PEMERIKSAAN DARAH

HENDRA WIJAYA

DAFTAR ISI

1. Penentuan Kadar Glukosa Darah ...............................................................

2. Penentuan Kadar Kolesterol Darah Metode Liebermann-Burchard ............

3. Penentuan Kadar Kreatinin Darah .............................................................

4. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah: Metode Sahli ..................................

5. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah: Metode Warna ...............................

6. Penetapan Nilai Hematokrit: Metode Wintrobe .........................................

7. Penetapan Nilai Hematokrit: Mikrometode ............................................... 10

8. Penetapan Laju Endapan Darah: Metode Wintrobe.................................... 11
9. Penetapan Laju Endapan Darah: Metode Westergren ................................ 12
10. Penentuan Kadar Kalsium Darah: Metode Clark & Collib ......................... 13
11. Penentuan Kadar Fosfor (P) Darah: Metode Briggs ................................... 14
12. Penentuan Konsentrasi Fosfor (P) Darah modifikasi.................................. 16

1. Penentuan Kadar Glukosa Darah

Prinsip:
Filtrat darah bebas protein yang mengandung gula direaksikan dengan
larutan kupritartrat dalam suasana basa. Ion kupri akan direduksi oleh gula
menjadi kupro dan mengendap sebagai Cu2O. Dengan menambahkan pereaksi
fosfomolibdat maka Cu2O akan melarut lagi dan warna larutan akan menjadi biru
tua, karena adanya oksida Mo. Ekstingsi dari larutan akan diukur pada panjang
gelombang 660 nm dengan spektrofotometer.

Dengan menggunakan hukum

Lambert Beer dapat ditentukan kadar gula dalam sampel.

kadar gula darah =

Asampel
As tan dar

C s tan dar

Pereaksi
Larutan kupritartrat alkalis
Larutan Fosfomolibdat
Larutan standar glukosa 0.1 dan 0.2 mg/ml
Larutan H2SO4 0.67 N
Larutan Na-wolframat 10%

Cara Kerja

Pipet 1 ml darah ke dalam Erlenmeyer kecil, tambahkan 7 ml akuades, 1

ml Na-wolframat 10%, dan 1 ml H2SO4 0,67 N (tetes demi tetes).

Campurkan baik-baik, biarkan 10 menit saring dengan kertas saring dan

siapkan 3 tabung Folin Wu.

Isilah ketiga tabung tersebut dengan campuran sebagai berikut:

No

Bahan

Tabung a

Tabung b

Tabung c

Filtrat

1 mL

Standar glukosa

1 mL

Akuades

1 mL

Kupritartrat

1 mL

1 mL

1 mL

Panaskan ketiga tabung dalam air mendidih selama 8 menit tepat

Kemudian dinginkan, encerkan dengan 7 ml akuades

Kemudian tambahkan 1 ml fosfbmolibdat pada setiap tabung

Baca intensitas warnanya pada panjang gelombang = 660 nm

2. Penentuan Kadar Kolesterol Darah

Metode Liebermann-Burchard

Uji lipid darah yang paling sering dilakukan ialah uji terhadap kolesterol
total, triasilgliserol (trigliserida), dan kolesterol HDL. Konsentrasi kolesterol LDL
biasanya diperoleh melalui perhitungan. Konsentrasi kolesterol darah yang
meningkat adalah salah satu faktor yang meningkatkan risiko terjadinya
aterosklerosis, yaitu terbentuknya plak aterosklerosis yang mengandung ester
kolesterol dan kalsium pada dinding arteri, dan infark otot jantung (myocardial
infarct,Mi).

Risiko tersebut akan makin meningkat bila

disertai oleh

meningkatnya konsentrasi trigliserida darah, faktor risiko yang lain ialah: tekanan
darah tinggi (hipertensi), kegemukan (obesitas), merokok, perilaku tipe A, dan
kurang olahraga. Konsentrasi kolesterol dan trigliserida darah yang tinggi dapat
diturunkan melalui pengelolaan pola makan yang rendah lemak dan rendah
kolesterol. Namun pada kasus yang cukup berat tetap harus dibarengi dengan
pemberian obat penurun kadar kolesterol darah.

Prinsip: Kolesterol di dalam ekstrak kloroform akan bereaksi dengan asam asetat
anhdrida dan asam sulfat pekat memberikan reaksi warna serapannya dapat
diukur dengan spektrofotometer.

Pereaksi: larutan alkohol:eter (3:1), H2SO4 pekat, asam asetat anhidrida, standar
kolesterol 0.4 mg/mL, kloroform

Cara Kerja:
1. Masukkan 12 mL campuran alkohol eter ke dalam tabung sentrifus 15 ml
2. Ambil 0.2mL serum/plasma darah dan masukkan ke dalam campuran tadi
dengan perlahan-lahan.
3. Tutup tabung rapat-rapat dan kocoklah baik-baik (bila ada, dengan Vortex)
selama 1 menit; diamkan selama 30 menit.
4. Sentrifus selama 3 menit, gunakan sentrifus klinis (kecepatan rendah).

5. Lakukan dekantasi: tuang supernatan ke dalam gelas piala 50 mL, uapkan

supernatan di dalam penangas air mendidih hingga mengering.
6. Ekstraksi residu dengan kloroform 2 kali: gunakan 2-2.5 mL kloroform
tiap kali ekstraksi, kocok perlahan dan tuangkan ekstrak ke dalam tabung
berskala.
7. Cukupkan volume hingga 5 mL dengan menambahkan kloroform.
8. Siapkan 3 tabung reaksi dan isilah dengan larutan sebagai berikut.
Bahan

5 mL

Standar

5 mL

Kloroform

5 mL

2 mL

2 mL

2 mL

0.1 mL

0.1 mL

0.1 mL

Ekstrak kloroform

As.asetat anhdrida
H2SO4 pekat

9. Kocok tiap tabung, simpan di ruang gelap selama 15 menit

10. Ukur serapannya pada =420 nm

3. Penentuan Kadar Kreatinin Darah

Bila terjadi gangguan pembentukan air kemih atau bahkan sama sekali
tidak dapat dikeluarkan, akan terjadi peningkatan beberapa senyawa yang terdapat
di dalam plasma darah. Umumnya senyawa itu berupa molekul berukuran kecil
dan mengandung nitrogen dan lazim disebut 'unsur-unsur nitrogen nonprotein'
plasma atau serum darah. Adapun unsur nitrogen nonprotein yang mungkin
meningkat kadarnya pada gangguan fungsi atau penyakit ginjal, terutama ialah
yang berasal dari urea dan kreatinin, dan kadang-kadang asam urat. Dalam hal ini
asam urat bukan menjadi dasar penentuan primer diagnosis gangguan fungsi
ginjal. Demikian pula nitrogen dari urea (N-urea) di dalam darah sesungguhnya
kadarnya dipengaruhi oleh hal-hal yang tidak terkait dengan fungs ginjal atau
ekskresi air kemih melainkan oleh laju katabolisme protein. Konsumsi makanan
berprotein tinggi atau pengaruh homon steoid adrenal akan meningkatkan laju
katabolisme protein sehingga akan meningkatkan kadar ureum dalam darah.
Petunjuk yang lebih tepat bagi fungsi ginjal justru pengukuran kadar kreatinin
darah.
Kreatinin merupakan senyawa buangan yang terbentuk di dalam jaringan
otot ketika senyawa energi tinggi kreatin fosfat (fosfokreatin) bereaksi dengan
ADP membentuk kreatin dan ATP, sebagian kecil kreatin fosfat akan kehilangan
fosfatnya dan membentuk kreatinin. Kreatinin dibuang melalui air kemih dan
jumlah yang dibuang setiap harinya tidak dipengaruhi oleh menu makanan, umur,
jenis kelamin, atau latihan fisik. Kreatinin yang muncul pada filtrat glomerulus
tidak akan diserap baik oleh tubula ginjal, sehingga semua kondisi yang
menurunkan laju filtrasi glomerulus akan mengakibatkan berkurangnya ekskresi
kreatinin keluar tubuh dan mengakibatkan peningkatan jumlahnya di dalam darah.

Prinsip : Setelah protein darah diendapkan, filtrat yang mengandung kreatinin

bereaksi dengan larutan asam pikrat basa membentuk warna kemerahan. Reaksi
ini disebut rekasi Jaffe dan tidak khas untuk kreatinin; akan tetapi 80-90% warna
yang hasilkan dalam reaksi ini disebabkan oleh adanya kreatinin. Senyawa

nonkreatinin lain yang bereaksi menghasilkan warna yang sama dengan pikrat
basa antara lain: Keton, glukosa dan asam karbonat.

Pereaksi: asam pikrat jenuh, NaOH 10%, kreatinin standar 0.005 mg/mL.
Campurkan 15 mL asam pikrat jenuh dengan 3 mL NaOH 10% untuk membuat
asam pikrat basa. Dibuat 15 menit sebelum dipakai.

Cara Kerja:
1. Siapkan serum/plasma bebas protein (filtrat Folin Wu) sebagai berikut:
Bahan

Jumlah

Air bebas ion

14 mL

H2S04 2/3 N

2 mL

Na-wolframat 10%

2 mL

Darah

2 mL

Campurlah baik-baik lalu saring: filtrat yangdiperoleh adalah contoh yang

akan diperiksa kadar kreatininya (Anu).
2. Kerjakan dalam 3 tabung kimia masing-masing untuk Anu (A). Standar (S)
dan Blanko (B) sebagai berikut:

Bahan

5 mL

Standar

5 mL

Air bebas ion

5 mL

2.5 mL

2.5 mL

2.5 mL

Filtrat

Asam pikrat basa

Campur baik-baik; biarkan selama 20 menit, lalu baca pada =540 nm.
Kadar Kreatinin dalam contoh A = RA/RS

4. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah

Metode Sahli

Tujuan: menentukan kadar hemoglobin dalam darah menurut metode Sahli.

Bahan dan alat:

Standar warna, HC1 0,1 N, aquadest, alkohol 70 %. lanset jarum tusuk "Franke"
hemoglobinometer Sahli yang terdiri dari : pipet Sahli dan penyedotnya, tabung Sahli
dan pengocok.

Cara kerja:
1. Isi tabung Sahli dengan larutan HC1 0,1 N sampai angka 10 dalam tabung.
2. Tusuk ujung jari yang sudah dicuci dengan alkohol 70 %, kemudian isap darah
melalui pipet Sahli sampai batas garis 20 mm3
3. Bersihkan pipet, kemudian segera masukkan darah ke dalam tabung Sahli, biarkan
selama 3 menit agar terbentuk hematin asam yang berwarna coklat.
4. Tambahkan akuades tetes demi tetes sambil diaduk, sampai warnanya sama dengan
standar (yang ada di sebelah kiri dan kanan tabung)
5. Baca tinggi permukaan cairan pada tabung Sahli. Pembacaan langsung dengan
melihat pada jalur gr % yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml
darah. Jalur laimiya pada tabung Sahli (bila ada), menunjukkan % hemoglobin yang
dihitung dibandingkan dengan hemoglobin normal (tabungnormal dipakai 15,6 gr
%).

5. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah

Metode Warna

Tujuan : menentukan kadar hemoglobin dalam darah menurut metode warna

Prinsip : Hemoglobin + sianida + Ferrisianida --------------- Sianomethamoglobin
Prosedur:
Panjang gelombang

: 520-560 nm

Spektrofotometer

: 546 nm

Kuvet

: Diameter dalam 1 cm

Suhu inkubasi

: 20 - 25 C (suhu kamar)

Pengukuran terhadap akuades

Pipetkan ke dalam tabung reaksi:
Larutan 3 %

: 5 ml

Darah

: 0,02 ml

Pipet dibersihkan dengan cara beberapa kali menyedot dan mengeluarkan. Larutan
dicampur dengan baik dan diinkubasi pada suhu 20 - 25c C paling cepet setelah 3 menit
dan paling lambat setelah 24 jam ekstinsi sample diukur terhadap akuades.
Konsentrasi Hemoglobin dalam darah dapat dihitung dengan rumus :
C= 36.77 x E (g/l00 ml) atau
C= 22.82 x E (mmol/L) (Hb/4)

6. Penetapan Nilai Hematokrit

Metode Wintrobe

Nilai hematokrit ialah voluma semua eritrosit dalam 100 ml darah dan disebut dengan
% dari voluma darah itu. Biasanya nilai itu ditentukan dengan darah vena atau darah
kapiler.

1. Isilah tabung Wintrobe dengan darah Oxalat, heparin atau EDTA sampai garis tanda
100 di atas.
2. Masukkanlah tabung itu ke dalam sentrifuge yang cukup besar, pusinglah selama 30
menit pada kecepatan 3000 rpm.
3. Bacalah hasil penetapan itu dengan memperhatikan:
a. Warna plasma diatas: warna kuning itu dapat dibandingkan dengan larutan
kaliumbichromat dan intensitasnya disebut dengan satuan. Satu satuan sesuai
dengan warna kaliumbichromat 1:10000.
b. Tebalnya lapisan putih di atas sel-sel merah yang tersusun dari leukosit dan
trombosit (buffy coat).
c. Voluma sel-sel darah merah.

7. Penetapan Nilai Hematokrit

Mikrometode

1. Isilah tabung mikrokapiler yang khusus dibuat untuk penetapan mikrohematokrit

dengan darah.
2. Tutuplah ujung satu dengan nyala api atau dengan bahan penutup khusus.
3. Masukkanlah tabung kapiler itu ke dalam sentrifuge khusus yang mencapai
kecepatan besar, yaitu lebih dari 16 000 rpm (sentrifuge mikrohematokrit).
4. Pusinglah selama 3 - 5 menit.
5. Bacalah nilai hematokrit dengan menggunakan grafik atau alat khusus.
Catatan
Padatnya kolom eritrosit yang didapat dengan memusing darah ditentukan oleh
faktor: radius sentrifuge, kecepatan sentrifuge dan lamanya pemusingan. Dalam
sentrifuge yang cukup besar, dengan memakai makrometode dicapai kekuatan
pelantingan (relative centrifugal force) sebesar 2 260 g. Untuk memadatkan sel-sel
merah dengan memakai sentrifuge itu diperlukan rata-rata 30 menit.

10

8. Penetapan Laju Endapan Darah

Metode Wintrobe

1. Dengan memakai pipet Wintrobe, masukkan darah oxalate atau darah EDTA
kedalam tabung Wintrobe setinggi garis tanda 0 mm. Jagalah jangan sampai
terjadi gelembung atau busa
2. Biarkan tabung Wintrobe dalam posisi tegak lurus pada satu tempat yang tak
banyak angin selama 60 menit
3. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan millimeter dan laporkanlah angka itu
sebagai laju endap darah.

11

9. Penetapan Laju Endapan Darah

Metode Westergren

1. Ambillah secara akseptis 0,4 ml larutan Natriumsitrat 3,8% steril

2. Ambillah darah sebanyak 1,6 mL dan dicampurkan dengan larutan Natriumsitrat
dalam tabung sehingga diperoleh 2 mL larutan.
3. Isaplah darah itu kedalam pipet Westergen sampai garis bertanda 0 mm
kemudian biarkan pipet itu dalam posisi tegak

lurus dalam rak Westergen

selama 60 menit
4. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan millimeter dan laporkan hasilnya
sebagai laju endap darah.

12

10. Penentuan Kadar Kalsium Darah

Metode Clark & Collib

Prinsip : Kalsium diendapkan langsung dari plasma/serum dengan amonium oksalat

membentuk endapan kalsium-oksalat.

Endapan dicuci dengan amonia encer lalu

dititrasi menggunakan kalium permanganat.

Pereaksi: amonium oksalat 4%, amonia 25%, asam sulfat 1N, kalium permanganat 0,01
N setara dengan 0,2 mg Ca

Cara Kerja:
1. Siapkan dua buah tabung sentrifus untuk blanko (B) dan sampel Anu (A)
sebagai berikut:
Bahan

Blanko

2 mL

Akuadest

4 mL

2 mL

Amonium oksalat

1 mL

1 mL

Serum

2. Aduk pakai pengaduk kecil hingga terbentuk endapan.

3. Biarkan selama 30 menit.
4. Sentrifus tabung tersebut selama 5 menit pada kecepatan rendah (1500 rpm).
5. Buang cairan dan letakkan tabung terbalik di atas kertas saring selama 10 menit;
keringkan cairan di mulut tabung dengan kertas saring
6. Masing-masng tabung ditambahkan ammonia 2% sebanyak 3 mL. lalu aduk dan
kocok setelah itu disentrifuse lagi. Kegiatan tersebut dilakukan 2 kali seperti
diatas.
7. Masing-masing tabung ditambahkan dengan H2SO4 1N sebanyak 2 ml. Aduk
dengan pengaduk sampai endapan larut dan masukkan ke dalam penangas air
70C lalu titrasi dengan KMnO4 sampai titik akhir larutan berwarna merah jambu
8. Kadar kalsium normal dalam darah: 8.10-10.40 (mg/100 mL).
Perhitungan:
Kadar Ca = (A-B) x 0,2 x 100/2 mg% = (A-B) x 10 mg %

13

11. Penentuan Kadar Fosfor (P) Darah

Metode Briggs

Prinsip : Protein diendapkan terlebih dahulu dengan larutan TCA. Filtrat yang
diperoleh akan memiliki pH rendah sehingga reaksinya dengan asam molibdat
membentuk senyawa kompleks. Kompleks ini kemudian direduksi oleh larutan
hidrokuinon membentuk warna biru. Untuk menstabilkan warna digunakan Na-tiosulfat
20%. Serapan diukur dengan spektrofotometer

Pereaksi: asam molibdat, TCA 20%, Na-tiosulfat 20%, hidrokuinon 0,5%,

Fosforstandar 0,01 mg/mL

Cara Kerja:
1. Siapkan filtrat yang akan dianalisis dalam tabung kimia sebagai berikut:

Bahan

Jumlah

Serum

2mL

Akuades

6 mL

TCA 20%

2 mL

2. Aduk hati-hati dan biarkan selama 10 menit.

3. Saring memakai kertas saring kering; selanjutnya filtrat dikerjakan sebagai
berikut:
Bahan

Anu

Standar

Blanko

5 mL

Standar P

3 mL

Molibdat

2 mL

2 mL

2 mL

Hidrokuinon

1 mL

1 mL

1 mL

Na-tiosulfat 20%

1 mL

1 mL

1 mL

Akuades

1 mL

3 mL

6 mL

Filtrat

14

4. Campur baik-baik dengan cara membolak-balik tabung yang mulutnya ditutup

dengan kertas plastik bersih.
5. Simpan dalam ruang gelap selama 30 menit.
6. Bacalah dengan spektrometer

15

12. Penentuan Konsentrasi Fosfor (P) Darah modifikasi

Pereaksi: asam molibdovanadat, TCA 5%, HCI 5M, Fosfor standar 1 mg/mL

Cara Kerja:
1. Siapkan reagen campuran yang terdiri atas satu bagian volume larutan
molibdovanadat dan satu bagian volume HCI 5M.
2. Siapkan larutan fosfor standar dalam beberapa konsentrasi, dari10 - 200 g per mL.
3. Siapkan filtrat yang akan dianalisis sebagai berikut:
Pipet 1 ml serum, lalu tambahkan 4 mL TCA 5% dan segera kocok dengan
menggunakan Vortex dan lanjutkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit Ambil supematan dengan pipet sebanyak 2 mL.
4. Selanjutnya kerjakan filtrat dan larutan standar sebagai benkut:

Bahan

Anu

Syandar

Blanko

2 mL

Standar P

2 mL

Akuades

6 mL

6 mL

8 mL

Fitrat

Kocoklah setiap tabung segera setelah ditambahkan

Reagen campuran

2 mL

2 mL

5. Bacalah pada panjang gelombang 400nm

16

2 mL