1

PEMISAHAN DENGAN CARA KROMATOGRAFI

I. TUJUAN
Mengenal dan memahami pemisahan dengan cara kromatografi
Menentukan nilai Rf (Rate of Flow) dengan teknik kromatigrafi
II. TEORI
Kromatografi adalah teknik pemisahan dimana suatu zat dalam campuran
diuraikan berdasarkan kemampuannya untuk diserap oleh komponen lain yang
ada di dalam kromatografi yang dikenal sebagai fasa diam. Dalam kromatograf,
komponen-komponen terdistribusi dalam dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak.
Fasa diam dapat berupa zat cair atau padat. Sedangkan, fasa bergerak dapat
berupa cairan atau gas. Dengan demikian kromatografi dapat dibedakan atas dasar
kombinasi antara fasa diam dan fasa bergerak. Kombinasi tersebut dapat berupa
cair-gas, padat-cair, cair-cair, dan gas-padat.
Transfer masa antara fasa gerak dan fasa diam terjadi bila molekul-molekul
terserap pada permukaan fasa diam yang dapat berupa zat padat atau zat cair.
Kemampuan fasa diam untuk mengadopsi fasa bergerak sangat bergantung pada
sifat-sifat fasa diam dan fasa bergerak. Untuk setiap zat, hal ini sangat spesifik
sehingga teknik kromatografi di samping bertujuan untuk pemisahan dapat pula
digunakan untuk mengidentifikasi suatu zat. Pada saat ini telah dikenal cukup
banyak teknik kromatografi, diantaranya kromatografi kertas, lapis tipis (TLC),
gas (GC), kolom, dan eksklusi. Dengan berbagai cara tersebut, kegiatan prevaratif
dan analitik semakain valid dan reliable hasil yang diperoleh.
(Tim Kimia Analitik, 2014 : 36-37)
Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan
senyawa-senyawa organik dan anorganik, metode ini berguna untuk fraksionasi
campuran kompleks dan pemisahan untuk senyawa yang sejenis. Metode-metode
kromatografi tidak dapat dikelompokkan dengan hanya meninjau satu macam
sifat, artinya dapat dinyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi
pelarut, penukar ion kedalam satuan gelas.
Kromatografi bermanfaat untuk menguraikan suatu campuran. Dalam
kromatografi, komponen-komponen terdistribusu dalam dua fase, fase diam dan
2

fase gerak. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila
molekul-molekul campuran terserap pada permukaan partikel-partikel kedalam
sejumlah cairan yang terikat pada permukaan. Laju perpindahan suatu molekul zat
terlarut tertentu di dalam kolom atau lapis tipis zat penyerap secara langsung
berhubungan dengan bagian-bagian molekul tersebut di antara fase bergerak dan
fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secra selektif, maka masing-masing
komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada
karakteristik masing-masing penyerapan.
(Khopkar, 2008)
Dengan menggunakan cara kromatografi, pemisahan dalam banyak keadaan
lebih cepat dan efektif daripada sebelumnya dan banyak pemisahan, dapat berhasil
yang tidak akan dapat diusahakan dengan teknik lain, pemdobrakan yang tidak
ada bandingnya dalam biokimia mendapatkan pengertian dan fungsi enzim dan
protein yang lain telah berasal secara langsung dari penggunaan kromatografi
dalam penelitian biologik.
Hal yang penting dalam pengukuran atau penentuan pada kromatografi cair
adalah kita pertama-tama meneliti proses distribusi fasa sebagai bentuk biasa yang
terlihat dalam kromatografi cair. Jika dibayangkan adanya suatu zat padat dengan
permukaan yang bersih dan kering, lalu jika sekarang permukaan ini dialiri suatu
fluida atau gas, cairan murni atau larutan, biasanya ada kecenderungan dari
molekul gas, pelarut atau zat terlarut untuk mengadakan interaksi dengan
permukaan tadi. Jika zat padat adalah terbagi atau sangat berpori, atau dengan
kata lain zat mempunyai luas permukaan besar, maka besarnya adsorpsi akan
setara Sebagai contoh, jika suatu adsorben yang baik dimasukkan ke dalam bejana
yang berisi gas, penurunan tekanan sebagai akibat penarikan molekul gas pada
permukaan mudah diukur.
(Underwood, 1999)
Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai
berikut; (a) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam
cairan; (b) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada
permukaan padatan halus (adsorpsi=penyerapan); (c) kecenderungan molekul-
molekul komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion). Komponen yang
3

dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk
berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau
bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan
migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan
untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), penetapan kadar (analisis
kuantitatif), dan pemurnian suatu senyawa (pekerjaan preparatif).
Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan dengan kromatografi
kertas karena dapat digunakan teknik-teknik umum yang lebih banyak. Kerapkali,
noda tidak berwarna atau tidak berpendar jika dikenai sinar ultra violet dapat
ditampakkan dengan cara mendedahkan papan pengembang pada uap iod.
(Soebagio, 2000: 54)
Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada
afinitas kepolaran analite dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki
kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi
kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-
polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat
pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak
di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas
aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau
dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai
dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi
(misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.
Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati
yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan
sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi
oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi
tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke
bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer).
Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi
berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan
bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut.
(Sastrohamidjojo, 2005)
4

III. PROSEDUR PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Seperangkat alat gelas
Kertas saring whatmann
Plat TLC
Chamber
Pipa kepiler
Gunting
Seperangkat alat kromatografi gas
Seperangkat alat kromatografi kolom
Mistar
Pensil
Lumpang porselin
Pipet tetes
Corong pisah
3.1.2 Bahan
Butanol pa
Kristal iod
Sampel ekstrak daun
Kloroform
n-pentana
n-heptana
n-heksana
Asan nitrat
Anilin pialat
Etanol
Aseton
Kapas
Aseton dan natrium sulfat

5

3.2 Skema Kerja
3.2.1 Pemisahan dan Penentuan Karbohidrat dengan Kromatografi
Kertas



dicampurkan dengan perbandingan (4 : 1 : 5)
sebagai fasa gerak
disiapkan potongan kertas saring whatmann yang
telah dijenuhkan dengan uap air
disiapkan larutan sampel yang terdiri dari
beberapa macam karbohidrat
disiapkan pola larutan penyemprot (anilin pialat)
disiapakan larutan standar yang terdiri dari zat
murni untuk glukosa, fruktosa, maltose dan
amilum
disiapkan perangkat kromatografi kertas
diberi garis pada kertas +0,5 cm dari pingggir
ditotolkan 3-4 larutan standar pada garis tersebut
dimasukkan kertas dalam chumber berisi larutan
standar pada posisi tegak
dibiarkan beberapa lama sampai pelarut naik
diangkat kertas dan dikeringkan
disemprot zat penanda noda yang sesuai dengan
larutan standar
dihitung nilai Rf nya
diulangi kegiatan ini untuk semua larutan standar
dibandingkan nilai Rf untuk mengetahui
kandungan jenis karbohidrat



Butanol, asam asetat
dan air
HASIL
6

3.2.2 Pemisahan Komponen Penyusun Daun Bayam secara TLC
1. Penyiapan kolom


ditambahkan pada klem
dihilangkan gelembung pada kapas yang
ditempatkan pada kolom kering yang ditekan
sampai dasar kolom dengan pengaduk
ditambahkan pasir + 3 mm dari tinggi kapas



*Diperhatikan kolom harus berdiri tegak


dicampurkan dalam gelas kimia 100 mL
diaduk dengan spatel
dimasukkan ke dalam kolom secar perlahan
dipadatkan dengan mengetuk dinding kolom
dengan pensil
dibiarkan lapisan alumina turun
ditambahkan lagi pasir setinggi 5 mm di atas
alumina tersebut
ditambahkan eluen di atas lapisan pasir



*Perhatian!
- Jangan sampai eluen melewati batas
- Jangan ada gelembung udara dalam kolom
- Kolom jangan sampai kering
10 mL PE
HASIL
20 mL alumina dan 40 gr PE
HASIL
7

- Penambahan eluen dilakukan ekstra hati-hati dan perlahan
menggunakan pipet tetes serta zat dialirkan melalui dinding
kolom
2. Pengerjaan kolom kromatografi


dibiarkan turun dan ditampung di dalam gelas
Erlenmeyer 250 mL hingga permukaan pelarut
tepat diatas lapisan eter
ditambahkan 25 tetes zat yang telah diekstrak
(percobaan TLC)
dibuka kran hingga zat ini turun sebagian
ditambahkan 5 mL PE
dibiarkan mengalir melalui kolom dengan
membuka klem
ditambahkan eluen pertama (PE : CH
2
Cl
2
= 4:1)
dibuka klem dan dibiarkan pelarut turun
dipisahkan setiap fraksi yang berbeda warna ke
dalam tabung berbeda
dilakukan penambahan eluen (CH
2
Cl
2
: methanol
= 95 : 5)
diulangi prosedur hingga fraksi berbeda warna
diperoleh
diberi label pada tabung yang berisi fraksi








Pelarut
HASIL
8

3.2.3 Pemisahan Zat dengan Kromatografi Kolom


disiapkan
disiapkan pula campuran larutan sampel
diset alat GC sesuai dengan kondisi percobaan
digunakan syringe yang sesuai
diambil kromatigrafi untuk tiap-tiap senyawa
dibandingkan dengan kromatogram campuran
larutan standard dan kromatogram dari tiap
individu larutan standar



*Campuran standar = terdiri dari 5mL u-pentana, 10mL n-heksana,
dan 15 mL n-heptana
















Campuran standar
HASIL
9

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
V. KESIMPULAN
VI. DAFTAR PUSTAKA