daun
tergantung usia meskipun bisa dipicu oleh abiotik dan biotik tekanan eksternal, seperti
kekurangan air atau nutrisi, tinggi atau intensitas cahaya rendah, dan infeksi patogen.
Penuaan di penagruhi oleh berbagai macam hormon diantara nya auksin, asam absisat,
giberelin dan sitokinin. Gen dan amasino menekan penuaan. Sedangkan etilen mempercepat
penuaan dan inhibitor biosintesis etilen. Jika dibandingkan dengan daun yang nonenesens
daun Arabidopsis Thaliana memiliki konsentrasi yang tinggi akibat dari asam jasmonis dan
asam salisilat. Jadi JA, SA dan ABA serta etilen bersama sama meransang penuaan pada
daun. ABA adalah sesquiterpenioid yang berasal dari karotenoid, enzim yang mengendalikan
produksi ABA adalah oksigease 9 cis epoxycaretenoid

(NCEDs) yang berperan dalam

pembelahan xantofil dan absisisik aldehida oksidase (AAO3). ABA DEFICIENT3 (ABA3)
adalah sulfurase yang terlibat dalam biosintesis dari molibdenum kofaktor yang diperlukan
untuk kegiatan AAO3. ABA memainkan peran sentral dalam respon tanaman terhadap
kondisi sters.
ABA juga mengatur berbagai proses perkembangan, termasuk pematangan benih dan
dormansi, pengguguran organ,dan daun penuaan. Selama penuaan daun terjadi degreening
atau menguning karena degradasi klorofil yang menandakan adanya degradasi makromolekul
dan remobilisasi nutrisi. Sebagian tanaman terdapat sejumlah Stay green atau SGR. SGR
yaitu gen yang mengkode kloroplas yang kekal atau terus menerus pada tanaman seperti
rumput fescue, kacang, Arabidopsis,tomat dan paprika. Klorofil adalah pedang bermata dua
bagi sel tanaman. Sangat penting untuk fotosintesis dan pertumbuhan tetapi dapat menjadi
phytotoxic ketika banyak oleh energi cahaya, sehingga memproduksi oksigen reaktif pada
spesies dan kematian sel.
Oleh karena itu, biosintesis dan degradasi klorofil diatur secara ketat selama
pengembangan tanaman. Pada Arabidopsis telah teridentifikasi bahwa pengkodean transkripsi
diduga faktor WRKY53, NAP,ORE1, ORS1, EIN3, reseptor sitikin, dan reseptor kinase serta

proterin bertarget S40-3. NAP adalah faktor transkripsi dari dalam tanaman itu sendiri. Jika
jumlah nya kurang maka akan

menyebabkan gen nap mutan

pada Arabidopsis. Pada

penelitian ini menunjukkan bahwa NAP meransang degradasi klorofil pada Arabidopsis
melalui induksi gen biosintesis ABA, AAO3, yang menyebabkan peningkatan kadar penuaan
dan meransang hormon ABA.
HASIL
Hasil yang didapat pada pada daun tanaman yang mutan Nap mempunyai
konsentrasim klorofil yang rendah, sedangkan konsentrasi klorofil sama pada daun nap mutan
dan wild type. Setelah 6 hari pada kegelapan tingkat klorofil dalam daun tidur siang naik 4
kali dibanding dengan wildtype. Pengukuran degradasi klorofil diukur dengan RT-PCR
kuantitatif. Gen-gen yang terlibat dalam pemecahan klorofil adalah SGR1, NYC1, PPH,PaO,
CLH1 dan CLH2. Kegelapan berkepanjangan menyebabkan peningkatan yang signifikan
pada transkripsi SGR1, NYC, dan PaO pada wild type tapi meningkat kecil pada mutan.
Setelah hari ke 3 pada tempat gelap tingkat transkripsi SGR1, NYC1, PPH dan PaO pada nap
hasil ini menunjukan bahwa gen Nap berperan baik secara langsung dan tidak langsung,
selain itu

regulator postif dari gen

mendegradasi klorofil menstimulasi penuaaan.

Menariknya tingkat translkripsi CLH 1 dan CLH 2 yang seharusnya untuk menghapus fitol
selama degradasi klorofil mmenurun secara signifikan di kedua mutan daun nap dan daun
tanaman liar dalam merespon keadaan gelap.
Hal ini analog dengan penelitian sebelumnya yang menejelaskan bahwa kedua gen
diatas tidak berperan pada penuaan daun. Dengan menggunakan uji PCR menunjukan bajwa
tingkat transkripsi NAP pada Arabidopsis yang mempunyai roset daun 4 dan 5 meningkat
sebanyak 4 sampai 7 kali lipat pada hari ke 10, 30, atau 40. kondisi pertumbuhan yang
digunakan dalam percobaan ini, tanaman mulai menunjukan perubahan pada hari ke 20, dan
daun 4 dan 5 mulai menguning sekitar hari 30. Beberapa hormon penuaan diuji untuk
mengatahui ekspresi NAP di daun yang terpapar cahaya, termasuk ABA, etilena (melalui
prekursor 1-aminocyclopropane-1- meningkat 4- dan 7 kali lipat antara hari 10 dan 30 atau
40. Tingkat transkripsi NAP meningkat pada kontrol air selama 4 jam pada potongan daun.
Daun di diberi perlakuan ABA, tetapi tidak MeJa atau SA, hasilnya level transkripsi NAP
meningkat secara signifikans yang diberi perlakuan kontrol berupa air pada jam ke 4, 8 dan
24 . perlakuan ACC meningkatkan transkripsi NAP pada daun yang diberi perlakuan kontrol
air pada jam 24.

Peran NAP dalam mendegradasi klorofil dianalisis menggunakan ATTED-II dengan

memilih 300 gene dengan level transkripsi yang sangat kuat berkorelasi dengan NAP. Dari
hasil analisis ada 4 grup fungsional yang utama dari gen yang berasosiasi dengan ekspresi
NAP, faktor transkripsi dan protein pendegradasi, ABA, serta protein modifikasi. ABA dapat
menginduksi degradasi klorofil dan menghilangkan fungsi dari NAP sehingga memperlambat
degradasi protein. Daun mutan nap mempunyai level ABA yang rendah pada kondisi gelap.
Pada daun tanaman liar konsentrasi ABA naik dari 0.185 sampai 3.58 nmol/g pada berat
basah selama 6 hari pada keadaan gelap meskipun konsentrasi ABA pada daun mutan nap
sama dengan tanaman liar pada keadaan gelap. Hasil ini menunjukkan bahwa produksi ABA
lebih rendah pada tumbuhan nap mutan daripada di tipe liar selama perawatan gelap atau
bahwa degradasi ABA lebih tinggi pada mutan. Tumbuhan dengan mutan nap
mentranskripsikan biosintesis ABA rendah selama perpanjangan kondisi gelap. Level
transkripsi dari 8 gen pada biosintesis ABA1/ ZEP, NCED2, NCED3, NCE5, NCED9,
ABA2, ABA3 dan AAO3.
Meskipun NCED2, ABA3, dan tingkat transkrip AAO3 lebih rendah pada tanaman
mutan nap dibandingkan tipe liar daun selama pengobatan gelap , Hanya AAO3 yang
merupakan salah satu gen terkait enam ABA (metabolisme sinyal yang coexpressed dengan
NAP). Secara signifikan, gen fosfatase protein 2C (At5g59220, SAG113) yang dilaporkan
sebelumnya menjadi target langsung NAP, dan tingkat transkrip AAO3 yang memperlihatkan
korelasi tinggi dengan NAP daripada dengan SAG113. Untuk membuat sambungan langsung
antara sifat

NAP dan AAO3, pertama dilakukan luciferase (LUC) tes transactivation

berbasis. Coexpression RAN dengan promotor-LUC gen reporter AAO3 di protoplas mesofil
Arabidopsis peningkatan aktivitas luciferase oleh 240%, menunjukkan bahwa NAP mengikat
promotor AAO3 untuk mengaktifkan transkripsi. Untuk memverifikasi ini, dilakukan
elektroforesis tes pergeseran mobilitas (EMSAs) menggunakan protein NAP

yang

dimurnikan dan segmen promotor AAO3 sintetis. NAP dinyatakan sebagai protein fusi
dengan thioredoxin dan Nap ditambahkan ke N terminus (Trx-NAP).
Berikutnya, dilakukan uji konfirmasi bahwa protein fusi Trx-NAP mengikat segmen
32-bp dari SAG113 (P113-S, AGTGTTAGACTTTGATTGGTGCACGTAAGTGT. Urutan
inti 9-bp dari P113- untuk mengikat nap. Menggunakan urutan varian di urutan inti P113-S,
kami menemukan bahwa triplet ACG diperlukan untuk mengikat Trx-NAP . Ada enam ACGs
dan delapan CGTs di untai positif dari-bp 1228 urutan promotor AAO3 yang digunakan
dalam tes transactivation. Empat fragmen antara 300 dan 350 bp yang berisi ACG atau CGT
diamplifikasi dari promotor AAO3 untuk digunakan dalam EMSA tes, yaitu, P1,1231 to2924;

P2,2899 ke 2548; P3,2529 ke 2 189; dan P4,2323 to28, relativ terjemahan kodon start, ATG.
Sebuah fragmen 330-bp dari SAG113promoter, P113-L: 2 427 to2 98, yang berisi P113-S,
digunakan sebagai kontrol positif. EMSA menunjukkan bahwa fragmen P4 sangat terikat
pada Trx-NAP, seperti yang dilakukan P113-L fragmen (Gambar 5B). P2 dan P3 fragmen
juga menunjukkan beberapa mengikat. Pengikatan Trx-NAP ke P4 fragmen berlabel
dihambat oleh lebih dari 200 fragmen berlabel. Hasil yang sama diperoleh pada P113-L
Untuk menentukan sekuens dalam fragmen P4 dari mengikat promotor AAO3 ke protein
NAP, disintesis empat segmen yang masing-masing berisi satu atau dua urutan CGT: S1, 2
267-2 236; S2, 2 196-2 165; S3,2 93-2 62; S4,278 to247, relatif terhadap awal ATG. Trx-NAP
terikat S2 tetapi tidak ada segmen lain. Kompleks spesifik dari Trx-NAP yang mengikat S2
dikonfirmasi oleh EMSA persaingan dengan berlabel S2 DNA. Sekali lagi, hasil yang sama
diperoleh dengan fragmen kontrol positif, P113-S. Secara kolektif, hasil EMSA menunjukkan
bahwa NAP dapat mengikat secara khusus untuk segmen S2 (2196 to2165) dari promotor
AAO3.
ABA Menekan fenotip stay green dari daun mutan nap untuk lingkungan gelap
berkepanjangan. Berikutnya, untuk meneliti efek dari eksogen-diterapkan ABA pada
degradasi klorofil pada daun mutan nap selama kegelapan diperpanjang Dipotong daun
naptreated dengan larutan ABA (baik 4 atau 10mm) menunjukkan tumbuhan liar menguning
setelah hari ke 6 pada kondisi gelap, berbeda dengan kontrol air pada mutan nap.
Konsentrasi klorofil dalam daun mutan nap ABA-diperlakukan adalah 194 mg / g FW, mirip
dengan tipe liar air diperlakukan dan berbeda dengan 755m g / g FW daun tidur siang air
diperlakukan. Selanjutnya, perawatan ABA meningkatkan kadar transkrip SGR1 NYC1,
PPH, dan PaO di tidur siang gelap diperlakukan daun ke tingkat yang sama dengan atau di
atas daun tumbuhan liar, sementara tingkat transkrip gen ini secara substansial lebih rendah
pada siang air diperlakukan Daun selama perlakuan gelap. Singkatnya, penerapan ABA untuk
terpisah daun mutan nap meningkat .
Untuk menguji keterlibatan AAO3 pada penuaan daun dengan cara menyidipkan
mutan T-DNA dari AAO3 dengan T DNA dlaam intron kedua gen. Setelah perlakuan selam
6 hari daun AAO3 menunjukan warna yang tetap hijau fenotipe mirip dnegan mutan nap.
Selain itu konsentrasi klorofil di daun AAO3 setelah perlakuan di tempat gelap sama seperti
pada mutan nap dan secara signifikan lebih tinggi dari pada di daun tumbuhan liar.
Overekspresi AAO3 di Daun mutan nap menekan fenotip hijau. Untuk menguji apakah
mengurangi ekspresi AAO3 di mutan nap dapat menjelaskan fenoti daun hijau mutan daun
ditempat gelap berkepanjangan. Tiga AAO3 mutan nap mempunyai

garis transgenik

independen dipilih berdasarkan tingkat tipe liar seperti mereka AAO3 transkrip setelah 6 hari
perlakuan gelap. Konsentrasi klorofil di AAO3 pada mutan nap adalah; 240M g / g FW, mirip
dengan jenis liar, sementara itu 708 mg / g FW di mutan nap. Pengukuran tingkat transkrip
oleh QRT-PCR menunjukkan bahwa AAO3 berlebih dalam mutan nap mengakibatkan tingkat
tipe liar seperti gen degradasi klorofil, SGR1, NYC1, PPH, dan PaO . Overekspresi AAO3 di
mutan nap mengakibatkan peningkatan yang signifikan dalam konsentrasi ABA dalam daun
terpisah dari semua tiga baris transgenik independen setelah 3 dan 6 hari pada kondisi gelap.
Tingkat ABA di garis AAO3 pada mutan nap sama dengan tipe liar di hari 3 pada kondisi
gelap dan menengah antara jenis liar dan mutan nap di hari ke 6. Selain itu, ketika tanaman
pada daerah gelap yang berkepanjangan, tanpa stres air, daun dari tipe liar dan tanaman
AAO3

mutan nap dan berubah abu-abu-hijau.

Dari hasil yang didapat pada penelitian ini NAP terbukti berperan dlam mengatur
ekspresi gen AAO3 yang mengatur biosintesis ABA yang daopat meningkatkan kadar ABA
dan mengiduksi gen yang telibat dalam degradasi klorofil. Biosintesis ABA pada mutan nap
selama keadaan gelap mempunyai banyak hormon yang terbukti mempengaruhi penuaan.
Secara umum ABA, etilena, JA, dan SA menstimulasi, sedangkan sitokinin, auksin dan
giberelin menekan penuaan. Transkripsi NAP di arabidopsis lebih snesitif terhadap perlakuan
ABA dari pada hormon lainya. Selain itu produksi BA pada tanaman mutan naplebih rendah
dari pada tanaman tipe liar selama keadaan lingkungan gelap yang panjang