1

I.

Pendahuluan Mikroskop merupakan salah satu alat praktikum yang digunakan dalam percobaan

mikrobiologi. Dengan bantuan mikroskop kita dapat mengamati bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang oleh manusia. Andaikata medium dan ala-talat yang kita pergunakan itu tidak steril, niscaya kita tidak akan mungkin dapat melihat bakteri pada mikroskop tersebut dan tidak akan mungkin pula memperoleh kultur bakteri seperti yang diharapkan. Maka langkah pertama yang harus kita lakukan sebelum memulai percobaan khususnya yang mengenai inokulasi ialah

mengusahakan sterilnya medium serta alat-alat perlengkapannya.

Penyebab terjadinya proses sterilisasi salah satunya adalah telah terjadinya pencemaran oleh kontaminan atau yang disebut kontaminasi ada media atau peralatan yang digunakan. Komponen yang menjadi penyebab kontaminasi sangat beragam, baik yang berupa benda mati atau mahluk hidup. Kotoran dan senyawa kimia merupakan benda mati yang berperan sebagai kontaminan, sedangkan mikroba merupakan kontaminan berupa mahluk hidup. dalam berbagai tahapan kegiatan. Dalam mikrobiologi perairan, kontaminasi umumnya disebabkan oleh kehadiran mikroba yang tidak diharapkan. Ikan, produk perikanan, pekerja dan peralatan yang digunakan dapat Kontaminasi sering terjadi

mengalami kontaminasi oleh mikroba yang tidak diinginkan kehadirannya. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk mengatasi terjadinya kontaminan adalah sterilisasi, baik terhadap bahan, peralatan atau pekerja yang terlibat. yang ditujukan untuk membunuh Sterilisasi adalah upaya

semua mikroba pencemar, baik mikroba menguntungkan

maupun merugikan.

Sterilisasi yang baik dapat mencegah tumbuhnya mikroba lain yang tidak

diharapkan dalam bahan yang telah disterilisasi.

II. TUJUAN PRAKTIKUM Setelah melaksanakan kegiatan praktikum, praktikan diharapkan memahami dan memiliki kemampuan untuk melakukan proses sterilisasi, baik terhadap bahan atau peralatan yang akan digunakan untuk menangani mikroba. III. PRINSIP DASAR
Adapun peralatan atau prinsip bahan utama kimiawi yang untuk mendasari praktikum mikroba sterilisasi adalah penggunaan

membunuh

yang terdapat pada peralatan,

sehingga tidak menjadi pencemar pada saat digunakan atau memisahkan mikroba dari medianya.

Bahan ataupun alat yang dipergunakan di dalam bidang mikrobiologi, harus dalam keadaan steril. Artinya pada bahan atau peralatan tersebut tidak didapatkan mikroba yang

tidak diharapkan kehadirannya, baik yang akan mengganggu/merusak media ataupun mengganggu kehidupan dan proses yang dikerjakan (Suriawiria, 1986) Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam proses sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Bila tanpa kelembaban maka disebut sterilisasi panas kering. Di pihak lain, sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi. Pemilihan metode tersebut didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan (Hadioetomo,1990) Pemanasan merupakan salah satu bentuk sterilisasi fisik. Dampak pemanasan terhadap kematian mikroorganisme sangat tergantung kepada suhu dan lama waktu sterilisasi. Panas menyebabkan enzim-enzim berhenti bekerja dan sel dapat kekurangan air. Menurut Barrow dan Feltham (1993:12-13) endospora bakteri lebih tahan panas daripada sel vegetatif, tetapi semua bentuk endospora tidak memiliki ketahanan yang sama persis terhadap panas. Misalnya endospora B.subtilis dapat dimatikan dengan pemanasan 100C dalam waktu pendek, sedangkan endospora B.stearothermophilus dapat bertahan dalam air mendidih berjam-jam. Proses sterilisasi dengan penggunaan panas terdiri dari pemanasan dengan api langsung, pemanasan kering dan pemanasan basah. Pemanasan dengan api langsung Pemijaran dapat langsung membunuh mikroorganisme (termasuk endospora) yang disterilkan dengan cara membakar mikroorganisme sehingga cara ini adalah cara paling cepat. Namun kekurangannya adalah sangat terbatasnya cakupan alat yang disterilisasi menggunakan pemijaran dan ketidakpraktisan dalam mensterilisasi alat berukuran besar. Alat yang dipakai untuk sterilisasi dengan api yaitu bunsen burner dan lampu spirtus. Pemanasan basah Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah. Cara uap air panas membunuh mikroorganisme adalah bukan dengan mengeringkannya tetapi dengan menonaktifkan enzim-enzimnya sehingga metabolisme berhenti bekerja. Sterilisasi basah atau panas lembab sangat efektif meskipun pada suhu yang tidak begitu tinggi, karena ketika uap ait berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan, maka akan dilepaskan panas sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 1210C. Panas ini yang akan mendenaturasikan atau mengkoagulasikann protein pada mikroorganisme hidup dan dengan demikian mematikannya. Maka sterilisasi basah

dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat ditembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan pada 1100C dan 1200C (Hadioetomo,1990). Pemanasan kering Bila panas digunakan tidak bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas kering. Mikroorganisme akan mengalami kekeringan jika dipaparkan pada suhu tinggi dan akibatnya sel akan lisis dan mati. Kekurangan sterilisasi panas kering yaitu masih bertahannya endospora bakteri. Prosedur sterilisasi dengan menggunakan panas kering dibandingkan dengan panas basah. Hal ini disebabkan karena panas kering lebih rendah daya merusaknya dibandingkan dengan uap panas. Keuntungan dari cara ini ialah tidak adanya uap air yang membasahi bahan/alat yang disterilkan. Selain itu, peralatan yang digunakan untuk sterilisasi uap kering (oven) lebih murah dengan uap basah. Namun demikian, tidak semua bahan/alat dapat disterilkan dengan cara ini. Bahan yang terbuat dari karet atau plastik tidak dapat disterilkan dengan uap kering (Lay et al, 1992). Gelas, botol, pipa, pipet yang sudah bersih tidak dibersihkan di dalam autoklaf, karena barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari gelas dimasukkan di dalam oven kering selama 2-3 jam pada temperatur 16000C 17000C, hal ini tergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan dalam oven. Kapas masih dapat bertahan dalam oven kering selama waktu dan pada temperatur tersebut diatas. Alat-alat yang belum bersih dan belum kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering (Dwidjoseputro,1990).

Bahan kimia dapat digunakan untuk sejumlah mikroorganisme tetapi tidak dapat digunakan untuk mematikan semua mikroorganisme. Cara kimiawi dapat digunakan apabila jumlah mikroorganisme rendah dan bila permukaannya bersih dari protein. (Lay et al, 1992). Proses sterilisasi lain yang juga dilakukan pada suhu kamar ialah penyaringan. Dengan cara ini larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian kecilnya (0,45 atau 0,22 mikrometer) sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan filtratnya di tampung dalam wadah yang steril. Beberapa contoh bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini adalah serum, larutan bikarbonat, enzim, toksin bakteri, medium sintetik tertentu, dan antibiotik (Hadioetomo,1990).

IV. PERALATAN DAN BAHAN

Dalam praktikum sterilisasi peralatan diperlukan perlatan dan bahan utama sebagai berikut : 4.1. Peralatan Adapun peralatan utama yang dibutuhkan dalam proses sterilisasi peralatan dan bahan antara lain adalah : a.Peralatan gelas, seperti tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, Erlenmeyer, gelas beker. b. Peralatan logam, seperti ose dan pinset. c. Oven listrik d. Waterbath e. Kompor gas atau lampu spirtus 4.2. Bahan Bahan utama yang digunakan dalam proses sterilisasi peralatan dan bahan antara lain adalah : a. Media kaldu b. Media agar c. Kertas penyaring d. Kertas coklat. pipet hisap, labu

V. PROSEDUR KERJA Adapun prosedur kerja tahapan sterilisasi adalah sebagai berikut : 5.1. Sterilisasi Menggunakan Oven a. Cuci bersih peralatan gelas dan logam menggunakan air bersih yang mengalir. Pergunakan sabun dan sikat halus untuk menghilangkan noda. Tiriskan peralatan yang sudah dicuci bersih sampai semua air menguap dan peralatan menjadi kering. b. Bungkus peralatan gelas dan logam yang telah ditiriskan menggunakan kertas coklat. pembungkusan harus dilakukan secara benar, sehingga dapat membedakan mana cawan petri yang bagian tutup (atas) atau alas (bawah). Pembungkusan juga harus dilakukan sedemikian rupa sehingga pembungkus tetap mudah dibuka pada saat akan digunakan. c. Sebelum dilakukan pembungkusan menggunakan kertas coklat, cairan yang mungkin masih ada pada bagian mulut pipet hisap harus dikeringkan

menggunakan gumpalan kapas. d. Susun peralatan yang telah dikemas ke dalam oven. Panaskan oven hingga suhunya mencapai 121oC dan lakukan proses sterilisasi selama 20 menit. Selanjutnya matikan oven. e. Setelah dingin, pindah peralatan tersebut ke wadah yang telah disediakan dalam keadaan tetap terbungkus. 5.2. Sterilisasi Menggunakan Waterbath a. Masukan media kaldu dan media agar yang masih agak cair ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml. Tutup mulut labu Erlenmeyer tersebut menggunakan kapas.

Gunakan aluminium foil untuk menutup bagian luar kapas. b. Labu Erlenmeyer berisi media kaldu dan media agar disimpan ke dalam waterbath yang telah diisi air. Nyalakan waterbath hingga air mendidih dan biarkan berlangsung proses sterilisasi selama 25 menit. c. Matikan waterbath dan biarkan media kaldu dan media agar di tempatnya hingga airnya hingga dingin. d. Simpan media kaldu dan media agar di lemari pendingin sampai saatnya tiba untuk digunakan. 5.3. Sterilisasi menggunakan Autoklaf a. Masukan media kaldu dan media agar yang masih agak cair ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml. Tutup mulut labu Erlenmeyer tersebut menggunakan kapas. Gunakan aluminium foil untuk menutup bagian luar kapas. b. Labu Erlenmeyer berisi media kaldu dan media agar disimpan ke dalam autoklaf yang telah diisi air. Nyalakan autoklaf dan biarkan berlangsung proses sterilisasi selama 25 menit. c. Matikan autoklaf dan biarkan media kaldu dan media agar di tempatnya hingga airnya hingga dingin. d. Simpan media kaldu dan media agar di lemari pendingin sampai saatnya tiba untuk digunakan. 5.4. Sterilisasi Menggunakan Lampu Bunsen a. Nyalakan lampu Bunsen

b. c.

Ambil ose yang akan disterilisasi Panaskan ujung ose hingga berpijar dan geser hingga semua bagian logam menjadi berpijar

d. e.

Dinginkan dengan cara mengerak-gerakan ose diudara Ose siap digunakan

5.5. Sterilisasi Menggunakan Alkohol a. Siapkan gelas beker berisi alkohol b. Masukkan peralatan yang akan disterilisasi ke dalam alkohol c. Bila akan digunakan, peralatan diangin-anginkan hingga kering

VI. HASIL DAN PEMBAHASAN

6.1. Hasil Data yang telah diperoleh selama kegiatan praktikum disajikan dalam tabel berikut ini. Hasil Sterilisasi Peralatan Sterilisasi Prinsip Sterilisasi Y Dengan cara mengubah energi elektromagnetik Oven menjadi energi panas. Dapat disimpan lama T Dengan sterilsasi yang menggunakan kering, peralatn Keterangan

sudah

disterilisasi

dapat disimpan lama 3-5 hari. Ini dikarenakan

peralatan yang disterilkan dengan menggunakan oven sudah tertutpi oleh kertas coklat. Kertas coklat ini dapat mencegah masuknya kontaminan dari udara. yang berasal

Pemijaran dengan Lampu Bunsen menggunakan api secara langsung

Peralatan yang disterilisasi dengan lampu bunsen tidak dapat bertahan lama, ini dikarenakan sterilisasi setelah dilakukan,

peralatan seperti jarum ose akan kembali bersentuhan dengan dengan udara yang dapat kontaminan. mengandung

6.2. Pembahasan Pada praktikum ke-2 ini percobaan yang dilakukan ialah sterilisasi peralatan praktikum. Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, jika sterilisasi memegang peranan yang penting dalam praktikum mikrobiologi ini khususnya percobaan mengenai inokulasi. Salah satu penyebab sterilisasi ini harus dilakukan ialah karena adanya pencemaran yang diakibatkan oleh kontaminan, baik itu itu kontaminan mati atau hidup. Kontaminan mati yang dimaksud disini ialah kotoran dan senyawa kimia, sedangkan kontaminan hidup yang dimaksud ialah mikroba. Proses sterilisasi pada percobaan kali ini hanya menggunakan sterilisisasi dengan menggunakan energi panas dan sterilisasi dengan larutan kimia. Yang tergolong sterilisasi dengan energi panaas ialah sterilisasi kering, sterilisasi basah, dan lampu bunsen. Sedangkan yang tergolong sterilisasi dengan larutan kimia ialah sterilisasi dengan menggunakan alkohol. Sterilisasi dengan menggunakan energi panas yang digunakan pada praktikum kali ini hanyalah dengan sterilisasi kering menggunakan oven dan sterilisasi dengan api langsung seperti lampu bunsen. Sterilisasi kering merupakan suatu proses sterilisasi dengan menggunakan energi panas tanpa disertai dengan uap-uap panas. Tidak semua peralatan dapat disterilkan dengan menggunakan sterilisasi kering ini, hanya bahan-bahan yang mampu bertahan pada suhu tinggi yang dapat disterilkan, misalnya seperti gelas ukur, petri disk, dll. Sedangkan untuk peralatan yang berbahan karet atau plastik tidak dapat disterilkan dengan sterilisasi kering ini, karena kedua bahan tersebut dapat meleleh pada suhu panas yang tinggi. Alat yang digunakan untuk proses sterilisasi ini ialah oven. Pada praktikum kali ini suhu yang digunakan untuk proses sterilisasi ialah 1200C dengan waktu 20 menit. Namun perlu diketahui, sebelum peralatan yang akan di sterilisasi masuk kedalam oven, peralatan tersebut harus dibungkus dengan menggunakan kertas berwarna coklat.

Tujuan pembungkusan dengan kertas coklat ialah guna panas yang dihasilkan oleh oven pada sterilisasi kering dapat terserap secara merata. Seperti yang diketahui bersama, jika warna coklat merupakan pigmen warna yang dapat menyerap panas secara optimal, sehingga panas yang diserap akan rata pada semua sisi kertas. Apabila penyerapan panas tersebut tidak merata, maka dapat menimbulkan warna kuning seperti noda pada peralatan yang disterilisasi tersebut. Apabila ini terjadi maka percobaan tidak dapat berjalan optimal. Kemudian, dalam membungkus peralatan dengan kertas coklat tersebut usahakan serapat mungkin, agar tidak ada celah bagi mikroba untuk hinggap kedalam peralatan tersebut.

Selain dengan oven, sterilisasi dengan energi panas lainnya dapat menggunakan lampu bunsen. Lampu bunsen sangat besar peranannya dalam menjaga sterilisasi peralatan terutama pada saat proses inokulasi. Pada saat proses inokulasi, peralatan yang digunakan tidak dapat jauh dari lampu bunsen tersebut, ini bertujuan agar tingkat kesterilan alat dapat terjaga. Jarum ose adalah salah satu alat yang digunakan dalam proses inokulasi, fungsi dari jarum ose itu sendiri ialah digunakan untuk mengambil sample bakteri dari tabung reaksi untuk dimasukkan kedalam petri disk. Akibat dari cara kerjanya tersebut, pada jarum ose dapat ditemukan sejumlah bakteri dari sample yang berbeda, apabila ini terjadi maka akan mengakibatkan terganggunya proses pengamatan terhadap bakteri yang dilakukan. Oleh karena itu, kita harus mencegahnya dengan membakar bagian ujung jarum ose baik itu sebelum ataupun sesduah pengambilan sample pada lampu bunsen sampai warna pada ujung jarum tersebut memerah. Dalam melakukan kegiatan praktikum, hendaknya meja kerja yang akan digunakan hendaknya di sterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol dengan kadar 70%. Ini bertujuan guna kontaminan-kontaminan yang ada dapat dihilangkan dan tingkat kesterilan dapat terjaga. Begitupun dengan perlakuan pada jarum ose, dimana pada jarum ose yang telah selesai digunakan hendaknya disterilkan dengan menggunakan alkohol tersebut.

10

VII. PENDALAMAN

Untuk meningkatkan pemahaman mengenai sterilisasi bahan dan peralatan, praktikan diwajibkan menjawab pertanyaan berikut ini : a. Apa tujuan utama membungkus peralatan gelas menggunakan kertas coklat, sebelum

proses sterilisasi dilakukan? Tujuan pembungkusan dengan kertas coklat ialah guna panas yang dihasilkan oleh oven pada sterilisasi kering dapat terserap secara merata. Seperti yang diketahui bersama, jika warna coklat merupakan pigmen warna yang dapat menyerap panas secara optimal, sehingga panas yang diserap akan rata pada semua sisi kertas. Apabila penyerapan panas tersebut tidak merata, maka dapat menimbulkan wrna kuning pada peralatan seperti petri disk. Apabila ini terjadi maka percobaan tidak dapat berjalan optimal.

b. Apa tujuan utama penggunaan aluminium foil sebagai pembungkus tutup Erlenmeyer dalam sterilisasi media kaldu dan media agar?

Labu

Tujuan utama penggunaan alumunium foil ialah sebagai pembungkus untuk mencegah masuknya uap air kedalam labu erlenmeyer yang di dalamnya terdapat media, selain itu juga untuk mencegah terjadinya penguapan di dalam labu erlenmeyer. Alasan digunakannya alumunium adalah alumunium mampu bertahan pada suhu panas dan sifatnya yang tidak menyerap air. Dengan demikian, tidak akan terjadinya keluar atau masuknya uapa dari lingkungan ke sistem maupun sebaliknya.

c. Jelaskan mekanisme penggunaan oven listrik dan waterbath terhadap proses sterilisasi yang terjadi. Mekanisme dari oven listrik adalah penggunaan energi listrik sebagai penghasil panas pada ruang dalam oven. Diman panas ini akan di gunakan untuk membunuh mikroba yang berada pada peralatan yang akan di sterilisasi. Sedangkan mekanisme dari waterbath adalah penggunaan energi listrik sebagai penghasil panas. Energi panas ini akan di gunakan untuk memanaskan air, dan panas dari air inilah yang akan di gunakan sebagai pembunuh mikroba yang ada pada media kaldu atau media agar. Perbedaan dari keduanya terletak pada media penghantar panas nya. Kalau oven listrik panas nya akan sampai secara langsung kepada peralatan sterilisasi. Sedangkan waterbath panas nya terlebih dahulu di alihkan pada keberadaan air dan uap panas.

11

d.

Meskipun labu Erlenmeyer telah ditutup dan proses sterilisasi secara dilakukan secara

baik, namun masih sering dijumpai terjadinya kontaminasi pada media kaldu maupun media agar. Jelaskan oleh Saudara kemungkinan utama penyebab kontaminasi tersebut. Penggunaan labu erlenmeyer pada proses sterilisasi berarti proses sterilisasi yang dilakukan tersebut adalah sterilisasi basah, berarti proses sterilisasinya menggunakan uapuap air yang panas. Dijumpainya kontaminasi pada media kaldu setelah dilakukan sterilisasi, menurut saya dikarenakan masih ditemukannya mikroba yang mampu hidup alam keadaan panas sekalipun. Endospora bakteri lebih tahan panas daripada sel vegetatif, tetapi semua bentuk endospora tidak memiliki ketahanan yang sama persis terhadap panas. Misalnya endospora B.subtilis dapat dimatikan dengan pemanasan 100C dalam waktu pendek, sedangkan endospora B.stearothermophilus dapat bertahan dalam air mendidih berjam-jam.

e. Saudara jelaskan, mengapa ujung pipet hisap

yang akan disterilisasi

selalu

dimasukkan atau disumbat dengan kapas sebelum dibungkus? Tujuan nya adalah untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh udara setelah sterilisasi selesai di lakukan. Karena bagian dalam dari pipet hisap merupakan bagian yang paling penting pada saat pipet hisap di gunakan. Oleh karena itu perlu di lakukan pencegahan masuknya kontaminan dari udara bebas ke bagian dalam pipet hisap.

f.

Mengapa hasil sterilisasi ada yang bersifat tahan lama ada yang tidak?

Jawabannya berkaitan dengan penangannnya pasca proses sterilisasi, dimana pada proses sterilisasi dengan menggunakan sterilisasi kering semua peralatan dibungkus dengan menggunakan kertas coklat, kertas coklat ini dapat mencegah terjadinya kontak antara udara dengan peralatan yang sudah di sterilisasi. Dengan demikian, peralatan yang sudah disterilisasi dapat bertahan lama. Sedangkan pada sterilisasi dengan menggunakan lampu bunsen tidak dapat bertahan lama karena setelah proses sterilisasi peralatan yang digunakan langsung kontak dengan udara, kontak tersebut yang menyebabkan peralatan bersifat tidak tahan lama.

g.

Sebutkan dan jelaskan metode strerilisasi paling tepat untuk peralatan yang terbuat

dari gelas? Sterilisasi yang paling tepat untuk digunakan pada gelas ialah sterilisasi kering, ini dikarenakan pada sterilisasi kering tidak menghasilkan uap, dimana apabila gelas yang

12

dipanaskan dalam uap proses sterilisasinya berjalan tidak efektif karena tidak akan bertahan lama, sedangkan apabila dipanaskan dengan menggunakan oven, maka gelas dapat bertahan lama karena mendapat perlakuan pembungkusan dengan menggunakan kertas coklat.

h. Sebutkan dan jelaskan metode paling tepat untuk sterilisasi media kultur. Karena bahan yang disterilisasi adalah media kultur, maka metode yang paling tepat untuk mensterilisasi media kultur tersebut adalah dengan menggunakan sterilisasi basah. Hal ini di karenakan pada media kultur seperti larutan kaldu tersebut adalah larutan yang sifatnya mudah menguap. Sehingga sterilisasi dengan menggunakan panas yang tinggi akan terasa kurang efektif, karena dapat mengakibatkan air dari larutan kaldu akan menguap dan konsentrasi dari larutan kaldu akan berubah.

13

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1990. Dasar-dasar mikrobiologi. Djambatan. Malang Hadioetomo, Ratna S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia : Jakarta Suriawira, Unus. 1986. Pengantar Mikrobiologi Umum. Penerbit angkasa : Bandung Lay, Bibiana W dan Sugyo H. 1992. Mikrobiologi. Penerbit CV.Rajawali : Jakarta http://www.ekmon-sourus.blogspot.com Diakses pada tanggal 15 Oktober 2012