Gen VEGF121 sebagai Bahan Aktif Obat Terapi Penyakit Kelainan Jantung dan Sistem Regulasi Obat

Oleh: Muslimah / Teknologi Bioproses / 1106017622 Abstrak Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) adalah regulator (asam amino) penting yang diproduksi oleh sel-sel yang berfungsi merangsang perkembangan vaskular selama embryogenesis (vasculogenesis) serta merupakan faktor pertumbuhan pembuluh darah pada orang dewasa (angiogenesis). Terdapat empat jenis asam amino VEGF yaitu 121, 165, 189, dan 206 yang dihasilkan dari sebuah gen manusia yang mengandung 8 ekson. Bentuk aktif dari jenis-jenis VEGF tersebut memiliki ikatan disulfida homodimer. Gen VEGF121 saat ini mulai dikembangkan oleh Todd K. Rosengart untuk pengobatan terapi gen pada sejumlah penyakit kelainan jantung, diantaranya Iskemia Miokardium. Iskemia miokardium merupakan gangguan suplai darah karena terdapat penyumbatan pada aliran darah sehingga darah kekurangan suplai oksigen. Pengobatan ini dilakukan dengan pemberian mediator yang dikenal dengan angiogens yang menyebabkan pembentukan pembuluh darah. Transfer gen merupakan salah satu pendekatan untuk mengirimkan angiogen ke jantung dimana koding cDNA untuk VEGF dikirim ke miokardium, dengan sel-sel miokard yang berperan mensintesis VEGF. Semua anggota keluarga VEGF merangsang respon seluler dengan mengikat reseptor tirosin kinase pada permukaan sel. Hal ini menyebabkan sel mengalami dimerisasi dan menjadi aktif melalui trasfosforilasi. Reseptor VEGF memiliki bagian ekstraseluler yang terdiri dari 7 imunoglobulin seperti sejumlah domain, transmembran, mencakup wilayah tunggal , dan bagian intraseluler yang mengandung domain tirosin kinase. Selanjutnya VEGF-A mengikat VEGFR-1 (Flt-1) dan VEGFR-2 (KDR/Flk-1). VEGFR-2 muncul untuk memediasi hampir semua respon selular yang terjadi pada VEGF. VEGF-C dan VEGF-D merupakan ligan untuk reseptor ketiga (VEGFR-3), yang memediasi lymphangiogenesis. Produksi VEGF diinduksi pada sel yang tidak menerima cukup oksigen. Ketika sebuah sel mengalami defisiensi oksigen, maka akan menghasilkan HIF (hypoxia-inducible factor) yang merupakan sebuah faktor transkripsi. Selanjutnya HIF merangsang pelepasan VEGF. VEGF yang beredar kemudian mengikat VEGF Reseptor pada sel endotel, yang memicu Tyrosine Kinase Pathway dan menyebabkan angiogenesis. Pada produksi obat baru hal yang penting agar obat dapat dipasarkan adalah alur regulasi obat. Regulasi obat merupakan tugas yang kompleks yang melibatkan beberapa stakeholders. Oleh karena itu terdapat beberapa persyaratan yang harus dipenuhi, antara lain dasar hukum, sumber daya manusia dan sumber daya keuangan yang memadai, independensi, dan tranparansi. Regulasi hanya dapat berfungsi dengan baik apabila ditunjang oleh sumber daya manusia yang kompeten, serta berintegritas tinggi. Anggaran yang memadai dan berkesinambungan, akses terhadap ahli, hubungan internasional, laboratorium pemeriksaan mutu, dan system penegakan hukum di pengadilan yang dapat diandalkan. Kata kunci: Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), VEGF121, iskemia, pembuluh darah, terapi gen, regulasi obat. I. Definisi VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) adalah regulator penting atau sinyal kimia yang diproduksi oleh sel-sel yang merangsang perkembangan vaskular selama embryogenesis (vasculogenesis) serta merupakan faktor pertumbuhan pembuluh darah pada orang dewasa (angiogenesis). Fungsi normal VEGF adalah untuk menciptakan pembuluh darah baru selama perkembangan embrio, pembuluh darah baru setelah cedera, dan pembuluh darah baru (sirkulasi kolateral) untuk memotong pembuluh yang tersumbat. VEGF merupakan suatu protein yang dikodekan oleh gen tujuh ekson yang terletak pada kromosom 6. Kode gen VEGF adalah sebagai berikut:
1 ggccgcgaga agcggcggcg gggaggagga gcgggcgaga cgcggcaggg agcggcggcg 61 gcggcggctt gtcggcttgt cggatcgcgg cgggccccgc tccgaggcgt gcgccggcaa

121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901

ccatgaactt gcgcggagtt ttatcaaatt acattttcca tgatgagatg acaacgtcac tgagcttctt aagaaaaaaa ggtacaaacc tacaagatcc ggcagcttga aaaagaaggg aaaacaaaac tcagtacgga

tctgctcact gtcgaaggct cctggaagtc ggagtaccct tgcgggttgc gatggagatc acagcacagt atcaaagcga acccagcttt ccagacctgt gttaaacgag ggaacagccc actaatccaa cgatggactc

tggatccact gctccggccc tacgaacgca gatgaggtgg tgcggcgatg gcaagaatta aaatgtgact ggaaagggga cactgtgagc aaatgttcct cgcacttgca tgtttctgga atgaacccta cggaaggaac

gggggctggc tgggggatgg gcttctgcag agtacatatt agggcctaga aaccccatca gcagaccaaa agggtcaaaa cttgctcaga gcaaattcac gatgtgaaaa gcctgatttc aaaatgaagg attccccaag

ggcgctgctc ggagcggaag gacaattgag caggccatcc atgtgtccct gagtcagcac gaaagatgtc gagaaagcgc gaggagaaag agactcacgt accgagacgg tcgcctggac atcggtagag gcacccgccg

tatctgcaga cccaatgaag accctggtgg tgtgtgcctc gtggatgtgt atagcgcaca aaaaataagc aagaaaggnc cacttgtttg tgcaagtcga tgagcagcgg agaaaaatac cacagcactt cacagg

Jenis-jenis VEGF dan VEGFReseptor dalam tubuh makhluk hidup sangat beragam, seperti yang ditunjukkan pada tabel berikut.

Gambar 1. VEGF/VEGFR and co-receptor function as assessed by gene targeting Genotype Phenotype
(Sumber: Olsson, Anna-Karin, dkk. 2006. VEGF receptor signalling-in control of vascular function. Dag Hammarskjldv: Department of Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory)

II. VEGF121 Protein VEGF berfungsi membentuk pembuluh darah baru dengan cara berinteraksi dengan reseptor spesifik pada sel-sel endotel, hingga akhirnya terjadi migrasi endotel sel, proliferasi, agregasi ke dalam struktur seperti tabung, dan jaringan dari sistem arteri dan vena. Terdapat empat jenis asam amino VEGF yaitu 121, 165, 189, dan 206 dihasilkan dari sebuah gen manusia yang mengandung 8 ekson sebagai hasil dari alternatif penyambungan. Bentuk aktif dari jenis-jenis VEGF tersebut memiliki ikatan disulfida homodimer. VEGF121 berbeda dengan jenis VEGF lainnya karena VEGF121 merupakan satu-satunya jenis VEGF yang yang tidak dapat mengikat heparin. VEGF121 akan berikatan pada VEGF reseptor, namun keberadaan heparin akan menghambat terjadinya ikatan VEGF121 dengan VEGF reseptor pada sel melanoma. VEGF121 berperan dalam sintesis faktor pertumbuhan pembuluh darah (vascular endothelia). Gen VEGF121 memiliki 121 asam amino dengan kode gen sebagai berikut:
1 61 121 181 241 301 361 gccccgatgg taccagcgct gatgaaatcg tgcaatgacg atgcgtatta aaatgtgaat cgttaa cggaaggtgg cttattgcca aatacatttt agggcctgga aaccgcacca gtcgcccgaa tggtcaaaac cccaatcgaa caaaccgtct gtgcgttcca aggccaacac gaaagaccgt catcacgagg acgctggttg tgtgtcccac accgaagaat atcggtgaaa gcacgccagg tagtcaaatt atattttcca tgatgcgctg ccaatattac tgtctttcct aaaagtgtga tatggacgtt ggaatatccg tggtggctgc gatgcaaatt gcagcacaac caagccgcgt

Gen VEGF121 saat ini mulai dikembangkan oleh Todd K. Rosengart untuk pengobatan terapi gen pada sejumlah penyakit kelainan jantung, diantaranya Iskemia Miokardium. Iskemia miokardium merupakan gangguan suplai darah karena terdapat penyumbatan pada aliran darah sehingga darah kekurangan suplai oksigen. Pengobatan ini dilakukan dengan pemberian mediator yang dikenal dengan angiogens yang menyebabkan pembentukan pembuluh darah. Strategi ini dilakukan berdasarkan hasil pengamatan berukut: 1. Respon biologis awal ke pembuluh darah yang terhambat melingkupi pembentukan pembuluh kolateral yang dapat memback up gangguan tersebut. 2. Ekspresi regulasi dari adanya angiogenesis secara alami dan reseptor yang seasal untuk pembentukan pembuluh kolateral. 3. Proses awal dari pembuluh kolateral dikarakterisasi tidak sempurna di dalam pelepasan ischemia sekunder ke penyakit pembuluh darah oklusif. Salah satu metode pengobatan kelainan arteri koroner aterosklerosis atau Coronary Artery Disease (CAD) yang sudah ada adalah dengan metode percutaneous transluminal coronary angioplasty dan Coronary Artery Bypass Grafting (CABG). Namun kelemahannya hasil yang diperoleh terbatas pada pasien dengan penyakit parah atau difus dan tidak cukup menjawab masalah restenosis. Oleh karena itu, terapi angiogenesis dapat menjadi tambahan yang berharga untuk pengobatan CAD. Salah satu pendekatan untuk terapi angiogenesis adalah terapi gen, strategi drug delivery dengan bahan aktif urutan kode gen yang sesuai untuk angiogenesis tertentu dapat dilakukan untuk mengaktifkan sel-sel yang membentuk jaringan untuk memproduksi dan mensintesis angiogen spesifik tertentu seperti VEGF. Transfer gen merupakan salah satu pendekatan untuk mengirimkan angiogen ke jantung di mana koding cDNA untuk VEGF dikirim ke miokardium, dengan sel-sel miokard yang berperan mensintesis protein VEGF. Selama ini telah dilakukan trasnfer gen VEGF dengan bantuan virus, namun hasilnya belum cukup memuaskan. Replikasi yang tidak sempurna dari vektor transfer gen adenovirus (Ad) ditunjukkan pada hewan uji, meskipun terdapat keuntungan tertentu yaitu pengiriman angiogens seperti VEGF dengan vektor Ad ini memberikan efisiensi transfeksi yang tinggi. Vektor Ad tersebut menyediakan penempatan ekspresi tingkat tinggi dari angiogen selama kurang lebih 1 sampai 2 minggu, durasi ini sesuai untuk menghambat atau meringankan 3

iskemia tetapi tidak cukup lama untuk menghasilkan pembentukan pembuluh darah baru pada angiogenesis hingga keadaan menjadi normal. Penelitian saat ini mengevaluasi tata cara dari AdGV- VEGF121.10, suatu vektor ekspresi Ad E1- E3- yaitu asam amino VEGF dari manusia, di terapkan kepada pasien yang mengidap CAD. Hasil yang diperoleh menunjukkan pada awal 30 hari pertama, terapi ini dapat ditoleransi dengan baik oleh pasien. Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan dan dilaporkan pada sebuah jurnal yang ditulis oleh Todd K. Rosengart, MD beserta rekan-rekannya di New York. III. Mekanisme Kerja VEGF121 Pendekatan terapi ini didasarkan pada pengetahuan bahwa di jantung dewasa, gen yang mengkode reseptor angiogens jumlahnya tidak banyak, kondisi ini tidak mencukupi pada sebagian besar individu untuk membentuk pembuluh baru pada kondisi iskemia kronis. Semua anggota keluarga VEGF merangsang respon seluler dengan mengikat reseptor tirosin kinase pada permukaan sel. Hal ini menyebabkan sel mengalami dimerisasi dan menjadi aktif melalui trasfosforilasi. Reseptor VEGF memiliki bagian ekstraseluler yang terdiri dari 7 imunoglobulin seperti sejumlah domain, transmembran mencakup wilayah tunggal , dan bagian intraseluler yang mengandung domain tirosin kinase. Selanjutnya VEGF-A mengikat VEGFR-1 (Flt-1) dan VEGFR-2 (KDR/Flk-1). VEGFR-2 muncul untuk memediasi hampir semua respon selular yang terjadi pada VEGF. Fungsi VEGFR-1 kurang terdefinisi dengan baik, meskipun diperkirakan untuk memodulasi sinyal VEGFR-2. Fungsi lain dari VEGFR-1 dimungkinkan adalah untuk bertindak sebagai reseptor umpan, eksekusi VEGF dari VEGFR-2 mengikat yang penting selama vasculogenesis dalam embrio. VEGF-C dan VEGF-D merupakan ligan untuk reseptor ketiga (VEGFR-3), yang memediasi lymphangiogenesis. Mekanisme ini dapat dilihat lebih jelas pada gambar 2 di bawah ini.

Gambar 2. Mekanisme pensinyalan komplek dan pengikatan reseptor pada VEGF

(Sumber: Olsson, Anna-Karin, dkk. 2006. VEGF receptor signalling-in control of vascular function. Dag Hammarskjldv: Department of Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory)

Sinyalisasi VEGFR dimodulisasi dengan co-reseptor yang berbeda-beda. VEGF bersama dengan VEGFR berikatan dengan co-reseptor seperti proteoglikan sulfat heparan (HSPGs) dan neurifilin. Interaksi ini dapat mempengaruhi respon mediasi VEGFR, sebagai contoh, menyebabkan kompleks reseptor menjadi menjadi lebih efektif pada setengah umur pembentukan kompleks mekanosensori. Aliran darah dapat mengaktivasi VEGFR di dalam sebuah ligan yang bersifat independen, yang terbentuk dari kompleks mekanosensori yang mengandung molekul sel adesi platelet endotelial 1 (PECAM1), endotelial vaskular (VE) cadherin, VEGFR dan integrins, PLGF, serta faktor pertumbuhan plasenta. Mekanisme ini dapat dilihat pada gambar 3 di bawah ini.

Gambar 3. Mekanisme pensinyalan komplek dan pengikatan reseptor pada VEGF

(Sumber: Olsson, Anna-Karin, dkk. 2006. VEGF receptor signalling-in control of vascular function. Dag Hammarskjldv: Department of Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory)

VEGF Reseptor masing-masing jenisnya tersusun atas sejumlah protein yang berbeda yang dapat diamati pada gambar di bawah ini.

Gambar 4. VEGFR phosphorylation sites and signal transduction

(Sumber: Olsson, Anna-Karin, dkk. 2006. VEGF receptor signalling-in control of vascular function. Dag Hammarskjldv: Department of Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory)

Produksi VEGF diinduksi pada sel yang tidak menerima cukup oksigen. Ketika sebuah sel mengalami defisiensi oksigen, maka akan menghasilkan HIF (hypoxia-inducible factor) yang merupakan sebuah faktor transkripsi. Selanjutnya HIF merangsang pelepasan VEGF. VEGF yang beredar kemudian mengikat VEGF Reseptor pada sel endotel, yang memicu Tyrosine Kinase Pathway dan menyebabkan angiogenesis. HIF1 dan HIF1 terus menerus diproduksi, namun HIF1 sangat labil terhadap keberadaan oksigen, sehingga dalam keadaan anaerobik HIF1 akan terdegradasi. Ketika sel mengalami hipoksia, maka HIF1 terus diproduksi dan kompleks HIF1/ menstimulasi pelepasan VEGF. IV. Metode Injeksi Gen transfer vektor AdGV- VEGF121.10 berdasarkan pada genom serotipe Ad5, dengan penghapusan di daerah E1 dan E3. Rekaman ekspresi berada pada daerah E1 dan mengandung promotor cytomegalovirus, sebuah rangkaian artifisial, cDNA VEGF121 manusia, dan SV40 polyA atau stop signal. AdGV- VEGF121.10 diperbanyak di dalam 293 sel, dimurnikan dengan CsCl dengan variasi densitas, didialisis, dan disimpan pada suhu -700C. Vektor memenuhi semua kriteria keamanan yang ditetapkan oleh Food and Drug Administration Biro Biologis ( FDA BB ) untuk persiapan vektor Ad kelas klinis (FDA BB - IND 7381) termasuk tidak bersifat endotoksin ataupun ifeksius. Sebelum digunakan, vektor tersebut dicairkan, diencerkan dalam larutan sukrosa 3%, dibuat menjadi 100l larutan dalam jarum suntik berukuran 1-mL-insulin dengan jarum 27-gauge (Becton Dickinson). AdGVVEGF121.10 diberikan melalui suntikan langsung ke miokard. Suntikan yang diberikan (100 L/ injeksi, pada 10 situs / pasien, masing-masing situs 1 sampai 1,5 cm). Suntikan diberikan ke daerah yang normal (dilewati) miokardium ke wilayah iskemik (nonbypassed) yaitu pada bagian pembuluh darah kolateral yang akan menjembatani wilayah miokard dan iskemik. V. Regulasi Obat Regulasi obat merupakan tugas yang kompleks yang melibatkan beberapa pemangku kepentingan (stakeholders). Oleh karena itu terdapat beberapa persyaratan yang harus dipenuhi, antara lain dasar hukum, sumber daya manusia dan sumber daya keuangan yang memadai, independensi, dan tranparansi. Regulasi hanya dapat berfungsi dengan baik apabila ditunjang oleh sumber daya manusia yang kompeten, serta berintegritas tinggi. Anggaran yang memadai dan berkesinambungan, akses terhadap ahli, hubungan internasional, laboratorium pemeriksaan mutu, dan system penegakan hukum di pengadilan yang dapat diandalkan. Untuk mendapatkan kepercayaan masyarakat, regulasi obat harus dilaksanakan secara indpenden dan transparan. Prosedur dan hasil kerja regulasi obat harus transparan bagi semua pemangku kepentingan, antara lain: 1. Penyusunan, publikasi dan penyebarluasan persyaratan, informasi yang harus diserahkan untuk berbagai permohonan izin; 2. Publikasi kriteria dan prosedur dalam pengambilan keputusan untuk permohonan izin di atas; 3. Publikasi keputusan yang diambil seperti: daftar obat terdaftar yang diperbaharui secara berkala; pencabutan pendaftaran; penarikan obat dari peredaran. Pada dasarnya regulasi menyangkut beberapa aspek yaitu keamanan, khasiat, mutu, dan informasi obat. Kegagalan pengawasan akan mengakibatkan masuknya obat palsu dan obat yang tidak jelas asal-usulnya ke dalam sistem pelayanan kesehatan. Pengawasan obat merupakan salah satu upaya mengatasi masalah penyalahgunaan obat yang merupakan masalah yang kompleks dan harus ditangani secara lintas sektor dan lintas program. Pengawasan obat juga mencakup perlindungan masyarakat terhadap penggunaan obat yang salah sebagai akibat dari kekurang-pengetahuan masyarakat serta informasi yang tidak benar, tidak lengkap dan menyesatkan. Menghadapi permasalahan di atas, pemberdayaan masyarakat merupakan salah satu upaya yang ampuh untuk menghadapi salah penggunaan dan penyalahgunaan obat. Akhirnya dalam rangka penegakan 6

hukum, di bidang obat, kerjasama dan tanggung jawab setiap unsur pemerintah harus selalu dipelihara dan ditingkatkan.Langkah Kebijakan: 1. 2. Regulasi obat dilaksanakan secara transparan dan independen. Perkuatan fungsi pengawasan obat sebagai satu kesatuan yang menyeluruh terdiri dari: a. Pendaftaran obat nasional; b. Perizinan sarana produksi dan distribusi; c. Inspeksi sarana produksi dan sarana distribusi obat; d. Akses laboratorium pemeriksaan mutu; e. Pelulusan uji oleh regulator yang kompeten; f. Surveilans pasca pemasaran; g. Otorisasi uji klinik. Peningkatan sarana dan prasarana regulasi obat, serta pemenuhan kebutuhan sumber daya manusia yang memadai. Pemantapan usaha impor, produksi, distribusi, dan pelayanan obat. Peningkatan kerjasama regional maupun internasional meliputi standar mutu, standar proses, dan pengembangan sarana jaminan mutu (quality assurance) obat. Pengembangan tenaga baik dalam jumlah dan mutu sesuai dengan stndar kompentesi. Pengakuan internasional terhadap sertifikasi nasional obat, sarana produksi obat, dan tenaga profesional di bidang obat. Peningkatan inspeksi jalur distribusi yang ditunjang prosedur operasi standar, dilaksanakan oleh tenaga inspektur terlatih dengan jumlah memadai, serta dilengkapi peralatan yang lengkap (antara lain untuk tes obat sederhana). Pembentukan Pusat Informasi Obat di pelayanan kesehatan dan Dinas Kesehatan untuk intensifikasi penyebaran informasi obat. Peningkatan kerjasama dengan instansi terkait dalam penegakan hukum secara konsisten. Pemberdayaan masyarakat dan pengembangan peran serta masyarakat untuk berperan dalam kontrol sosial menghadapi obat palsu dan obat tidak terdaftar melalui berbagai jalur komunikasi dan berbagai media. Pengembangan sistem nasional farmakovijilan sebagai pengembangan dari Monitoring Efek Samping Obat Nasional (MESO Nasional). Mengembangkan peraturan perundang-undangan yang mengatur promosi obat dengan mengadopsi Ethical Criteria for Medicinal Promotion dari WHO untuk merespons promosi obat non-etis.

3. 4. 5. 6. 7. 8.

9. 10. 11.

12. 13.

VI. Ringkasan Gen VEGF121 merupakan salah satu terobosan baru yang dapat membantu dunia medis khususnya untuk terapi kelainan jantung yaitu dengan membantu mempercepat pembentukan pembuluh darah baru atau angiogenesis. Produksi VEGF diinduksi pada sel yang tidak menerima cukup oksigen, seperti saat terjadi iskemia miokardium. Dengan pemberian terapi VEGF121 melalui injeksi membantu mempercepat respon angiogenesis yang secara alami akan berjalan lambat karena kadar VEGF normal pada tubuh yang tidak banyak. Hal ini akan sangat membantu untuk penderita iskemia kronis. Obat dengan bahan aktif gen VEGF121 termasuk jenis obat baru. Oleh karena itu bila akan dipasarkan perlu melalui serangkaian proses sesuai dengan ketentuan regulasi obat agar dapat diterima oleh masyarakat. Terdapat beberapa persyaratan yang harus dipenuhi, antara lain dasar hukum, sumber daya manusia dan sumber daya keuangan yang memadai, independensi, dan tranparansi. Regulasi hanya dapat berfungsi dengan baik apabila ditunjang oleh sumber daya manusia yang kompeten, serta berintegritas tinggi. Anggaran yang memadai dan berkesinambungan, akses terhadap ahli, hubungan internasional, laboratorium pemeriksaan mutu, dan system penegakan hukum di pengadilan yang dapat diandalkan. 7

Daftar Pustaka Depkes RI. 2005. Rancangan Obat Nasional. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesi. Olsson, Anna-Karin, dkk. 2006. VEGF receptor signalling-in control of vascular function. Dag Hammarskjldv: Department of Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory. Rosengart, Todd K, Leonard Y, dkk. 1999. Angiogenesis Gene Therapy Phase I Assessment of Direct Intramyocardial Administration of an Adenovirus Vector Expressing VEGF121 cDNA to Individuals With Clinically Significant Severe Coronary Artery Disease. American Heart Association: http://circ.ahajournals.org/content/100/5/468 Rosengart, Todd K, Leonard Y, dkk. 1999. Six-Month Assessment of a Phase I Trial of Angiogenic Gene Therapy for the Treatment of Coronary Artery Disease Using Direct Intramyocardial Administration of an Adenovirus Vector Expressing the VEGF121 cDNA. New York: Lippincott Williams & Wilkins, Inc. Vol. 230, No. 4.