Laporan Praktikum Biokimia Percobaan ke 7 Induksi Beta-Galaktosidase

Nama NIM : Widya Wigati : 10511035

Kelompok : V Asisten Tanggal Praktikum : Riski (20512045) : Kamis, 3 April 2014

Tanggal Pengumpulan : Kamis, 10 April 2014

Laboratorium Biokimia Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung 2014

Percobaan ke 7 Induksi Beta Galaktosidase I. Tujuan Percobaan Menginduksi II. Teori Dasar Laktosa adalah gula bisakarida yang tersusun atas glukosa dan galaktosa. Laktosa dapat diuraikan menjadi glukosa dan galaktosa dengan bantuan enzim galaktosidase. Bakteri E. coli dalam hidupnya dapat memanfaatkan baik laktosa maupun glukosa tergantung gula mana yang tersedia dilingkungan. Bakteri E. coli mempunyai kemampuan mensintesis -galaktosidase sehingga bila laktosa yang dimanfaatkan sebagai sumber karbon maka bakteri tersebut akan mampu mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Operon, adalah. sekelompok gen yang diapit secara bersamaan oleh sepasang promotor dan terminator. Gen-gen pada satu operon akan diekspresikan secara bersamaan melalui inisiasi transkripsi pada promotor yang sama dan berakhir pada terminator yang sama. Gen-gen yang berada pada satu operon mempunyai hubungan fungsi dalam metabolisme. Lac operon adalah operon yang berfungsi dalam proses metabolisme laktosa di bakteri E.coli ataupun bakteri lainya. Pada operon laktosa terdapat tiga gen struktural yaitu sebagai berikut : lacZ : gen yang berfungsi untuk memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. mengubah laktosa menjadi allolaktosa yang mengatur Lac operon (mengkode enzim beta-galaktosidase) Lac Y : berperan dalam transport laktosa dalam membran sitoplasma (mengkode enzim permease) Lac A : berperan dalam mengkode enzim transasetilase. Dalam kasus operon laktosa terdapat dua gen regulator yaitu gen lac-i dan gen crp. Gen Lac i berhubungan dengan kehadiran laktosa, sedangkan gen crp berhubungan dengan kehadiran glukosa. Gen regulator berperan mengatur ekspresi gen struktural. dan menentukan aktivitas beta-galaktosidase dari E.Coli menggunakan teknik spektrofotometri

Skema lac operon di dalam sel E.coli :

Operator : urutan basa di DNA yang berdekatan dengan promotor Lac mRNA dan merupakan tempat terikatnya represor. Represor : protein/chemical yang menempel pada operator dan mengalangi proses transkripsi. Inducer : chemical yang menginisiasi proses transkripsi dengan cara melepaskan represor dari operator. Promotor : tempat menempel nya RNA polimerase yang juga berfungsi untuk memperkenalkan / mem-promote kan proses transkripsi. Pada percobaan ini, kultur bakteri ditumbuhkan dulu dalam media yang berisi berbagai gula yang berbeda-beda. Gula-gula tersebut dijadikan sumber energi bakteri selama inkubasi semalaman. Sebagai substrat, tidak digunakan laktosa, melainkan ONPG (orthonitrophenyl galactosides), yaitu suatu senyawa galaktosida. Setelah ONPG dipotong oleh enzim -galactosidase, akan dihasilkan ONP (orthonitrophenol) yang berwarna kuning (maks = 420 nm). Dengan

demikian, penentuan efek induksi gula pada sintesis -galaktosidase dapat ditentukan dengan metode spektrofotometri. Berikut merupakan struktur ONPG menjadi ONP dengan adanya bantuan dari enzim beta galaktosidase :

III. .Data Pengamatan

a.

Data OD Medium NB Medium NB + Laktosa Medium NB + Lak + glu 0.542 0.503 0.364

Tabung medium NB medium NB + laktosa medium NB + laktosa + glukosa 0.03 0.013 0.053

waktu inkubasi (menit) 10 20 30 1.952 1.987 1.988 2.003 2.001 1.992 0.054 0.103 0.152

40 1.998 1.984 0.211

IV.

Perhitungan dan Pengolahan Data

Absorban Vs Waktu
2.500 2.000 Absorban 1.500 NB 1.000 0.500 0.000 0 10 20 30 40 50 waktu (menit) NB+Lac NB+Lac+Glu

Menentukan Aktivitas Enzim

= 240.098

t (menit) Tabung A (NB) B (NB + laktosa) C (NB + glukosa + laktosa)

0 0 0 0

10 240,09 84 265,47 38 9,8901 1

20 122,20 17 132,60 44 9,4322 34

30 81,508 82 88,005 3 9,2796 09

40 61,439 11 65,738 9 9,6611 72

kurva aktivitas VS Waktu

300 250

Aktivitas

200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 Waktu (menit) NB NB+Lak NB+Glu+Lak

V.

Pembahasan Pada percobaan ini, akan ditentukan aktivitas enzim beta galaktisidase pada berbagai medium dan pada berbagai waktu inkubasi. Induksi beta galaktosidase yang dilakukan berasal dari kultur suspensi bakteri E.Coli yang telah ditumbuhkan pada 3 media yaitu media NB, media NB+laktosa dan media NB+glukosa+laktosa. penggunaan kultur suspensi e.coli sebagai prekursor enzim beta galaktosidase disebabkan karena bakteri e.coli tidak dapat menyerap laktosa, sehingga bakteri tersebut akan mengsintesis enzim beta galaktosidase untuk merombak laktosa menjadi suatu yang glukosa yang dapat diserap. Pada tahap awal, kultur bakteri disentrifugasi dengan tujuan untuk mengendapkan bakteri dan memisahkan dari media. Penambahan buffer Z bertujuan untuk mencuci sisa-sisa media yang masih ada. Sentrifugasi dan pencucian dengan buffer Z dilakukan berkali-kali supaya pemisahan bakteri dari media berlangsung dengan baik. Setelah ditambahkan buffer Z, maka akan ditambahkan kloroform dan SDS. Kloroform berfungsi sebagai pelarut organik yang ditambahkan untuk mengekstrak komponen-komponen sel yang sudah tidak dibutuhkan. Sedangkan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ditambahkan sebagai molekul yang akan melakukan proses lisis terhadap sel bakteri, sehingga SDS akan mengikat dan merusak membran sel bakteri dan akhirnya sel akan pecah dan enzim beta galaktosidase nya dapat terekstrak. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 37C. Suhu 37C merupakan suhu yang sama dengan suhu tubuh sehingga suhu tersebut merupakan suhu optimum bagi kerja enzim -galaktosidase. Dengan inkubasi terlebih dahulu pada suhu 37C akan membuat enzim menjadi efektif untuk bekerja. Setelah diinkubasi, ditambahkan ONPG (orthonitrophenyl-galactosides) yang berfungsi sebagai substrat. ONPG ini merupakan pengganti dari laktosa. Alasan penggunaan ONPG adalah karena saat adanya aktivitas enzim beta galaktosidase, ONPG ini akan berubah menjadi ONP yang berwarna kuning dan menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 420 nm. Sehingga penentuan aktivitas enzim beta galaktosidasenya dapat menggunakan metode spektrofotokimia. ONPG dapat bertindak sebagai pengganti laktosa dikarenakan strukturnya yang serupa dan

sama-sama akan terhidrolisis menjadi galaktosa ketika terdapat aktivitas enzim beta galaktosidase. Setelah penambahan ONPG. Maka tabung tersebut diinkubasi pada berbagai waktu. Ada juga tabung yang tidak diinkubasi. Setelah tahap inkubasi selesai, maka larutan di dalam tabung akan ditambahkan Na2CO3 yang bersifat basa, dan akan mengubah pH larutan. Kondisi pH menjadi tidak optimum lagi bagi kerja enzim, dan aktivitas enzim akan menurun. Sehingga Na2CO3 juga dapat bertindak sebagai penghenti kerja enzim beta gaaktosidase yang ada di dalam tabung. Setelah ditambahkan Na2CO3, tabung tersebut dimasukan kedalam penangas es
untuk memastikan bahwa aktivitas enzim beta galaktosidase tersebut benar-benar berhenti. Pada percobaan ini, seharunya tabung-tabung yang tidak melalui tahap inkubasi tidak menunjukan aktivitas enzim beta galaktosidase (absroban larutan harus sama dengan nol) akibat dari kerja enzim yang langsung dihentikan sesaat penambahan substrat. Namun yang terjadi pada percobaan ini adalah terdapatnya aktivitas enzim beta galaktosidase pada ke 2 tabung yang ditandai dengan nilai absorban yang tidak sama dengan nol. Hal tersebut dikarenakan saat ditambahkan ONPG, tidak langsung ditambahkan Na2CO3 (terdapat jeda

walaupun hanya beberapa detik) sehingga aktivitas enzim beta galaktosidase tetap ada walaupun hanya sedikit. Pada percobaan ini, dapat dilihat juga pengaruh dari ketiga medium pada aktivitas enzim beta galaktosidase. Dapat dilihat bawa medium NB+laktosa meiliki aktivitas enzim rata-rata yang lebih besar dibandingkan dengan ke-2 medium lainya. Sementara medium NB+laktosa+glukosa memiliki aktivitas terkecil dibandingkan dengan ke-2 medium lainya. Hal tersebut terjadi karena Kehadiran laktosa pada media tumbuh akan mendorong terjadinya ekspresi operon laktosa atau terjadi sintesis beta galaktosidase. Berarti kehadiran laktosa harus mampu melepaskan protein regulator dari promotor agar terjadi ekspresi gen lac-Z, untuk menghasilkan beta galaktosidase. Dalam sistem regulasi ini laktosa yang diambil oleh bakteri dapat berinteraksi dengan protein regulator dan asosiasi yang akan mengubah konfigurasi molekul protein regulator. Perubahan konfigurasi pada protein represor menyebabkan protein tersebut menjadi tidak mampu berasosiasi dengan operator. Dengan tidak adanya inhibitor pada promotor maka transkriptase menjadi tidak terhalang untuk melakukan inisiasi transkripsi dan terjadi ekspresi gen-gen pada operon laktosa.

Selain oleh laktosa, yang akan mendorong terjadinya ekspresi operon lac juga diatur oleh keberadaan glukosa. Ketika kadar glukosa dalan darah sudah banyak, maka tubuh secara otomatis akan lebih memilih untuk menggunakan glukosa daripada laktosa. Sehingga proses eskpresi enzim beta galaktosidase pun dihentikan. Regulasi oleh glukosa ini disebut represi katabolit atau represi glukosa. Proses regulasi ini melibatkan tiga komponen yaitu glukosa, cAMP (cyclic AMP), dan CAP (protein aktivator/ represor). CAP merupakan protein yang berperan mengaktifkan enzim transkriptase, protein ini disandikan oleh gen regulatorcrp Asosisasi antara CAP dengan transkriptase menyebabkan transkriptase menjadi aktif dan mampu mengkatalisis proses transkripsi; tanpa CAP transkriptase menjadi tidak aktif. Glukosa mengatur aktivitas CAP melalui pengaturan cAMP. Antara CAP dan cAMP dapat terbentuk asosiasi, dan asosiasi ini akan menyebabkan CAP aktifberperan sebagai aktivator; CAP yang terbebas dari cAMP tidak dapat berperan sebagai aktivator. Kuantitas cAMP berbanding terbalik dengan kuantitas glukosa. Saat glukosa di dalam sel berjumlah kecil cAMP ditemukan berada dalam jumlah yang besar, dan bila kuantitas glukosa dalam sel meningkat maka cAMP akan menurun. Dalam keadaan kuantitas rendah cAMP tidak dapat berasosiasi dengan CAP, akibatnya CAP tidak dapat menjadi aktivator. Jadi pada saat glukosa rendah cAMP berada dalam jumlah besar dan membentuk asosiasi cAMP-CAP yang berperan menjadi aktivator enzim transkriptase, sehingga terjadi transkripsi operon laktosa. Ketika glukosa meningkat sampai jumlah tertentu cAMP menurun sehingga tidak terbentuk asosiasi cAMP-CAP, dan CAP tidak dapat berperan sebagai aktivator dan transkripsi operon laktosa tidak berlangsung. Sehingga, sudah jelas bahwa medium pertumbuhan yang mengandung glukosa memiliki aktivitas enzim beta galaktosidase terendah, sementara medium pertumbuhan yang mengandung laktosa memiliki aktivitas enzim beta galaktosidase tertinggi.

VI.

Kesimpulan Medium NB + Laktosa menunjukan aktivitas rata-rata paling tinggi Medium NB menunjukan aktivitas rata-rata menengah Medium NB + glukosa + laktosa menunjukan aktivitas rata-rata paling rendah

VII. Daftar Pustaka Lehninger, A.L. (2008),principle of Biochemistry,5th Ed., Worth Publisher, Inc., New York. Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., Stryer, Lubert. Biochemistry, 6th ed. 2006. W. H. Freeman and Company. (page 892-901) http://oksyt3tra.wordpress.com/2008/09/26/apa-itu-operon/ - diunduh pada 5 April 2014 pukul 06.10 http://umi.staff.fkip.uns.ac.id/tag/lac-operon/ - diunduh pada 5 April 2014 pukul 06.10