Anda di halaman 1dari 34

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas akhir mata kuliah Bioteknologi Dosen Pengampu Dr.dr. Heru Nurcahyo

Polymerase Chain Reaction (PCR) Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas akhir mata kuliah Bioteknologi Dosen Pengampu

Disusun Oleh:

Ahmad Zaqi Zamani (117082008)

F. Yudha Christianti (11708251039)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN SAINS PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

2012

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

1

Kata Pengantar

Puji syukur bagi Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan karuniaNya sehingga penulis berhasil menyelesaikan makalah yang berjudul Polymerase Chain Reaction (PCR). Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Bioteknologi Program Pascasarjana Universitas Negeri Yogyakarta. Adapun tujuan dari penulisan makalah ini yaitu untuk membantu menigkatkan pemahaman konsep tentang Polymerase Chain Reaction (PCR) bagi penulis sendiri maupun bagi mahasiswa yang lainnya. Materi-materi yang ada di dalam makalah ini bersumber dari berbagai macam revensi dengan harapan untuk kualitas penulisan makalah. Adapun pokok bahasan yang ada di dalam makalah ini yaitu pengertian PCR, komponen-komponen PCR, tahapan dan teknik pengembangan PCR; faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR dan kelebihan dan kelemahan PCR. Penulis berharap makalah ini akan membantu pemahaman konsep dan dapat dijadikan sebagai sumber revensi pembelajaran. Penulis menyadari bahwa di dalam penulisan makalah masih banyak ditemukan kekurangan. Oleh sebab itu penulis mengharapkan adanya kritik dan saran dari berbagai pihak untuk membantu kemajuan penulisan makalah ini. Akhir kata, penulis mengucapkan selamat membaca dan memahami makalah ini. Semoga bermanfaat.

Yogyakarta, 29 Februari 2012

Penulis

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

2

Daftar Isi

Ahmad Zaqi Zamani (117082008).......................................................1

   

2

Kata Pengantar Daftar Isi

 

3

BAB I

 

4

PENDAHULUAN

 

4

 

A.

Latar Belakang

4

B.

Rumusan Masalah

 

5

 

C.

Tujuan

6

BAB II

 

6

PEMBAHASAN

 

6

 

A.

Pengertian PCR

6

B.

Komponen – Komponen PCR

 

7

C.

Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCR

 

14

D.

Tahapan dan Pengembangan Teknik PCR

 

16

E.

Faktor-faktor yang terlibat dalam PCR

 

24

F.

Aplikasi PCR dalam Kehidupan Sehari-hari

 

29

G.

Kelebihan dan Kelemahan PCR

 

31

BAB III

 

32

 

PENUTUP

32

DAFTAR PUSTAKA

 

33

 
   

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

 

3

A. Latar Belakang

BAB I PENDAHULUAN

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang semakin pesat. Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah bioteknologi. Bioteknologi sangat bermanfaat untuk kehidupan manusia. Secara umum bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan bioteknologi modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Contoh produk dari bioteknologi tradisional tersebut antara lain: tempe, oncom, yoghurt, dan keju. Seiring dengan kemajuan teknologi dan perkembangan kebutuhan hidup manusia, bioteknologi

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

4

yang tradisional terus mengalami perkembangan hingga ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya. Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang DNA, muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi modern, misalnya insulin, kloning domba Dolly, antibodi monoklonal. Dalam aplikasinya, bioteknologi dapat menerapkan berbagai macam disiplin ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi sel (tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia (tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Polymerase Chain Reaction atau yang lebih dikenal dengan istilah PCR. PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah fragmen DNA spesifik dengan panjang dan jumlah skuens yang telah ditentukan dari jumlah kecil template kompleks. PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika populasi, dan analisis forensik. Mengingat pentingnya peranan teknik PCR ini terhadap perkembangan ilmu pengetahuan kedepan, maka dalam makalah ini akan dibahas tentang pengertian PCR, komponen-komponen PCR, tahapan dan teknik pengembangan PCR; faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR dan kelebihan dan kelemahan PCR.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, maka rumusan masalah dalam makalah ini

yaitu:

  • 1. Apa pengertian dari PCR?

  • 2. Apakah yang termasuk ke dalam komponen-komponen PCR?

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

5

3.

Apa peralatan khusus yang digunakan dalam PCR?

4.

Bagaimana tahapan dan pengembangan teknik PCR?

5.

Apakah yang menjadi faktor-faktor penentu keberhasilan proses PCR?

6.

Apa manfaat dan aplikasi dari PCR?

7.

Apa yang menjadi kelebihan dan kelemahan PCR?

  • C. Tujuan

Berdasarkan rumusan masalah diatas, maka tujuan dari penulisan makalah ini

yaitu:

1.

Untuk mengetahui pengertian dasar PCR.

2.

Untuk mengetahui komponen-komponen yang terlibat dalam PCR.

3.

Untuk mengetahui peralatan khusus yang digunakan dalam PCR.

4.

Untuk mendeskripsikan tahapan dan pegembangan teknik.

5.

Untuk mengetahui faktor-faktor penentu keberhasilan proses PCR.

6.

Untuk mengetahui manfaat dan aplikasi dari PCR.

7.

Untuk mengetahui kelebihan dan kelemahan PCR.

  • A. Pengertian PCR

BAB II PEMBAHASAN

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

6

Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 10 6 -10 7 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2 n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non- target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.

B. Komponen – Komponen PCR

Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara

lain:

  • 1. DNA cetakan DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

7

berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas

berantai ganda ( double stranded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal ( single stranded ). Denatirasi
berantai ganda ( double stranded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal ( single stranded ). Denatirasi

selama 1 – 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah ( ).

berantai ganda ( double stranded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal ( single stranded ). Denatirasi
berantai ganda ( double stranded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal ( single stranded ). Denatirasi
  • 2. Oligonukleotida primer Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya. Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 – 30 klai (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam

berantai ganda ( double stranded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal ( single stranded ). Denatirasi
berantai ganda ( double stranded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal ( single stranded ). Denatirasi

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

8

jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang

digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplikasi.

  • 3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)

Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan

bahwa campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.

  • 4. DNA Polimerasi

Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’ → 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer- DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.

  • a. Taq DNA Polimerase Taq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

9

dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini paling aktif pada

pH9 (pada suhu 20 0 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 75 0 C –

  • 80 0 C.

Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen Klenow. Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 75 – 80 ͦC. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim. Waktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95 ͦC adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non- ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat. Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen ß-globin (14990 nukleotida). Dengan

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

10

demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus. Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3’ fragmen DNA hasil polimerasi meskipun tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul dengan menggunakan aktivitas polymerase 5’ → 3’ fragmen Klenow. Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq DNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi dNTP yang digunakan adalah 0,7 – 0,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.

demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per
demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per
demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per
  • b. Tth DNA polimerse Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25 ) dan suhu sekitar . Selain aktivitas

demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per
demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

11

polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin. Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse

polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik ( reverse transcriptase ) intrinsik yang sangat efisien

dengan adanya ion . Enzim ini dapat dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.

  • c. Pwo DNA polymerase

Enzim

Pwo

DNA

polymerase

diisolasi

dari

archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini

polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik ( reverse transcriptase ) intrinsik yang sangat efisien

mempunyai prosesivitas polimerasi 5’ 3’ yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease

polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik ( reverse transcriptase ) intrinsik yang sangat efisien
polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik ( reverse transcriptase ) intrinsik yang sangat efisien

. Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim

ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu paruh
ini lebih dari 2 jam pada suhu
, sedangkan Taq DNA polymerase
hanya mempunyai
waktu
paruh
5
menit
pada suhu ini. Aktivitas
polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik ( reverse transcriptase ) intrinsik yang sangat efisien

eksonuklease 3’ 5’ (aktivitas proof-reading dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

12

ketepatan (fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk amplifikasinya yang

mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit. Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:

1)

Cloning produk PCR

2)

Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual

3)

Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan

4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal 5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur

  • d. Pfu dan Tli DNA polymerase DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD,

ketepatan ( fidelity ) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki

aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease

.
.

Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil

disbanding dengan

enzim

DNA

polymerase

yang

lain.

Produk

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

13

amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul. Tli DNA polymerase diisolasi dari
amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA
dengan ujung tumpul.
Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis,
sangat stabil terhadap panas, aktivitas optimum pada suhu dan
dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu . Berat molekul

enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease

.
.

PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl 2 . Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl 2 . Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg 2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg 2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg 2+ yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.

C. Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCR

PCR memerlukan alat khusus dalam prosesnya, alat-alat tersebut antara lain:

  • 1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

14

Gambar 1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Sumber: <a href=http://www.hoeferinc.com/ ) 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu. Gambar 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler http://www.sci-support.com ) (sumber: PCR 2012 By: Yudha and Zaqi 15 " id="pdf-obj-14-2" src="pdf-obj-14-2.jpg">

Gambar 1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Sumber: http://www.hoeferinc.com/)

  • 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu.

Gambar 1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Sumber: <a href=http://www.hoeferinc.com/ ) 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu. Gambar 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler http://www.sci-support.com ) (sumber: PCR 2012 By: Yudha and Zaqi 15 " id="pdf-obj-14-12" src="pdf-obj-14-12.jpg">

Gambar 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler http://www.sci-support.com )

(sumber:

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

15

3.

Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat ini memiliki sebuah thermal block dengan lubang-lubang untuk memasukkan tabung campuran PCR.

3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat ini memiliki sebuah thermal

Gambar 3. Thermocycler microfuge tubes

D. Tahapan dan Pengembangan Teknik PCR 1. Tahapan Proses PCR

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

16

Gambar 4. Tahapan PCR (Campbell, 2002) Berdasarkan gambar diatas, Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga

Gambar 4. Tahapan PCR (Campbell, 2002) Berdasarkan gambar diatas, Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses, yaitu:

A. Denaturasi Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 o C. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase. 2. Annealing Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

17

kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74 0 C bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 o C, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 o C juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak. 3. Extension Extension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA. Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. Jumlah relatif molekul yang dihasilkan pada setiap siklus dapat dilihat pada tabel berikut (Fatchiyah, 2012):

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

18

Siklus PCR
Siklus PCR

Jumlah Relatif Molekul

Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6
Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6
  • 1 2

Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6
Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6
  • 2 4

Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6
Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6
  • 3 8

 
  • 4 16

 
  • 5 32

 
  • 6 64

10

1.024

20

1. 048.576

30

1.073.741.824

2.Pengembangan Teknik PCR

Sejak pertama kali diperkenalkan, teknik PCR telah berkembang sangat pesat dan diaplikasikan untuk bermacam-macam tujuan, baik untuk riset dasar maupun aplikasi praktis. Pada aspek metodologinya, teknik PCR yang pertama kali diperkenalkan memerlukan banyak kondisi khusus untuk menjamin keberhasilanya. Sebagai contoh, pada awalnya teknik PCR hanya untuk mengamplifikasi molekul DNA dengan menggunakan DNA sebagai bahan awal (starting material) yang akan dijadikan sebagai cetakan. Dalam hal ini molekul DNA yang akan diamplifikasi harus diisolasi terlebih dahulu dari sel atau

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

19

jaringan. Perkembangan lebih lanjut teknik ini memungkinkan para peneliti menggunakan molekul RNA sebagai bahan awal, yaitu dengan perkembangan teknik Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR). Selain itu, sekarang juga telah dikembangkan teknik PCR yang tidak memerlukan langkah isolasi molekul DNA terlebih dahulu sebelum diamplifikasi. Dalam hal ini PCR dapat dilakukan dengan menggunakan sel atau jaringan sebagai bahan awal tanpa harus melakukan isolasi DNA secara khusus. Dengan teknik ini, PCR dapat dapat dilakukan di dalam sel atau jaringan tersebut sehingga teknik ini dikenal sebagai PCR In situ.

  • 1. Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum teknik ini dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakukan dengan metode hibridisasi in situ,northern blot, dot blot atau slot blot, analisis menggunakan S1 nuklease, atau dengan menggunakan metode pengujian proteksi RNase. Metode hibridisasi in situ bersifat sangat sensitive sehingga dapat digunakan untuk analisis molekul mRNA yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit, tetapi teknik ini cukup sulit dilakukan. Metode-metode yang lain, meskipun lebih mudah dilakukan, tidak cukup sensitive. Oleh karena itu, kemudian dikembanglkan teknik RT-PCR untuk mengatasi kelemahan-kelemahan metode yang lain tersebut. Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA sebagai cetakan maka terlebih dahulu dilakukan transkripsi balik (reverse transcription) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA tersebutkemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan cloning dan anaisis, maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

20

penyakit genetic. Dalam teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik. Enzim transcriptase balik adalah enzim DNA polymerase yang menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk menyintesis molekul DNA (cDNA)yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa

enzim transcriptase balik yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV) maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV) dan Tth DNA polymerase. RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif dan mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 1-2 kb. Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa primer yaitu:

  • a) Oligo(dt) sepanjang 12-18 nukleotida yang akan melekat

pada ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA mamalaia. Primer semacam

ini pada umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap

  • b) Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan

mRNA yang komplementer pada bagian manapun. Primer semacam

ini akan menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial).

  • c) Urutan nukeotida spesisik yang dapat digunakan secara

selektif untuk menyalin mRNA tertentu.

  • 2. PCR In Situ Analisis DNA atau mRNA hasil transkripsi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, misalnya hibridasi DNA:RNA atau DNA:DNA, dengan system dot blot atau slot blot . analisis dapat dilakukan terlebih dahulu melakukan isolasi DNA atau mRNA dari sel atau jaringan, atau dengan metode yang lebih maju yaitu dengan analisis langsung sel pada jaringan bersangkutan tanpa harus melakukan isolasi DNA atau mRNA terlebih dahulu. Teknik semacam ini dikenal sebagai In Situ Hybridisation (hibridasi in situ). Teknik ini memerlukan molekul RNA adau DNA target dalam jumlah paling tidak 20 kopi dalam satu sel agar terdeteksi. Oleh

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

21

karena itu, teknik hibridasi in situ paling sering dilakukan untuk analisis mRNA karena jumlahnya per sel pada umumnya lebih banyak dibanding dengan DNA. Untuk jumlah molekul DNA yang julah kopinya sangat sedikit di dalam sel, harus dilakukan amplifikasi terlebih dahulusecara in situ. Teknik yang mengkombinasikan amplifikasi PCR denganhibridasi in situ dikenal sebagai teknik PCR In Situ. Sebelum dilakukan PCR In Situ, sel atau sampel jaringan harus difiksasi dan dipermeabr ilisasi terlebih dahulu. Fiksasi dilakukan untuk mempertahankan DNA atau RNA dan morfologi sel atau jaringan. Biasanya yang digunakan untuk fiksasi adalah formalin atau paraformaldehid. Jaringan yang masih segar atau sel dengan membrane yang masih utuh merupakan sampel yang ideal. Permeabilitas dapat dilakukan dengan menggunakan enzim, misalnya proteinase K, tripsin atau pepsinogen sehingga primer, enzim DNA polymerase dan nukleotida dapat masuk ke dalam inti sel (nucleus). Setelah dilakukan fiksasi dan permeabilisasi, kemudian dilakukan amplifikasi in situ yaitu dengan menambah komponen-komponen yang diperlukan untuk PCR. Setelah dilakukal PCR, selanjutnya sel atau jaringan yang digunakan diambil lagi dan diletakkan pada gelas obyek. Sebagian lisat sel dianalisis dengan elektroforosis gel. Produk PCR hasil amplifikasi

in situ yang ada di dalam sel kemudian dianalisis dengan metode hibridisasi in situ atau dengan imunohistokimia Aplikasi metode PCR in situ secara umum dapat digunakan dalam hal-hal sebagai berikut:

  • a) PCR in situ (dengan target DNA) dapat digunakan untuk

deteksi gen asing dan deteksi perubahan gen. gen asing yang dideteksi dapat berupa hasil infeksi oleh suatu jasad, misalnya bakteri, jamur, maupun virus atau gen asing yang merupakan hasil introduksi melalui proses transgenic, tetapi gen, atau hasil transplantasi. Perubahan gen yang dapat dideteksi dengan metode

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

22

PCR in situ antara lain mutasi gen, translokasi maupun perubahan gen yang lain.

  • b) RT-PCR in situ (dengan target RNA) dapat digunakan untuk

mendeteksi eksprisi gen asing atau gen yang aras (level) ekspresinya

rendah maupun ekspresi gen abnormal. Selain itu dapat juga diterapkan untuk deteksi virus yang bahan genetiknya berupa RNA.

Deteksi Produk Hasil PCR

Setelah selesai melakukan PCR, produk PCR bisa dilihat dengan cara me-loading pada DNA Elektroforesism gel agarosa. Namun sebelum itu, kita harus membuat gel (agarose) yang mengandung Ethidium bromide (EtBr) berdasar cetakan yang tersedia dalam perangkat tersebut. EtBr adalah pewarna fluorescent yang interkalasi ke dalam DNA.Untuk kebutuhan deteksi, biasanya cukup menggunakan 3-5 ul saja dari total produk PCR 50 ul. Jadi, pipet sample sebanyak volume tersebut, campurkan dengan loading buffer, dan running selama kira-kira 15 menit. Setelah itu angkat gel dari tank, dan tempatkan pada UV Transilluminators. Visualisasi hasil PCR akan tampak seperti gambar berikut.

PCR in situ antara lain mutasi gen, translokasi maupun perubahan gen yang lain. b) RT-PCR inhttp://biotektanaman.wordpress.com ) PCR 2012 By: Yudha and Zaqi 23 " id="pdf-obj-22-34" src="pdf-obj-22-34.jpg">

Gambar 4 . Visualisasi hasi PCR (Sumber: http://biotektanaman.wordpress.com)

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

23

Pada gambar tersebut ada no. 1 sampai 4 yang terletak pada sumur (well) gel agarose. Nomor 1 (line 1) bukan merupakan hasil PCR, namun sebuah penanda (marker). Marker DNA tersebut memiliki ukuran yang telah diketahui yang kisarannya antara 100 bp sampai 21 kilo bp. Pada gambar tersebut tampak ukurannya yaitu 100, 200, sampai 500 bp. Line 2 adalah kontrol negatif, yaitu hanya menggunakan loading buffer, sedangkan line 3 dan 4 adalah produk PCR. Dari gambar tersebut kita bisa menyimpulkan bahwa produk PCR tersebut berukuran 450 bp.

E. Faktor-faktor yang terlibat dalam PCR

Keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor yaitu:

(1)Deoksiribosanukleotida triphospat (dNTP); (2) Oligonukleotida primer; (3) DNA template; (4) DNA Polimerase; (5) Komposisi larutan buffer; (6) Jumlah siklus reaksi dan (7) suhu.

  • 1. Deoksiribosanukleotida triphospat (dNTP)

Larutan dNTP yang akan digunakan dalam PCR sebaiknya

dinetralkan menjadi pH 7,0 dan untuk menentukan konsentrasinya sebaiknya digunakan metode spektroskopi. Konsentrasi masing-masing

dNTP yang diperlukan dalam PCR berkisar antara 20-200 µM dan keempat dNTP yang digunakan sebaiknya mempunyai konsentrasi yang sama untuk memperkecil kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerase

(Triwibowo,

2006:18). .

Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan

ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa

mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.

  • 2. Primer

Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

24

yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH)

pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Konsentrasi primer yang optimal dalam PCR berkisar antara 0,1 – 0,5 µM. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0 µM dapat menyebabkan hasil polimerasi nonspesifik terakumulasi. Panjang oligoneukleotida yang digunakan sebagai primer umumnya 18-28 nukleotida dan mempunyai G+C sebesar 50-60%. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Dalam melakukan perancangan primer harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut:

  • a. Panjang primer Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya panjang primer berkisar antara 18 – 30 basa. Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan menyebabkan lebih mahal.

  • b. Komposisi primer. Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain. Kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. Selain itu, urutan nukleotitda pada ujung 3’ sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

25

mismatch dari pada G atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan spesifisitas primer. c. Melting temperature (Tm) Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer akan berpengaruh sekali di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 – 65 o C. d. Interaksi primer-primer Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah dan di samping itu konsentrasi primer yang digunakan menjadi berkurang selama proses karena terjadinya mispriming. Keadaan ini akan berpengaruh pada efisiensi proses PCR.

  • 3. DNA Cetakan (DNA template) Kualitas dan kuantitas DNA template sangat berpengaruh pada PCR. Salah satu parameter dan kualitas DNA dapat dilihat dari kemurnian dan ukuran genom DNA. Kemurnian yang rendah, misalnya karena adanya metabolit sekunder, akan menghambat penempelan primer pada susunan basa

pada rantai DNA . Ukuran DNA tempalte yang kecil dapat mengurangi peluang penempelan primer pada template (Dadan S dan Imron, 2010:561). Selain itu, jumlah DNA dalam reaksi PCR perlu dioptimalkan untuk mendapatkan hasil amplifikasi yang optimal. DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul dan yang digunakan dapat berupa DNA yang sudah dimurnikan dengan sentrifugasi gradien CsCl maupun dengan menggunakan sel yang dicampur dengan komponen PCR yang lain (Triwibowo, 2009:19).

  • 4. Enzim yang digunakan

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

26

Proses PCR menggunakan beberapa macam enzim dan secara umum konsentrasi enzim yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 2,5 unit/reaksi. Pada siklus yang lebih banyak maka sebaiknya digunakan unit yang lebih besar dan tidak melebihi 2,5 unit karena konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan menurukan spesifitasnya, Apabila jumlah enzim berlebihan akan mengakibatkan akumulasi produk non spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk yang diinginkan. Triwibowo (2009:20) menyatakan bahwa untuk siklus yang lebih banyak sebaiknya digunakan unit yang lebih besar juga dan tidak melebihi 2,5 unit karena konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan menurunkan spesifitasnya. 5. Larutan Buffer Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffernya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu “Low-salt buffer” (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 – 5 kilobasa biasanya diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”. Menurut Triwibowo (2009: ) buffer yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 10-50 mM Tris-HCl, pH 8,3 – 8,8 ( pada suhu 20 0 C). Untuk membantu proses penempelan primer, dapat juga ditambahkan KCl sampai konsentrasi 50 mM. Jika konsentrasi KCl lebih dari 50mM, maka akan menghambat aktivits Taq DNA polimerase. Komponen Larutan Buffer lain yang perlu ditambahkan adalah gelatin atau BSA sebanyak 0,1 % dan detergen non-ionik yang berfungsi untuk mempertahankan kestabilan enzim Taq DNA polimerase.

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

27

Selain buffer pada PCR diperlukan juga adanya ion Mg 2+ , ion

tersebut berasal dari berasal MgCl 2 . MgCl 2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl 2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl 2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl 2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl 2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl 2 sesuai yang diperlukan (Darmo & Ari: 2000).

  • 6. Jumlah Siklus Reaksi

Pada umumnya PCR dilakukan dengan mengulangi siklus reaksi pelipatgandaan sebanyak 20 -30 siklus. Banyaknya siklus yang diperlukan tergantung terutama pada konsentrasi awal molekul DNA target yang akan dilipatgandakan. Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan. Pada tabel 1 dapat digunakan sebagai patokan untuk menentukan banyaknya siklus yang diperlukan. Tabel 2. Banyaknya siklus amplifikasi yang diperlukan (Triwibowo, 2009:

 

20)

No

Molekul Target

Siklus

1.

3,0 x 10 5

  • 25 – 30

2.

1,5 x 10 4

  • 30 – 35

3.

1,0 x 10 3

  • 35 – 40

  • 7. Suhu

 

Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 – 95oC, ini

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

28

semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94 o C (Darmo & Ari, 2000). Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60 o C. Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm – 5) o C sampai dengan (Tm + 5) o C. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72 o C karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR.

F. Aplikasi PCR dalam Kehidupan Sehari-hari

PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395). Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis. Sebagai contoh teknik dan

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

29

aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya. Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996) yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia. Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library

construction) melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping, subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang terbukti sangat akurat. Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:

  • 1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

  • 2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah

  • 3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

  • 4. Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.

  • 5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen.

  • 6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal.

  • 7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print”

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

30

G. Kelebihan dan Kelemahan PCR

PCR sebagai salah satu teknik mukhtahir dalam pada bidang bioteknologi

tak memiliki kelebihan namun juga memiliki beberapa kelemahan. Adapun kelebihan dan kelemahan PCR dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 1. Kelebihan dan Kelemahan PCR

 

Kelebihan

Kelemahan

  • 1. Memiliki spesifisitas tinggi

  • 1. Sangat mudah terkontaminasi

  • 2. Sangat cepat, dapat

  • 2. Biaya peralatan dan reagen mahal

memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

  • 3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua

  • 3. Dapat membedakan varian mikroorganisme

penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)

  • 4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup

  • 4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian

5.

Mudah di set up

khusus untuk melakukannya.

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

31

A. Kesimpulan

BAB III

PENUTUP

  • 1. PCR merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro dengan cepat.

  • 2. Komponen-komponen yang terlibat dalam proses PCR yaitu DNA template, primer, oligonukleotida enzim, dNTP dan PCR buffer serta Mg 2+

  • 3. Teknik PCR memiliki tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi.

  • 4. Teknik pengembangan PCR dapat dilakukan melalui reverse trancriptase PCR (rt-PCR) dan PCR in situ.

  • 5. PCR dapat mencapai keberhasilan tinggi jika dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain: yaitu DNA template, primer, oligonukleotida enzim, dNTP, larutan buffer, banyaknya siklus PCR dan suhu.

  • 6. Teknik PCR memiliki beberapa manfaat dalam beberapa bidang seperti bidang medis, forensik, pelacakan asal usul dan DNA sequencing.

  • 7. PCR sebagai teknik yang bermanfaat di bidang bioteknologi memiliki beberapa keuntungan dan kelemahan.

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

32

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. (2011). Hoefer®, Inc: The Most trusted Name in Electrophoresis Since

1967.

Diakses

pada

tanggal

24

Februari

2012

dari

Biotektanaman. (2009). Mendeteksi produk PCR melalui DNA elekterphoresis.

Diakses

pada

tanggal

28

Februari

2012

dari

Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. (2002). Erlangga.

Biologi jilid 1. Jakarta:

Dadan, S dan Imran. (2010). Optimalisasi templat DNA genom udang galah

Macrobrachium

tanggal

rosenbergii

24

dalam

proses

Februari

PCR-RAPD.

2012

Diakses

...

pada

dari

Darmo, H & Ari, R. (2000). Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain

Reakction

(PCR).

Diakses

pada

tanggal

26

Februari

2012

dari

Erma, S. (2007). Polymerase Chain Reaction (PCR): era baru dan diagnosis managemen penyakit infeksi. Diakses pada tanggal 24 Februari 2012 dari

Fatchiyah. (2012). DNA amplification (PCR). Diakses pada tanggal 24 Februari 2012 dari http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/general/bbbb/.

James, K. (2010). Polymerase chain reaction (PCR). Diakses pada tanggal 28 Februari 2012 dari http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

33

John E. Smith. (1985). Prinsip bioteknologi. Jakarta: Gramedia.

NCBI.

(Tanpa

tahun).

PCR.

Diakses

pada

tanggal

23

Februari

2012

dari

Scientific Support, Inc. (2012). Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler PCR.

Diakses

pada

tanggal

24

Februari

2012

dari

ShineGene.

(2011). dNTP mix. Diakses pada tanggal 24 Februari

2012 dari

Triwibowo, . (2010). Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit ANDI.

Wikipedia. (2012). Polymerase chain reaction. Diakses pada tanggal 23 Februari 2012 dari http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction.

PCR 2012 By: Yudha and Zaqi

34