Siti Adlina Panca Putri

1106069222
LTM Rekayasa Genetika

Kloning vektor tanaman
Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens
Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning.
Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang membawa plasmid berukuran
200 kb dan disebut plasmid Ti (tumor inducing atau penyebab tumor). Bakteri A. tumefaciens dapat
menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya padi.
Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti, yang disebut T-DNA, akan terintegrasi ke
dalamDNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak
terkendali. Akibatnya, akan terbentuk tumor atau crown gall.
Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat
mengintegrasikan gen tersebut ke dalamDNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan dieskpresikan
menggunakan sistemDNA tanaman.
Dalamprakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun,
ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi dengan DNA
tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalamsatu
sel bakteri A. tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya
dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E.coli. Selanjutnya,
plasmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalamsel A. tumefaciens yang
membawa plasmid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-
gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.
Gambar 1. Ti plasmid tanda panah menunjukan garis wilayah transfer kiri dan dan kanan . gen Onc
bertanggung jawab untuk transformasi pertumbuhan. Nos sebagai sintesis nopaline. Vir untuk
mentransfer T-DNA kedalamsel target

T-DNA diinduksi dalam menanggapi berbagai senyawa dalam eksudat dari tanaman yang
telah dilukai, senyawa ini meliputi acetosyringone, alpha-hydroxyacetosyringone dan
prekursor lignin, seperti coniferyl alkohol. T-DNA itu sendiri diapit oleh urutan berulang 25
pasangan basa, T-DNA mengandung sekelompok gen disebut sebagai gen onc yang
bertanggung jawab untuk oncogenicity T-DNA yang mana Mereka termasuk gen untuk
sintesis auksin dan sitokinin, yang merupakan pengatur tumbuh yang menyebabkan gangguan
pertumbuhan sel. Selain itu, T-DNA mengandung gen untuk enzim yang menghasilkan
konjugat asam amino yang tidak biasa, seperti nopaline dan octopine .Oleh karena itu, sel-sel
tumbuhan yang memiliki T-DNA dimasukkan dan akan tumbuh tidak terkendali dan akan
mensintesis opines. Opines diekskresikan oleh sel-sel tumbuhan (yang tidak dapat
menggunakan mereka sendiri). Agrobacterium, memiliki mekanisme yang sangat canggih
untuk menumbangkan fungsi sel normal.

Vektor
Prinsip dasar menggunakan Agrobacterium sebagai alat untuk manipulasi genetik tanaman
adalah untuk memasukkan DNA asing ke dalam T - DNA dari sel bakteri dan mengandalkan
bakteri untuk mentransfer DNA. selama kebutuhan protein disediakan oleh bakteri, T DNA
dapat ditransfer kedalam sel genom tumbuhan . akan tetapi, Ada dua kesulitan dengan hal
ini. Yang pertama adalah bahwa plasmid Ti terlalu besar untuk memanipulasi in vitro . Yang
kedua adalah bahwa T - DNA mengandung gen yang akan mengganggu pertumbuhan
tanaman yang telah ditransfer . Masalah-masalah ini diatasi dengan penggunaan sistem vektor
cointegrative . vektor cointegrative menggunakan vektor menengah kecil yang dapat
dimanipulasi dengan mudah dan membawa selectable marker . Gen yang diinginkan
dimasukkan ke dalamnya dan vektor intermediete rekombinan diperkenalkan ke dalam sel
Agrobacterium yang mengandung plasmid Ti . Vektor intermediet tidak mampu mereplikasi
dalam Agrobacterium , tapi bisa diperbanyak dengan rekombinasi penyisipan ke daerah T -
DNA dari plasmid Ti Agrobacterium . Kemudian mentransfer T - DNA ke tanaman penerima
. Untuk tanaman yang akan dimasukan,jika tidak memiliki pertumbuhan yang tidak normal
,diperlukan juga penonaktifan tempat Ti Plasmid, oleh inaktivasi satu atau lebih gen untuk
biosintesis zat pengatur tumbuh . Pendekatan ini agak rumit ,sehingga diperlukan
rekombinasi antara vektor integratif dan Ti plasmid in vivo dalam sel Agrobacterium .H al
Ini digantikan oleh penggunaan sistem vektor biner . hal Ini menggunakan plasmid kecil ,
vektor biner , yang dapat mudah dimanipulasi . pada sistem ini, Ti plasmid dan vektor yang
kecil melengkapi satu sama lain dalam sel A tumaficiens. T-DNA yang dibawa oleh vektor
kecil di pindahkan ke kromosom DNA tanaman dengan kode protein yang dibawa oleh Ti
plasmid


gambar 2. Sistemvektor biner . bagian Ti Plasmid mentransfer T-DNA dari vektor kecil ke host
genome.




Mentransfer ke dalam sel tanaman
Tahap berikutnya ialah mengatur Agrobacterium termodifikasi untuk menginfeksi sel-sel
tumbuhan dan transfer T-DNA ke dalamnya. Berbagai metode yang ada, dan yang optimal
bervariasi dari spesies ke spesies, metodenya ialah menanan Agrobacterium yang
mengandung vektor yang sesuai dan kemudian mentransfernya ke sebuah media yang cocok
untuk memilih untuk transformasi. Media ini berisi sistem seleksi tambahan antibiotik untuk
membunuh sel Agrobacterium sisa dan pengatur pertumbuhan tanaman untuk membantu
dalam regenerasi. Tanaman Utuh kemudian diregenerasi dengan teknik kultur jaringan.
Pendekatan digunakan secara luas dengan Arabidopsis. Dalam hal ini, tanaman dicelupkan
sebentar ke dalam Agrobacterium dan kemudian tumbuh .Benih-benih tersebut kemudian
berkecambah pada media selektif yang sesuai, dan bibit yang mampu tumbuh harus
mengandung DNA dari vektor biner. Dalam beberapa protokol, tanaman mengalami
perlakuan vakum yang biasa disebut infiltrasi vakum. Teknik lain untuk transfer DNA dari
Agrobacterium meliputi injeksi bakteri ke dalam jaringan tanaman dan inkubasi protoplas
dengan kultur bakteri yang diikuti oleh regenerasi tanaman dari protoplas.


Gambar 3. Transformasi kultur sel

Metode lain dari pemindahan DNA
Metode lain yaitu dengan menggunakan transformasi biolistic. dengan menggunakan sel-sel epidermis
utuh dari bawang merah sebagai target dan microprojectiles yng membawa RNA dari virus mosaik
tembakau atau DNA membangun pengkodean kloramfenikol asetiltransferase . Transformasi
langsung protoplas tanpa menggunakan Agrobacterium cukup mungkin dilakukan . Seleksi untuk
transforman dapat dilakukan dengan menggunakan selectable marker seperti yang digunakan
dalamtransformasi Agrobacterium . Namun, yang paling sulit pada aspek pendekatan ini adalah
regenerasi tanaman utuh dari protoplas.
Teknik lainnya ialah dengan menggunakan virus mosaik kembang kol ( CaMV ), injeksi langsung
DNA , fusi protoplas dengan liposomyang mengandung DNA , transformasi biolistic serbuk sari (
diikuti oleh penyerbukan dengan serbuk sari berubah ) dan injeksi DNA ke dalamserbuk sari
tabung .

Ekspresi transien
Sistemekspresi transien ialah Transformasi yang tidak stabil karena gene tertentu telah dilakukan atau
dimodifikasi. Selain itu, Ekspresi pada protoplas dapat berbeda dari ekspresi jaringan yang utuh.

Promotor dan selectable markers
Promotor yang sering digunakan ialah caMV, yang biasa disebut promotor 35s yang bertanggung
jawab untuk generasi transkripsi 35s dalamsel yang terinfeksi. caMV sangat aktif dan bertindak
sebagai nos promoter.walaupun gen nos bersifat prokariotik, dia dapat berfungsi dalamtanaman yang
mana dia akan mensintesis opine.
Untuk menghasilkan ekspresi dalambeberapa jaringan yang berbeda, sistem regulasi tetrasiklin dapat
digunakan
Untuk selectable marker, yang biasa digunakan ialah yang resisten terhadap kanamisin dan yang
berhubungan dengan antibiotik aminoglikosida. Kanamisin biasa digunakan pada tanaman dikotil
akan tetapi tanaman biji-bijian juga toleran untuk ini dan juga pada beberapa kasus, g418 dam
hygromisin seringkali digunakan


Gen pelapor
Reporter gen yang biasa digunakan ialah protein fluorescent seperti GFP dan warna fluorescense
lainnya. Sebelumnya, gen beta glucuronidase yang biasa digunakan sebelumGFP
Aplikasi
1. Resistansi herbisida
2. Resistansi virus
3. Resistansi serangga
4. Kontrol kematangan
5. Sterilitas jantan
6. Farmasi
Keterbatasan kloning dengan menggunakan plasmid agrobacterium
- A tumefaciens dan A rhizogenes hanya menginfeksi tanaman dikotil.
- adanya pemakaian mikroprojectile yang mana memasukan plasmid DNA secara langsung
kedalamembrio tanaman.














Daftar Pustaka
C. J. Howe . 2007. Gene Cloning andManipulation. New York. Cambridge University Press
http://140.128.142.86/yclclass/geneengineer/2004Sep/chap7.ppt.pdf (diakses pada tanggal 28
november 2013)
http://www.plantphysiol.org/content/145/4/1144 (diakses pada tanggal 28 november 2013)