ENZIM POLIGALAKTURONASE

PADA BUAH TOMAT MATANG

Oleh :
Anggia Rose S.

(101810301004)

Fani Atrica S.

(101810301007)

Agita Raka P.

(101810301013)

Luluk Masnia

(101810301032)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2012

I.

Tujuan:
- Mengisolasienzim poligalakturonase padabuah tomat matang
- Mengkarakterisasienzim poligalakturonase padabuah tomat matang

II. Dasar Teori

Pektin seperti selulosa merupakan salah satu polisakarida penyusun
dinding sel pada tumbuhan tingkat tinggi. Rantai dasar dari pektin terdiri atas
residu asam 1,4 alfa-D-galakturonat yang sebagian teresterifikasi ( lebih dari 75%)
dengan metanol. Residu rhamnose dihubungkan dengan residu D-galakturonat
melalui ikatan beta 1,2 dan alfa 1,4. Beberapa residu galakturonase juga
mengalami asetilasi (~ 5%) pada posisi C-2 dan C-3.

Poligalakturonase adalah kelompok enzim yang mendepolimersasi asam

pektin dengan memutus ikatan glikosida melalui reaksi hidrolisis. Enzim ini
tesusun sekitar 376 asam amino. Membentuk struktur 10 beta-heliks paralel
dimana sisi aktifnya pada paralel beta-sheet satu pada strands ke 4,5,6,7 dan 8
pada E carotovora sp.

Enzim ini mempunyai sisi aktif berupa asam amino Aspartat, Histidin, Glutamat,
Lisin, Arginin, dan Treonin.
O
O
O

H2N
H2N

H2N

CH

CH

OH

CH

OH

CH2
CH2

CH2
C

CH2
O

OH

Asam Aspartat

N
NH

Histidin

OH

Asam Glutamat

OH

O
H2N

O
H2N

CH

CH

OH

CH2

OH

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

NH

CH2

NH2

NH2

Lisin

Arginin

O
H2N
NH

CH

CH

OH

OH

CH3

Treonin

Sisi katalitik dari enzim poligalakturonase adalah asam amino Histidin dan
Asam Aspartat. Enzim Poligalakturonase melibatkan 2 Asam Aspartat pada sisi
katalitiknya dimana satu bertindak sebagai donor proton sedangkan satunya
tersedia sebagai nukleofil. Menurut hasil analisi kristalografi X-ray pada sisi
katalitik enzim PG, asam amino histidin bertindak sebagai donor proton dalam
reaksi pemutusan ikatan glikosida.

Berikut mekanisme dari enzim poligalakturonase :

Memposisikan sisi aktif dari enzim poligalakturonase yakni asam amino

Asam Aspartat201 diwakili oleh gugus karboksilatnya dan asam amino Histidin 223
diwakili gugus aminanya pada daerah yang bisa dijangkau oleh ikatan glikosida
pektin. NTD adalah daerah yang terdiri dari asam amino Threonin45 yang akan
membentuk ikatan hidrogen dengan uracil pada subtrat. RIK adalah daerah enzim
yang terdiri dari asam amino Arginin dan Lisin yang akan mengikat erat daerah
ikatan glikosida yang akan diputus dengan interaksi ikatan hidrogen. NTD dan
RIK layaknya bertindak seperti dua tangan yang memegang substrat yang
menghasilkan tegangan dan distorsi yang dibutuhkan subtrat dalam hidrolisis
ikatan glikosida nantinya.

Terjadi transfer proton dari asam amino Histidin223 ke ikatan glikosida diikuti
transfer elektron dari gugus karboksilat Asam Aspartat201.

Ikatan glikosida terputus dengan dihasilkannya produk pertama dan secara

simultan membentuk ikatan kovalen antara subtrat dengan sisi katalitik Asam
Aspartat201.

Sisi katalitik lainya yaitu residu asam Aspartat 202 memposisikan molekul air
untuk melakukan serangan nukleofil. Serangan tersebut menghasilkan produk
kedua dan pemulihan sisi aktif dari enzim.
Enzim poligalakturonase terdapat di daging buah tomat matang tepatnya di
dalam sel. Berdasarkan letak enzim, enzim poligalakturonase termasuk kelompok
endo. Enzim poligalakturonase diproduksi mulai dari proses pematangan buah
tomat. Enzim poligalakturonase berfungsi mengkatalis proses perusakan dinding
sel dengan cara memutuskan ikatan glikosida dari polisakarida penyusun dinding
sel.
Protein katalitik poligalakturonase diproduksi selama pematangan buah
tomat (Bird et al, 1988). Enzim poligalakturonase aktif pada saat proses
pematangan (Dellapenna et al, 1989). Meskipun hanya satu jenis polipeptida
enzim poligalakturonase yang dihasilkan, dua isoenzim poligalakturonase
sebagian besar diekstrak dari dinding sel buat tomat matang. Enzim
poligalakturonase 1 dan 2 mampu mendegradasi dinding sel pektin secara in vitro

( Pressey and Avants, 1973; Tucker et al., 1980). Enzim poligalakturonase stabil
pada pH 4,5 5,6 dengan pH optimum 5,5. Suhu optimum dari enzim ini adalah
42 oC.
Enzim poligalakturonase terlibat pada proses pelunakan di beberapa buah
seperti tomat, persik, pear, alpukat dan mangga. Enzim ini termasuk dalam enzim
hidrolase. Enzim ini terdiri dari dua enzim yakni ekso poligalakturonase (ekso
PG) dan endo poligalakturonase (endo PG) (Ghazahl, HM and Leong,CK (1987)
FoodChem 24147).
Bahan yang akan digunakan untuk praktikum adalah buah tomat yang
tingkat kematangannya sempurna. Hal ini dicirikan dengan warna buah tomat
agak kemerah-merahan dan teksturnya tidak terlalu lunak. Oleh karena itu perlu
dilakukan persiapan penyediaan bahan.
III.

Metodologi Percobaan

3.1 Alat
3.2 Bahan

Neraca Analitik
Blender
Pisau
Labu Ukur 100 mL
Gelas Ukur 100 mL
Beaker Glass 150 mL
Sentrifuge
Tabung Sentrifuge
Pipet Mohr 10 mL
Pipet Tetes
Erlenmeyer 150 mL
Termometer
pH meter
Penangas
Botol Semprot
Batang Pengaduk
Spatula
Oven
Stopwatch
Spektrofotometer UV-Vis1 unit
Komputer

1 buah
2 buah
4 buah
10 buah
2 buah
3 buah
2 buah

1 buah

1 unit

Buah Tomat Matang

Ammonium Sulfat
Larutan NaCl 5%
Aquades
Aquademin
Larutan Buffer Tris-HCl
Larutan buffer 4
Larutan buffer 5
Larutan buffer 6
Larutan HCl 1%
Larutan PP
Alkohol 95%
Larutan HCl pekat

3.3 Metode Percobaan

Metode

percobaan

yang

dilakukan

pada

praktikum

enzim

poligalakturonase ini antara lain:

a. Penyiapan bahan
b. Penyiapan dan perlakuan sampel
c. Pemisahan enzim
d. Ektraksi sampel
e. Pengujian enzim
a. Penyiapan bahan
1. Pemilihan bahan
Buah tomat yang dipilih adalah buah tomat yang matang dengan tanda
kulit dan daging buahnyakemerah-merahan serta teksturnya tidak
terlalu lunak.
2. Membuat larutan 600 mL NaCl 5%. Selanjutnya diletakkan dalam
lemari es.
3. Membuat 500 ml larutan buffer Tris-HCL.
a. Pengenceran Tris
-

Ditimbang 0,6 gr Tris lalu dimasukkan ke dalam beker glass.

Diencerkan menjadi 50 mL dengan aquades.

b. Pengenceran HCl
-

Diambil 1,98 mL HCl 12,6 M.

dimasukkan ke dalam beker glass.

Diencerkan menjadi 250 mL dengan aquades.

c. Pembuatan Buffer
-

Dimasukkan larutan Tris yang sudah dibuat sebelumnya ke

dalam beker glass.

Ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai menunjukkan

pH yang diinginkan yaitu pH 4, 5 dan 6.

b. Penyiapan sampel dan perlakuan sampel

1. Buah tomat dibelah dan dikeluarkan isinya
2. Diambil daging buah tomat dengan ukuran tinggi x panjang x tebal =
4 x 8 x 0,5 cm dan diambil 150 gr.
3. Daging buah dipotongkecil dan ditambahkan larutan NaCl 5% dingin
dengan perbandingan (1:9) kemudian diblender sampai mencair dan
halus. Proses ini perlu dijaga jangan sampai suhu meningkat diatas
10oC.
4. Cairan hasil blender, didiamkan sampai terbentuk dua fase (bagian
endapan dan larutan).
5. Larutan dari slory di sentrifuse kecepatan max 4000 rpm selama max
20 menit.
c. Pemisahan enzim
1. Pemisahan enzim berdasarkan BM
Pemisahan enzim didasarkan BM yang mengendap dalam medium
amonium sulfat.
2. Pemisahan enzim dalam medium (NH4)2SO4 18%, dilakukan dengan
cara sentrifugasi supernatan (kecepatan 8000rpm selama20 menit).
3. Pelet 1 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCl.
4. Supernatan 1 dipindahkan kedalam tabung dan ditambah lagi
(NH4)2SO4 menjadi 28% kemudian disentrifugasi kembali (kecepatan
8000rpm selama 20 menit).
5. Pelet 2 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCL.
d. Isolasi Pektin
1. Preparasi
Tomat dicuci sampai bersih dan dikeluarkan isinya.
Tomat dipotong kecil-kecil.
Tomat tersebut diblender dengan sedikit air agar cepat halus.
Hasil blender dioven hingga kadar airnya konstan dan enzimnya
menjadi tidak aktif lagi.

2. Ekstraksi pektin
Bahan hasil pengovenan diberi aquades hingga menjadi encer

dengan diaduk.
Ditambahkan larutan HCl 1% hingga pH menjadi 1,5.
Dipanaskan sampai 70-80 oC sambil diaduk selama 1 jam.
Disaring untuk memisahkan filtratnya. Filtrat tersebut adalah

filtrat pektin.
Dipanaskan filtrat pektin pada suhu 95-97 oC sambil diaduk
hingga volumenya menjadi setengah volume semula. Hasilnya

disebut filtrat pekat.

Filtrat pekat tersebut didinginkan.
3. Pengendapan pektin
Dibuat larutan alkohol asam dari larutan etanol 95% yang

ditambah dengan larutan 2 mL HCl pekat.

Filtrat pektin pekat ditambahkan dengan alkohol asam sambil
diaduk sampai merata. Setiap 100 mL filtrat pektin ditambahkan

150 mL alkohol asam.

Filtrat kemudian didiamkan selama 10-14 jam (semalam).
Dipisahkan endapan pektin dari filtrat dengan menggunakan

kertas saring. Hasilnya disebut endapan pektin.

Endapan pektin dilarutkan dalam aquademin.

e. PengujianEnzim
1. Dasar pengujian E + S
ES
Enzim yang akan diuji adalah enzim poligalakturonase dengan
substrat. Grafik enzim tanpa subtrat akan diperoleh titik yang tinggi,
setelah ditambahkan substrat maka absorbansi akan menurun karena
enzim akan berikatan membentuk kompleks ES. Pada keadaan
tertentu grafik absorbansi akan kembali meningkat karena lepasnya
kompleks ES. Peningkatan absorbansi tidak akan sama seperti awal
pengukuran, hal ini dimungkinkan masih ada ikatan antara enzim
dengan substrat.
2. Persiapan pengujianenzim
- Mengencerkan pellet 1 dan 2 yang telah diperoleh sebanyak
larutan sampel enzim yang dibutuhkan.
- pH
i. pH : < pH 4, larutan enzim 2 mL

ii. pH : = 5, larutan enzim 2 mL

iii. pH : >6, larutan enzim 2mL
Jumlah larutan enzim yang dibutuhkan = 6 mL pelet 1 dan 6 mL pelet 2
3. Persiapan alat
- Digunakan spektrometer UV-Vis yang dihubungkan dengan
komputer dengan software khusus.
- Dinyalakan spektrometer
- Diatur panjang gelombang 290 nm.
4. Pengujian enzim
- Dimasukkan larutan enzim sebanyak 2 mL ke dalam kuvet.
- Dimasukkan buffer pH 4 (5 atau 6 secara bergantian) sebanyak
-

0,5 mL
Diletakkan dalam spektrometri
Diukur absorbansinya setiap 3 detiak hingga absorbansi konstan
Dihidupkan stopwatch ketika substrat dimasukkan dan dijalankan

kembali program.
Dihentikan stopwatch dan program ketika diperoleh grafik

absorbansi yang konstan.

Diperoleh nilai Km
Ditambahkan substrat sebanyak 0,5 mL kedalam larutan enzim

dan pH
Kemudian diukur kembali absorbansinya hingga konstan
Diperoleh perbedaan absorbansi pada enzim tanpa substrat dan
enzim dengan substrat

SOP Spektrometri
Adapun prosedur yang dapat dijalani dalam pemakaian Spektrofotometer UVVisible antara lain:
1. Hubungi Teknisi untuk minta ijin pemakaian Spektrofotometer UV-Visible
2. Mengisi buku penggunaan Spektrofotometer Uv-Visible
3. Membaca prosedur penggunaan
4. Siapkan kuvet 1,5 ml
5. Masukkan sampel ke dalam kuvet dengan menggunakan pipet
6. Dalam kuvet tersebut terlihat dua buah sisi yang berbentuk gerigi,
sedangkan dua sisi yang lain tumpul
7. Ketika ingin membawa kuvet, pegang pada sisi yang bergerigi

8. Nyalakan spektrofotometer, pastikan alat telah terhubung dengan sumber

listrik (stop kontak)
9. Lakukan

kalibrasi

spektrofotometer

dengan

menggunakan

larutan

blank (Blanking spektrofotometer)

10. Ubah skala spektrofotometer ke dalam satuan nanometer
11. Setting ke dalam 390 nanometer
12. Ubah lagi skala spektrofotometer ke dalam absorbansi
13. Masukkan kuvet berisi air ke dalam spektrofotometer
14. Pastikan sisi yang mulus menghadap ke depan dan sisi yang bergerigi
berada di samping
15. Tekan tombol nol pada spektrofotometer
16. Untuk menganalisis sampel dimulai dengan letakkan sampel ke dalam
spektrofotometer
17. Pastikan sisi mulus menghadap ke depan dan bergerigi menghadap ke
samping
18. Catat hasil yang keluar
19. Buat data dalam bentuk kurva kalibrasi dan absorban sampel yang diplot
lewat konsentrasi
20. Tekan tombol off untuk mematikan spektrofotometer

V.

Cara membuktikan:

150 gram Daging Buah Tomat Matang

Diiris
Ditambah larutan NaCl 5%
Diblender
Didiamkan
Disentrifuse

Supernatan

Pelet

Ditambahkan Ammonium sulfat 18%

Disentrifuse
Supernatan 1

Pelet 1
Ditambahkan Amonium Sulfat 28%
DisentrifuseDicuci dengan menambahkan larutan buffer Tris-HCl
Uji Spektrometri

Pelet 2

Supernatan 2

Dicuci dengan menambahkan larutan buffer Tris-HCl

Uji Spektrometri
Diuji aktivitas

NB :

Masing-masing residu dan supernatan di uji biuret

Variasi pH

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 4
t (s)
3

A
0,946

0,933

9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48

t (s)

t (s)

t (s)

t (s)

51

0,903

99

0,884

147

0,884

195

54

0,901

102

0,881

150

57

0,896

105

0,895

153

60

0,900

108

0,890

156

63

0,895

111

0,885

159

66

0,900

114

0,874

162

69

0,896

117

0,877

165

72

0,883

120

0,879

168

75

0,891

123

0,879

171

78

0,888

126

0,880

174

81

0,890

129

0,883

177

84

0,887

132

0,881

180

87

0,884

135

0,880

183

90

0,885

138

0,880

186

93

0,887

141

0,884

189

96

0,888

144

0,885

192

0,918
0,899
0,895
0,900
0,894
0,897
0,891
0,897
0,912
0,920
0,927
0,921
0,911
0,905

0,883
0,884
0,886
0,900
0,904
0,899
0,893
0,891
0,888
0,890
0,900
0,912
0,891
0,876
0,877

198
201
204
207
210
213
216
219
222
225
228
231
234
237
240

A
0,87
1
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,88
8
0,87
1

4.1.2 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 4 dan substrat

t (s)
A
t (s)
A
t (s)
A
t (s)
A
t (s)
A
0,767
0,771
0,763
0,774
0,74
240
288
336
384
432
9

243
246
249
252
255
258
261
264
267
270
273
276
279
282

0,77
0,779
0,785
0,783
0,785
0,783
0,779
0,779
0,78
0,785
0,786
0,785
0,784
0,768

291
294
297
300
303
306
309
312
315
318
321
324
327
330

0,774
0,779
0,78
0,776
0,785
0,783
0,779
0,782
0,778
0,769
0,769
0,761
0,753
0,752

339
342
345
348
351
354
357
360
363
366
369
372
375
378

0,764
0,762
0,771
0,78
0,78
0,776
0,769
0,773
0,774
0,77
0,765
0,771
0,77
0,763

387
390
393
396
399
402
405
408
411
414
417
420
423
425

0,793
0,796
0,804
0,81
0,81
0,819
0,815
0,8
0,773
0,768
0,765
0,757
0,751
0,749

435
438
441
444
447
450
453
456
459
462
465
468
471
474

0,758 381 0,762 428

0,749
285 0,771
333
4.1.3 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 5
t (s)
A
t (s)
A
t (s)
A
3
0,809
39
0,827
75
0,824
6
0,792
42
0,826
78
0,824
9
0,795
45
0,818
81
0,824
12
0,807
48
0,819
84
0,824
15
0,822
51
0,820
87
0,824
18
0,817
54
0,821
90
0,824
21
0,822
57
0,821
93
0,824
24
0,827
60
0,822
96
0,824
27
0,829
63
0,823
99
0,824
30
0,826
66
0,823
102
0,824
33
0,826
69
0,824
105
0,824

0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9
0,74
9

36

0,827

72

0,824

108

0,824

4.1.4 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 5 dan substrat

t (s)
111
114
117
120
123
126
129
132
135
138
141
144
147
150

A
0,635
0,638
0,640
0,642
0,640
0,638
0,643
0,652
0,641
0,636
0,638
0,638
0,639
0,639

t (s)
153
156
159
162
165
168
171
174
177
180
183
186
189
192

A
0,641
0,641
0,638
0,641
0,643
0,640
0,632
0,640
0,642
0,647
0,640
0,648
0,641
0,647

t (s)
195
198
201
204
207
210
213
216
219
222
225
228
231
234

A
0,647
0,647
0,646
0,640
0,638
0,641
0,639
0,638
0,641
0,648
0,653

t (s)
237
240
243
246
249
252
255
258
261
264
267
0,654
0,646
0,642

A
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642
0,642

4.1.5 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 6

t (s)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33

A
0,825
0,822
0,833
0,830
0,826
0,833
0,830
0,837
0,839
0,833
0,818

t (s)
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78

A
0,832
0,831
0,829
0,829
0,819
0,815
0,820
0,821
0,822
0,822
0,820

t (s)
93
96
102
105
108
111
114
117
120
123
126

A
0,810
0,806
0,793
0,791
0,796
0,792
0,793
0,793
0,793
0,795
0,797

t (s)
141
144
147
150
156
159
162
165
168
171
174

A
0,794
0,792
0,791
0,791
0,791
0,791
0,791
0,791
0,791
0,791
0,791

36
39
42
45

0,815
0,820
0,829
0,834

81
84
87
90

0,818
0,814
0,817
0,819

129
132
135
138

0,798
0,800
0,803
0,801

177
180
183
186

0,791
0,791
0,791
0,791

4.1.6 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 6 dan substrat

t (s)
189
192
195
198
201
204
207
210
213
216
219
222
225
228
231
234
237

A
0,672
0,686
0,688
0,692
0,714
0,702
0,688
0,684
0,679
0,682
0,685
0,681
0,678
0,675
0,679
0,687
0,692

t (s)
240
243
246
249
252
255
258
261
264
267
270
273
276
279
282
285
288

A
0,697
0,695
0,692
0,688
0,696
0,698
0,705
0,704
0,700
0,704
0,700
0,694
0,700
0,704
0,704
0,709
0,710

t (s)
291
294
297
300
303
306
309
312
315
318
321
324
327
330
333
336
339

A
0,700
0,689
0,692
0,696
0,701
0,701
0,696
0,700
0,703
0,694
0,689
0,695
0,699
0,697
0,698

t (s)
342
345
348
351
354
357
360
363
366
369
372
342
345
348
351
0,697
0,695

4.1.7 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2 dan pH 4

t (s)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39

A
0,498
0,497
0,497
0,497
0,497
0,497
0,497
0,497
0,496
0,496
0,496
0,497
0,496

t (s)
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78
81

A
0,497
0,497
0,497
0,498
0,498
0,498
0,498
0,498
0,498
0,498
0,498
0,498
0,498

A
0,698
0,700
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704
0,704

42

0,497

4.1.8 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2, pH 4 dan substrat

t (s)
84
87
90
93
96
99
102
105
108
111
114
117
120

A
0,373
0,373
0,372
0,372
0,372
0,371
0,371
0,372
0,372
0,372
0,372
0,372
0,372

t (s)
123
126
129
132
135
138
141
144
147
150
153
156
159

A
0,372
0,372
0,372
0,373
0,373
0,373
0,373
0,373
0,373
0,373
0,373
0,373

4.1.9 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2 dan pH 5

t (s)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39

A
0,416
0,414
0,412
0,412
0,412
0,412
0,412
0,412
0,412
0,413
0,412
0,414
0,415

t (s)
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78
81
84
87

A
0,415
0,414
0,413
0,413
0,413
0,412
0,413
0,413
0,413
0,413
0,413
0,413
0,413

t (s)
99
102
105
108
111
114
117
120
123
126
129
132
135

A
0,413
0,413
0,413
0,413
0,413
0,413
0,413
0,414
0,413
0,413
0,413
0,414
0,414

t (s)
147
150
153
156
159
162
165
168
171
174
177
180
183

A
0,414
0,414
0,414
0,414
0,414
0,414
0,414
0,414
0,414
0,415
0,415
0,415
0,415

t (s)
195
198
201
204
207
210
213
216
219
222
225
228
231

A
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416
0,416

42
45
48

0,415
0,415
0,415

90
93
96

0,413
0,413
0,413

138
141
144

0,414
0,414
0,414

186
189
192

0,415
0,416
0,416

234

0,416

4.1.10 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2, pH 5 dan substrat

t (s)
237
240
243
246
249
252
255
258
261
264

A
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281

t (s)
267
270
273
276
279
282
285
288
291
294

A
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,281
0,28
0,28
0,28
0,28

t (s)
294
297
300
303
306
309
312
315
318
321

A
0,28
0,28
0,28
0,28
0,279
0,279
0,279
0,279
0,28
0,28

t (s)
324
327
330
333
336
339
342
345

4.1.11 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2 dan pH 6

t (s)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42

A
0,991
0,99
0,989
0,988
0,988
0,987
0,986
0,985
0,985
0,986
0,986
0,986
0,986
0,987

t (s)
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78
81
84
87

A
0,987
0,988
0,987
0,987
0,987
0,987
0,987
0,988
0,989
0,99
0,99
0,99
0,989
0,989

t (s)
93
96
99
102
105
108
111
114
117
120
123
126
129
132

A
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989
0,989

A
0,28
0,28
0,28
0,28
0,28
0,28
0,28
0,28

45

0,987

90

0,989

135

0,989

4.1.12 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2, pH 6 dan substrat

t (s)
135
138
141
144
147
150
153
156
159
162
165
168
171
174
177
180
183

A
0,752
0,754
0,755
0,756
0,757
0,757
0,758
0,758
0,758
0,759
0,76
0,761
0,761
0,761
0,762
0,762
0,762

t (s)
186
189
192
195
198
201
204
207
210
213
216
219
222
225
228
231
234

A
0,763
0,764
0,764
0,765
0,766
0,766
0,767
0,768
0,768
0,769
0,769
0,77
0,771
0,772
0,773
0,773
0,773

t (s)
234
237
240
243
246
249
252
255
258
261
264
267
270
234
237
240
243

A
0,774
0,774
0,775
0,775
0,776
0,776
0,776
0,777
0,777
0,777
0,778
0,778
0,778
0,778
0,779
0,779
0,78

t (s)
243
246
249
252
255
258
261
264
267
270
273
276
279
282
285
288
291

A
0,781
0,781
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782
0,782

4.2 Pembahasan
Enzim poligalakturonase merupakan enzim yang berperan dalam
pelunakan buah pada proses pematangan. Enzim ini bekerja dengan cara
memutuskan ikatan glikosida pada polipeptida penyusun dinding sel buah. Reaksi
enzim poligalakturonase adalah sebagai berikut :
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Enzim poligalakturonase
H2O

Percobaan kali ini menggunakan buah tomat ( Solanum lycopersicum )

sebagai bahan utama. Enzim Poligalakturonase terdapat di dalam sel daging buah
tomat. Buah tomat yang digunakan adalah buah tomat yang matang dengan ciri
kulit dan daging buahnya kemerah-merahan dan teksturnya tidak terlalu lunak.
Penyiapan sampel diawali dengan pencucian buah tomat, dikeluarkan
isinya dan dipotong daging buahnya menjadi bagian kecil dengan ukuran 4 x 8 x
0,5 cm. Setelah dipotong buah tomat tersebut ditimbang sebanyak 150 gram dan
ditambahkan larutan NaCl 5% dingin dengan perbandingan (1:9).
Campuran buah tomat dengan larutan NaCl disimpan dalam freezer selama
24 jam. Fungsi penambahan NaCl 5 % adalah sebagai pelarut enzim agar enzim
terdispersi sempurna.Campuran buah tomat dengan larutan NaCl 5% dingin
diblender untuk mengeluarkan enzim poligalakturonase dari dalam sel. Keadaan
dingin diberikan untuk menonaktifkan enzim. Cairan hasil blender disaring
dengan kain saring untuk memisahkan ampas dengan filtratnya. Filtrat didiamkan
sampai terbentuk dua fase. Setelah diperoleh dua fase, fase endapan dan cairan.
Cairan hasil dekantasi disentrifuse dengan kecepatan maksimal 4000 rpm selama
10 menit. Supernatan diambil dan dipisahkan dari peletnya.
Supernatan ini kemudian ditambahkan dengan amonium sulfat18%.
Penambahan amonium sulfat ini berfungsi sebagai medium pengendap enzim
poligalakturonase. Amonium sulfat menghilangkan garam yang mendispersi
enzim. Larutan disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.
Sentrifuse akan menghasilkan supernatan 1, pelet 1 dan endapan pengotor yang
sangat sedikit. Supernatan 1 diambil dan disisihkan. Pelet 1 yang ada di dinding
tabung sentrifuse diambil dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan
dalam aquademin serta disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak.
Supernatan 1 diuji dengan biuret. Jika terdapat enzim maka larutan akan
berwarna ungu. Warna ungu terbentuk karena reagen biuret bereaksi dengan
ikatan peptida pada enzim. Hasil uji biuret terhadap supernatan 1 berwarna ungu
yang menunjukkan terdapatnya enzim.
Supernatan 1 ditambah dengan amonium sulfat 28% karena dalam
supernatan 1 ini

masih terdapat enzim yang masih terdispersi. Setelah

penambahan amonium sulfat, supernatan 1 disentrifuse lagi dengan kecepatan

4000 rpm selama 10 menit. Hasil yang diperoleh yakni supernatan 2, pelet 2 dan
endapan pengotor yang sangat sedikit.
Supernatan 2 dan endapan pengotor diambil dan dibuang. Pelet 2 diambil
dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan dalam aquademin serta
disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak. Pelet 2 disimpan untuk uji
aktivitas enzimnya.
Uji aktivitas enzim poligalakturonase dilakukan dengan penambahan
substrat pektin dan variasi pH. Substrat pektin yang diperoleh dengan cara
ekstraksi pektin dari buah tomat. Buah tomat dibelah, dikeluarkan isinya dan
dicuci dengan air untuk menghilangkan kotoran. Buah tomat yang sudah bersih
diblender sampai halus untuk mengeluarkan pektin dari dinding sel. buah Buah
tomat yang sudah diblender ditambahkan air dan HCl 1% serta pemanasan pada
pH 1.5 yang berfungsi untuk menghidrolisis protopektin menjadi pektin. Hasil
dari penasan berupa bubur yang kemudian disaring untuk mendapatkan filtrate
pektin. Filtrat pektin yang diperoleh dipekatkan dengan cara dipanaskan kembali
sampai volume filtrate menjadi setengahnya. Alkohol asam yang dibuat dari
campuran etanol 99% dan HCl pekat ditambahkan untuk memisahkan pektin dari
filtrat dengan cara diendapkan. Filtrat didiamkan selama 14 jam untuk
mendapatkan hasil endapan pektin yang sempurna. Endapan pektin yang
terbentuk kemudian disaring menggunakan kertas saring dan dilarutkan dengan
aquademin. Pektin yang terlarut dalam aquademin disimpan dalam lemari
pendingin untuk pengujian aktivitas enzim yang berfungsi sebagai substrat dari
enzim poligalakturonase.
Pengujian enzim poligalakturonase dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 290 nm. Pelet 1 dan pelet 2
yang berisi enzim diuji absorbansinya dengan memberikan variasi pH disekitar
pH optimal dan menggunakan substrat pektin.
Aktivitas katalitik enzim poligalakturonase dapat diamati dengan
penambahan substrat ke dalamnya dan memberikan variasi pH disekitar pH

optimal.pH optimal enzim poligalakturonase adalah 5,5. Pada percobaan kali ini
variasi pH yang diberikan yaitu pH 4, 5 dan 6.
Enzim pada pelet 1 diukur absorbansinya,diambil 2 mL dan diletakkan
dalam kuvet. Kemudian ditambahkan buffer Tris-HCl dengan pH 4 sebanyak 0,5
mL ke dalam kuvet. Campuran enzim-pH diukur absorbansinya setiap 3 detik
hingga konstan. Setelah diperoleh absorbansi yang konstan, substrat pektin
ditambahkan ke dalam kuvet sebanyak 0,5 mL. Kemudian campuran enzimsubstrat diukur absorbansinya setiap 3 detik hingga absorbansinya konstan. Proses
ini diulangi untukvariasi pH 5 dan 6 serta untuk pelet 2 dengan variasi pH 4,5,6.
Nilai absorbansi yang diperoleh dari larutan enzim pada pelet 1 dengan
variasi pH dan penambahan substrat akan disajikan dalam bentuk grafik di bawah
ini:

Absorbansi Pelet 1 pada pH 4 Substrat

1
0.8
0.6
Absorbansi 0.4
0.2
0
0

50

100 150 200 250 300 350 400 450 500

t (waktu)

Grafik diatas diperoleh ketika larutan enzim pada pelet 1 ditambahkan

larutan buffer Tris-HCl pH 4. Grafik tersebut menunjukkan diawal pengukuran
nilai absorbansi yang terukur tinggi. Hal tersebut dikarenakan enzim bebas belum
terprotonasi oleh penambahan H+ oleh buffer pH 4, akibatnya enzim masih kaya
elektron yang dapat menyerap cahaya yang diberikan spektrofotometer sehingga
banyak cahaya yang diserap menyebabkan nilai absorbansi tinggi. Turunnya nilai
absorbansi pada grafik menunjukkan bahwa sisi enzim yang bermuatan negatif
berinteraksi dengan ion H+ sudah mulai banyak sehingga enzim kekurangan

elektron. Akibatnya elektron yang menyerap cahaya berkurang dan menghasilkan

nilai absorbansi turun. Setelah mengalami penurunan, nilai absorbansi mengalami
kenaikan lagi, ini diakibatkan karena ion H+ terus bergerak kadang mendekat
kadang menjauhi enzim. Fenomena ini menyebabkan enzim ada yang berinteraksi
dengan ion H+ ada yang tidak. Ketika ada ion H+ yang terlepas dari enzim maka
nilai absorbansi akan naik lagi. Pola naik turun ini terjadi secara berulang hingga
didapatkan nilai absorbansi yang konstan. Nilai ini didapatkan karena sudah
banyak ion H+yang terikat dan terlepas dari enzim sehingga terjadi
kesetimbangan. Larutan enzim dan buffer pH 4 tadi ditambahkan subtrat berupa
larutan pektin. Grafik absorbansi setelah ditambah substrat menunjukkan nilai
absorbansi yang turun. Hal tersebut dikarenakan enzim sudah banyak berinteraksi
dengan subtrat diawal membentuk kompleks enzim-subtrat (ES), sehingga
elektron pada enzim bebas yang menyerap cahaya pada panjang gelombang 290
nm yang diberikan spektrofotometer mulai berkurang sehingga mengakibatkan
nilai absorbansi yang rendah. Pada grafik, naiknya nilai absorbansi disebabkan
karena tidak semua sisi aktif enzim berinteraksi dengan substrat sehingga tidak
terbentuk

kompleks

enzim-subtrat

(ES).

Sedikitnya

kompleks

subtrat

mengindikasikan banyaknya elektron pada enzim bebas yang ada banyak

menyerap cahaya menyebabkan nilai absorbansi perlahan naik. Setelah
mengalami kenaikan, nilai absorbansi mengalami penurunan lagi, ini dikarenakan
elektron pada subtrat dan enzim terus bergerak saling ,mendekat dan menjauh.
Ketika ada subtrat yang mendekati enzim membentuk kompleks-enzim maka nilai
absorbansi kembali turun. Pola tersebut terus berulang hingga diperoleh nilai
absorbansi konstan. Nilai absorbansi yang konstan tersebut diakibatkan sudah
banyak kompleks enzim-subtrat yang terbentuk dan kompleks enzim yang terurai
menjadi enzim bebas sehingga terjadi kesetimbangan.
Jika dibandingkan nilai absorbansi enzim ditambahkan pH Buffer TrisHCl dengan nilai absorbansi enzim + pH ditambahkan substrat maka nilai
absorbasi enzim-subtrat lebih rendah. Hal tersebut disebabkan enzim pada enzim
dalam tersebut pH masih belum membentuk kompleks enzim-subtrat sehingga
elektron pada enzim bebas tersebut lebih banyak menyerap cahaya dibandingkan

elektron enzim bebas pada larutan enzim + pH + substrat. Nilai Km diperoleh

dari selisih absorbansi pada keadaan enzim yang konstan setelah ditambah pH dan
awal substrat konstan ketika ditambahkan substrat dibagi dengan selisih
waktunya. Nilai Km pelet 1 pada variasi pH 4 adalah 3,68 x 10-4.

Absorbansi pelet 1 pada pH 5 + Substrat

1
0.8
0.6
Absorbansi 0.4
0.2
0
0

50

100

150

200

250

300

t(waktu)

Grafik diatas diperoleh ketika larutan enzim pada pelet 1 ditambahkan

larutan buffer Tris-HCl pH 5. Grafik tersebut menunjukkan diawal pengukuran
nilai absorbansi yang terukur tinggi. Hal tersebut dikarenakan enzim bebas belum
terprotonasi oleh penambahan H+ oleh buffer pH 5, akibatnya enzim masih kaya
elektron yang dapat menyerap cahaya yang diberikan spektrofotometer sehingga
banyak cahaya yang diserap menyebabkan nilai absorbansi tinggi. Turunnya nilai
absorbansi pada grafik menunjukkan bahwa sisi enzim yang bermuatan negatif
berinteraksi dengan ion H+ sudah mulai banyak sehingga enzim kekurangan
elektron. Akibatnya elektron yang menyerap cahaya berkurang dan menghasilkan
nilai absorbansi turun. Setelah mengalami penurunan, nilai absorbansi mengalami
kenaikan lagi, ini diakibatkan karena ion H+ terus bergerak kadang mendekat
kadang menjauhi enzim. Fenomena ini menyebabkan enzim ada yang berinteraksi
dengan ion H+ ada yang tidak. Ketika ada ion H+ yang terlepas dari enzim maka
nilai absorbansi akan naik lagi. Pola naik turun ini terjadi secara berulang hingga
didapatkan nilai absorbansi yang konstan. Nilai ini didapatkan karena sudah

banyak ion H+yang terikat dan terlepas dari enzim sehingga terjadi
kesetimbangan.
Grafik tersebut juga menunjukkan bahwa nilai absorban konstan saat
penambahan pH 5 lebih cepat didapatkan daripada penambahan pH 4. Dapat
dilihat pada penambahan buffer Tris-HCl pH 4 didapatkan nilai konstan pada
kisaran detik ke 200 sedangkan pada penambahan buffer-Tris HCl pH 5
didapatkan nilai absorbansi konstan pada kisaran detik ke 40. Hal tersebut
dikarenakan pada pH kisaran 5 hingga 5,5 adalah pH optimum dari enzim
Poligalakturonase. Keadaan tersebut mengakibatkan enzim mempunyai aktivitas
yang optimum sehingga elektron pada enzim cepat berinteraksi dan lebih cepat
terbentuk kesetimbangan akhirnya didapatkan nilai absorbansi konstan lebih
cepat.
Hubungan antara absorbansi dengan waktu (sekon) ketika enzim PG pada
pH 5 yang ditambahkan dengan substrat pektin. Detik ke-111 menunjukkan
absorbansi rendah sekitar 0,635. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim PG
tinggi. Karena dengan waktu yang sangat singkat absorbansi yang dihasilkan
rendah. Enzim ini langsung berikatan dengan pektin membentuk kompleks enzimsubstrat

ketika

penambahan

substrat

dilakukan.

Kemudian

absorbansi

menunjukkan kenaikan yang berarti enzim yang berinteraksi dengan susbtrat

berkurang atau dengan kata lain enzim bebas PG lebih banyak dalam larutan.
Setelah mengalami kenaikan, absorbansi PG kembali menurun. Hal ini
menunjukkan bahwa enzim PG berikatan dengan sisa substrat yang ada dalam
larutan. Selanjutnya terjadi pola naik turun yang berarti masih terdapatnya
aktivitas enzim PG yang membentuk kompleks enzim-substrat. Pola ini terus
terjadi hingga diperoleh absorbansi paling minimum yakni sekitar 0,632.
Absorbansi minimum berarti bahwa sebagian besar enzim PG berikatan dengan
substrat sehingga enzim yang ada di larutan sangat sedikit. Absorbansi minimum
juga bisa diartikan bahwa enzim memiliki aktivitas tinggi. Oleh karena itu dapat
dikatakan bahwa pH 5 merupakan pH optimum dari enzim PG. Grafik terakhir
menunjukkan nilai absorbansi konstan. Kekonstanan ini berarti telah terjadi

kesetimbangan kompleks enzim-substrat seperti yang digambarkan pada

persamaan di bawah ini:
E + S ES
Dengan terjadinya kesetimbangan ini menyebabkan jumlah enzim dalam larutan
dalam setiap waktu tetap sehingga absorbansi yang terukur konstan. Berdasarkan
grafik di atas diperoleh nilai Km sebesar 50,6 x 10-4.

Absorbansi Pelet 1 pada pH 6 + Substrat

1.000
0.800
0.600
Absorbansi 0.400
0.200
0.000
0

50

100 150 200 250 300 350 400 450

t (s)

Grafik di atas merupakan grafik yang menunjukkan nilai absorbansi enzim

PG pada pelet 1 dengan kondisi pH 6 sebelum hingga sesudah penambahan
substrat. Grafik yang menunjukkan keadaan sebelum penambahan susbtrat yakni
pada detik ke 0 hingga 186 atau kurang dari dua ratus sekon. Awal grafik
menunjukkan nilai absorbansi 0,824 pada detik ke 0 yang berarti enzim yang
berikatan dengan ion H+ pada saat penambahan pH masih sedikit. Enzim dapat
berikatan dengan ion H+ karena enzim tersusun oleh protein yang monomernya
asam amino. Asam amino ini memiliki sifat amfoter karena dapat menghasilkan
muatan negatif dan positif sekaligus. Ketika terdapat ion H + maka muatan negatif
dari enzim akan menarik ion H+ sehingga terbentuk ikatan. Keberadaan ion H+
dalam larutan tidak menetap atau ion H+ ini berpindah-pindah tempat kadang
menjauh dan kadang mendekat ke sekitar muatan negatif dari enzim. Mobilitas
ion H+ ini mempengaruhi pergerakan elektron enzim. Semakin besar densitas
elektron pada enzim serapan cahaya enzim semakin besar dan sebaliknya. Dengan

demikian akan terjadi pola naik turun dari absorbansi seperti yang ditunjukkan
grafik di atas. Lama kelamaan akan terjadi kekonstanan absorbansi enzim yakni
pada detik ke 147 hingga 186 dengan absorbansi sebesar 0,791. Kekonstanan ini
menujukkan bahwa terjadi kesetimbangan antara jumlah ion H+ dengan jumlah
enzim dalam larutan sehingga penyerapan cahaya memiliki besar yang sama.
Selanjutnya larutan enzim tersebut ditambahkan dengan substrat. Grafik
yang semula konstan menjadi berlika-liku lagi. Grafik ketika penambahan susbtrat
terjadi pada detik ke 189 dengan absorbansi sebesar 0,672. Terjadi penurunan
absorbansi, hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim dalam berinteraksi dengan
susbtrat sangat tinggi. Ikatan enzim dengan susbtrat akan membentuk kompleks
enzim substrat sesuai dengan persamaan di bawah ini:
E + S ES
Kemudian grafik naik cukup drastis berarti hanya sedikit enzim yang berikatan
dengan susbtrat sehingga enzim yang ada dalam larutan sangat banyak dan
menyerap cahaya dalam jumlah besar. Akibatnya absorbansi yang diperoleh cukup
tinggi. Kemudian grafik mengalami penurunan secara perlahan. Penurunan ini
maksudnya enzim berikatan dengan substrat dengan kecepatan yang kurang cepat
dibandingkan yang lain. Kenaikan terjadi kembali yang menandakan bahwa ada
sebagian enzim yang tidak berikatan dengan susbtrat. Karena semakin lama
jumlah substrat berkurang maka absorbansi enzim menuju konstan itu cukup
tinggi meskipun dengan pola naik turun. Grafik konstan menunjukkan telah
terbentuk kesetimbangan antara kompleks ES.
Nilai kecepetan reaksi enzim PG pelet 1 pada pH 6 dapat dihitung mulai
dari daerah grafik yang konstan lebih awal dan akhir. Kecepetan ini dihitung
dengan cara selisih absorban pada daerah tersebut dibagi dengan selisih waktu
yang diperlukan. Berdasarkan hasil perhitungan, diperoleh kecepatan reaksi enzim
PG pada pH 4 sebesar 4,39 x 10-4. Kecepatan tersebut digunakan untuk
menghitung besarnya nilai Km yakni 2,69 x 10-4.
Berdasarkan ketiga grafik yang diperoleh, terdapat perbedaan nilai
absorbansi pada enzim yang belum ditambah substrat dan setelah ditambah
subtrat. Absorbansi enzim tanpa substrat lebih tinggi dari pada absorbansi enzim

yang ditambahkan substrat. Penurunan absorbansi pada enzim yang ditambah

substrat dikarenakan telah terbentuknya kompleks enzim-substrat sehingga
konsentrasi enzim berkurang. Kompleks enzim-substrat ini dapat mengalami
kesetimbangan untuk membentuk kembali enzim bebas dan substrat. Akibat dari
proses kesetimbangan ini, nilai absorbansinya meningkat akibat peningkatan
jumlah enzim. Absorbansi yang dihasilkan akan mengalami penurunan kembali
ketika kompleks enzim substrat terbentuk. Grafik yang naik turun ini akan terus
terjadi sampai substrat yang ditambahkan telah bereaksi semuanya dengan enzim
membentuk produk sehingga jumlah enzim yang tersisah tetap dan dihasilkan
grafik yang konstan. Enzim tanpa penambahan substrat juga menghasilkan grafik
yang naik turun dikarenakan pengaktifan enzim dengan pH tidak dapat sekaligus
terjadi. pH optimum dari enzim poligalakturonase pada pelet 1 dapat dilihat dari
keenam grafik diatas yang memiliki nilai absorbansi terendah. pH 5 merupakan
pH optimum dari enzim poligalaturonase karena grafik pada pH 5 nilai absorbansi
yang diperoleh paling rendah jika dibandingkan dengan nilai absorbansi pada pH
4 dan pH 6.
Nilai absorbansi yang diperoleh dari larutan enzim pada pelet 2 dengan
variasi pH dan substrat akan disajikan dalam bentuk grafik di bawah ini:

Absorbansi Pelet 2 pada pH 4 + substrat

0.6
0.5
0.4
Absorbansi

0.3
0.2
0.1
0
0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

t (s)

Grafik di atas dihasilkan ketika pellet 2 ditambahkan buffer pH 4

kemudian ditambah dengan substrat setelah grafik kosntan. Tahap awal
penambahan buffer 4 ke dalam pellet menghasilkan absorbansi sebesar 0,497
dengan nilai yang konstan selama 24 detik. Hal ini menunjukkan sebagian dari
enzim telah terprotonasi oleh ion H+ yang ditambahkan dari larutan buffer pH 4.
Akibatnya enzim masih kaya elektron yang dapat menyerap cahaya yang
diberikan spektrofotometer sehingga banyak cahaya yang diserap menyebabkan
nilai absorbansi tinggi. Penurunan grafik pada detik ke-27 menunjukkan interaksi
antara elektron-elektron pada sisi aktif enzim dengan ion H+ semakin bertambah.
Interaksi ini menyebabkan berkurangnya serapan cahaya yang diberikan oleh
sumber sinar spektrofotometer terhadap elektron pada enzim bebas. Berkurangnya
serapan cahaya oleh electron pada enzim bebas, akan menyebabkan penurunan
nilai absorbansi menjadi 0,496 secara konstan selama 15 detik. Ion-ion H+ di
dalam larutan akan terus bergerak mendekat dan menjauhi enzim. Ketika ion H+
yang berinteraksi dengan enzim terlepas maka nilai absorbansi yang dihasilkan
akan naik, dan ketika ion H+ bergerak mendekati sisi negatif enzim maka
absorbansi yang dihasilkan akan turun kembali. Pola naik turun ini terjadi secara

berulang hingga didapatkan nilai absorbansi yang konstan. Nilai ini didapatkan
karena sudah banyak ion H+ yang terikat dan terlepas dari enzim sehingga terjadi
kesetimbangan antara enzim dengan ion H+ dari larutan buffer. Nilai absorbansi
yang dihasilkan menunjukkan nilai absorbansi yang konstan yaitu berkisar antara
0.496-0.498, hal ini menandakan pada pellet 2 enzim yang diperoleh sudah cukup
murni sehingga reaksi kesetimbangannya terjadi lebih cepat jika dibanding
dengan pellet 1.
Enzim yang telah ditambahkan larutan buffer pH 4 pada detik ke-54 telah
menunjukkan nilai absorbansi yang konstan. Pengaruh penambahan

substrat

kedalam larutan enzim+buffer pH 4 terhadap perubahan absorbansi yang grafiknya

memiliki pola naik turun. Adanya interaksi antara enzim dengan substrat akan merubah
jumlah serapan sinar cahaya dari spektrofotometer terhadap elektron pada enzim bebas
yang menyebabkan grafik memiliki pola naik turun. Penambahan substrat pada detik ke
84 memiliki absorbansi tinggi yaitu 0,373. Absorbansi tinggi ini dihasilkan karena enzim
belum berinteraksi dengan substrat. Enzim yang belum berinteraksi dengan substrat,

mengandung banyak elektron pada sisi aktif yang dapat menyerap cahaya yang
diberikan spektrofotometer sehingga banyak cahaya

yang diserap

dan

menyebabkan nilai absorbansi tinggi. Pada detik ke-90 absorbansi enzim

mengalami penurunan akibat terbentuknya kompleks enzim-substrat. Substrat
yang ditambahkan akan berikatan dengan sebagian enzim membentuk kompleks
enzim-substrat (penambahan enzim lebih banyak dari subsrat). Berkurangnya
jumlah enzim bebas karena digunakan untuk membentuk kompleks enzimsubstrat akan menurunkan nilai absorbansi menjadi 0,372 (berkurang 0,001 dari
absorbansi awal). Grafik ini konstan sampai detik ke-96 yang kemudian
mengalami penurunan kembali pada detik ke-99 menjadi 0,371. Penurunan
absorbansi terjadi akibat kompleks ES yang terbentuk semakin banyak.
Penambahan konsentrasi dari kompleks enzim substrat akan menggeser
kesetimbangan ke arah E+S kembali sehingga grafik mengalami kenaikan pada
absorbansi 0,372 karena konsentrasi dari enzim bebas semakin bertambah.
Kompleks enzim-substrat yang telah terbentuk akan mengalami pergeseran
elektron sehingga grafik mengalami kenaikan kembali dengan nilai absorbansi

yang tetap yaitu 0,373 untuk membentuk produk. Nilai absorbansi yang konstan
menunjukkan seluruh substrat yang ditambahkan telah diubah oleh enzim menjadi
produk. Nilai absorbansi yang dihasilakan menunjukkan nilai absorbansi yang
konstan yaitu berkisar antara 0,371-0,373, hal ini menandakan pada pellet 2 enzim
yang diperoleh sudah cukup murni sehingga reaksi dengan substrat terjadi lebih
cepat jika dibanding dengan pellet 1.
Berdsasarkan grafik di atas, nilai kecepatan reaksi enzim poligalakturonase
dapat ditentukan. Kecepatan reaksi dihitung setelah absorbansi enzim pada
penambahan pH konstan hingga kekonstanan absorbansi setelah penambahan
substrat. Range tersebut berada pada detik ke 81 hingga 135. Kecepatan reaksi
dihitung dengan cara selisih absorbansi dibagi selisih waktu pada range waktu
tersebut. Hasil yang diperoleh yakni kecepatan reaksi enzim pelet 2 pada pH 4
sebesar 5,37 x 10-4 dan nilai Km sebesar setengah dari kecepatan awal sehingga
diperoleh nilai sebesar 11,6 x 10-4.
Berdasarkan grafik diatas, nilai absorbansi dari enzim yang ditambahkan
pH Buffer Tris-HCl lebih tinggi jika dibandingan dengan nilai absorbansi
enzim+pH yang ditambahkan substrat. Hal ini dapat diketahui dari nilai
absorbansi enzim+pH berada pada rentang 0,496-0,498 sedangkan absorbansi
enzim+pH+subtrat berada pada rentang 0,371-0,373. Hal tersebut disebabkan
enzim yang ditambahkan Buffer Tris-HCl tidak terdapat pembentukan kompleks
enzim-subtrat sehingga elektron pada enzim bebas tersebut lebih banyak
menyerap

cahaya

enzim+pH+substrat.

dibandingkan

elektron

enzim

bebas

pada

larutan

Absorbansi pelet 2 pada pH 5 + substrat

0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
Absorbansi

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

50

100 150 200 250 300 350 400

waktu (sekon)

Grafik diatas dihasilkan ketika pellet 2 ditambahkan buffer pH 5. Tahap

awal penambahan buffer 5 kedalam pellet 2 menghasilkan absorbansi yang tinggi
sebesar 0.414. Hal ini menunjukkan enzim bebas belum terprotonasi oleh
penambahan H+ oleh buffer pH 5, akibatnya enzim masih kaya elektron yang
dapat menyerap cahaya yang diberikan spektrofotometer sehingga banyak cahaya
yang diserap menyebabkan nilai absorbansi tinggi. Turunnya nilai absorbansi pada
grafik didetik ke-9 menunjukkan bahwa sisi enzim yang bermuatan negatif
berinteraksi dengan ion H+ sehingga enzim kekurangan elektron. Akibatnya
elektron yang menyerap cahaya berkurang dan menghasilkan nilai absorbansi
turun yaitu 0,412. Ion- ion H+ didalam larutan akan terus bergerak mendekat dan
menjauhi enzim. Ketika ion H+yang berinteraksi dengan enzim terlepas maka nilai
absorbansi yang dihasilkan akan naik, dan ketika ion H+ bergerak mendekati sisi
negatif enzim maka absorbansi yang dihasilkan akan turun kembali. Pola naik
turun ini terjadi secara berulang hingga didapatkan nilai absorbansi yang konstan.
Nilai ini didapatkan karena sudah banyak ion H + yang terikat dan terlepas dari
enzim sehingga terjadi kesetimbangan antara enzim dengan ion H+ dari larutan
buffer. Nilai absorbansi yang dihasilkan menunjukkan nilai absorbansi yang

konstan yaitu berkisar antara 0,412-0,416, hal ini menandakan pada pellet 2 enzim
yang diperoleh sudah cukup murni sehingga reaksi kesetimbangannya terjadi
lebih cepat jika dibanding dengan pellet 1.
Grafik di atas juga menunjukkan nilai absorbansi enzim dengan buffer pH
5 dan substrat pektin. Pada waktu 3 detik, absorbansi enzim menunjukkan angka
0,281. Nilai ini konstan hingga 45 detik. Nilai absorbansi yang konstan
menunjukkan bahwa enzim belum bereaksi dengan substrat, hingga jumlah
elektron enzim bebas yang mengabsorbsi cahaya spektrofotometri masih sama
(konstan). Selanjutnya nilai absorbansi turun menjadi 0,28 pada waktu 51 detik.
Penurunan nilai absorbansi menunjukkan bahwa enzim bebas telah bereaksi
dengan substrat membentuk kompleks enzim substrat dan mengakibatkan jumlah
enzim bebas berkurang. Berkurangnya jumlah enzim bebas berarti mengurangi
jumlah elektron yang akan tereksitasi ketika mengabsorbsi cahaya dari
spektrofotometri. Oleh karena itulah nilai absorbansi enzim berkurang. Nilai
absorbansi konstan hingga waktu 69 detik dan nilai absorbansinya turun menjadi
0,279 pada waktu 75 detik dan berlanjut konstan hingga waktu 81 detik.
Penurunan nilai absorbansi diduga disebabkan oleh kesetimbangan enzim dan
substrat dengan kompleks enzim substrat. Nilai absorbansi kembali ke angka 0,28
pada waktu 87 detik. Nilai ini berlanjut konstan hingga waktu 111 detik. Nilai
absorbansi yang konstan menunjukkan bahwa pada semua enzim telah bereaksi
dengan substrat.
Grafik di atas juga menunjukkan bahwa nilai absorbansi enzim yang
ditambah substrat lebih kecil dibandingkan enzim yang hanya ditambah dengan
buffer pH yang ditunjukkan pada detik ke 237. Pada enzim yang hanya ditambah
dengan pH tidak terdapat pembentukan kompleks substrat enzim, sehingga jumlah
enzim bebas yang mengandung elektron jumlahnya banyak. Banyaknya jumlah
elektron padaenzim bebas menyebabkan jumlah cahaya yang diabsorbsi dari
spektrofotometri menjadi banyak. Sebaliknya pada enzim yang ditambah dengan
substrat, akan terbentuk kompleks enzim-substrat yang mengakibatkan jumlah
absorbansi cahaya berkurang. Berdasarkan grafik di atas, diperoleh nilai Km
sebesar 0,03 x 10-4.

Absorbansi pelet 2 pada pH 6 + substrat

1.2
1
0.8
Absorbansi

0.6
0.4
0.2
0
0

50

100 150 200 250 300 350 400

waktu (sekon)

Grafik di atas dihasilkan dari absorbansi enzim pada pelet 2 ketika

ditambahkan dengan buffer pH 6. Absorbansi awal enzim pada penambahan
buffer pH 6 menghasilkan absorbansi sebesar 0,988 dan nilainya bertahap turun
hingga detik ke 24. Hal ini menunjukka bahwa terdapat sebagian enzim yang
telah bereaksi dengan proton H+ buffer asam, akibatnya absorbansi enzim
turun.niai absorbansi tetap sampai deik ke 27 dan kembali naik pada detik ke 30
dan konstan hingga detik ke 36. Kenaikan ini terjadi karena proses pencampuran
pH buffer dan enzim sudah mulai homogen, yang artinya hampir semua buffer
telah berinteraksi dengan enzim. Pola kenaikan absorbansi ini berlangsung hingga
detik ke 81 dengan absorbansi 0,99. Pola ini terjadi karena proses interaksi antara
enzim dan buffer yang belum mencapai kesetimbangan. Absorbansi enzim
kembali turun pada detik ke 84 menjadi 0,989. Selanjutnya nilai absorbansi ini
konstan hingga detik ke 130. Nilai absorbansi yang konstan diakibatkan semua
enzim telah bereaksi dengan semua buffer pH. Dalam waktu 84 detik pelet 2
dengan buffer pH 6 enzim telah mencapai nilai absorbansi yang konstan. Hal ini
menandakan enzim pada pelet 2 bereaksi lebih cepat mencapai kesetimbangan
dibandingkan dengan pelet 1.

Grafik di atas menunjukkan data kenaikan nilai absorbansi seiring dengan

pertambahan waktu. Interaksi antara enzim dengan substrat pektin mengakibatkan
nilai absorbansi naik. Serapan cahaya spektrofotometri pada elektron enzim bebas
naik karena elektron-elektron pada enzim bebas bereaksi dengan substrat.
Kenaikan ini terus berlangsung hingga detik ke 243 dengan nilai absorbansi
0,781. Pertambahan nilai absorbansi artinya dengan bertambahnya waktu semakin
banyak enzim yang telah bereaksi dengan substrat. Nilai absorbansi ini konstan
sampai detik ke 291. Artinya semua enzim telah bereaksi dengan substrat
membentuk kompleks enzim substrat. Berdasarkan grafik di atas dapat diperoleh
nilai Km yakni sebesar 0,93 x 10-4.
Berdasarkan data kedua grafik diatas, nilai dari enzim yang ditambahkan
buffer pH 6 lebih tinggi dibandingkan dengan nilai absorbansi enzim yang
ditambah buffer pH dan substrat. Absorbansi enzim + buffer pH berada di antara
0,985-0,99, sedangkan absorbansi enzim + buffer pH + substrat berada di antara
0,752-0,78. Nilai absorbansi enzim + buffer pH + substrat lebih kecil karena pada
pencampuran substrat tersebut, jumlah elektron pada enzim bebas yang
mengabsorbsi cahaya spektrometri berkurang akibat adanya pembentukan
kompleks enzim substrat dari enzim dan substrat.
Aktivitas maksimum enzim PG pada pelet 2 terdapat pada pH 6. Hal ini
berbeda dengan literatur yang diperoleh yakni pH optimum enzim PG seharusnya
5,5. Kesalahan data yang diperoleh diakibatkan oleh pengenceran enzim yang
digunakan pada pengukuran pH 6 berbeda dengan enzim untuk pH 4 dan pH 5.
Perbedaan pengenceran ini membuat konsentrasi enzim yang terukur berbeda
sehingga absorbansi yang diperoleh juga berbeda. Absorbansi enzim pada pH 6
menunjukkan nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan absorbansi pH 4 dan 5.
Hal ini mungkin dikarenakan enzim pada pH 6 memiliki suhu yang berbeda
dengan yang lain karena adanya penambahan pelarut aquademin.
Grafik yang dihasilkan dari pelet 2 tidak jauh berbeda dengan grafik pada
pelet 1, yaitu nilai absorbasi enzim tanpa penambahan substrat lebih tinggi
dibandingkan absorbansi enzim dengan penambahan substrat. pH optimum dari
enzim poligalakturonase pada pelet 1 dapat dilihat dari keenam grafik diatas yang

memiliki nilai absorbansi terendah. pH 5 merupakan pH optimum dari enzim

poligalakturonase karena grafik pada pH 5 nilai absorbansi yang diperoleh paling
rendah jika dibandingkan dengan nilai absorbansi pada pH 4 dan pH 6.
Berdasarkan grafik yang diperoleh, terdapat perbedaan antara grafik pelet
1 dan pelet 2, yaitu pelet 1 membutuhkan waktu yang lama untuk mencapai nilai
absorbansi yang konstan yakni sekitar 2-3 menit. Sedangkan pelet 2 hanya
membutuhkan waktu sekitar 10 detik-1 menit untuk mencapai nilai absorbansi
yang konstan.Perbedaan ini disebabkan adanya perbedaan komposisi yang
terkandung pada masing-masing pelet. Diduga pelet 1 mengandung enzim
poligalakturonase yang bercampur dengan bermacam-macam enzim dan protein
lainnya. Akibatnya absorbansi senyawa-senyawa penyusun larutan sulit untuk
konstan terutama jika meja tempat spektrofotometer digerakkan.nilai absorbansi
pelet 2 dapat konstan lebih cepat karena kemungkinan senyawa yang terkandung
pada pelet 2 hanya enzim poligalakturonase. Oleh karena itu pelet 2 memiliki nilai
absorbansi yang sama pada 1 panjang gelombang dan nilainya konstan lebih cepat
Berdasarkan karakterisasi enzim melalui uji aktivitas yang terdapat pada
buah tomat, dihasilkan enzim poligalakturonase. Hal ini dibuktikan dengan
penurunan absorbansi ketika substrat spesifik yaitu pektin ditambahkan pada
enzim poligalakturonase. Selain itu pada pH 5 enzim poligalakturonase memiliki
aktivitas tinggi yang ditunjukkan dengan nilai absorbansi rendah, sehingga dapat
disimpulkan pH 5 merupakan pH optimum enzim poligalakturonase sesuai
dengan refernsi yang didapatkan.

V. PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Enzim yang berperan pada pelunakan daging buah pada proses
pematangan tomat adalah enzim poligalakturonase.
Karakterisasi enzim poligalakturonase menggunakan substrat pektin dan
variasi pH 4, 5, dan 6.
Enzim poligalakturonase memberikan aktivitas paling tinggi pada pH 5.
V.2 Saran
Sebaiknya variabel lain selain variabel kontrol dijaga konstan agar tidak
mempengaruhi hasil data yang diinginkan.
Sebaiknya pengenceran dilakukan denganteliti agar tidak dihasilkan
variasi konsentrasi larutan enzim yang dapat mempengaruhi nilai
absorbansi.
Sebaiknya pada pengukuran kuantitatif menggunakan software khusus
spektrofotometri UV-Vis agar diperoleh hasil yang akurat dan lebih mudah
serta cepat dalam pengerjaannya.

DAFTAR PUSTAKA
Bird et al. 1988. Fruit quality characteristics of transgenic tomato fruit with
altered polygalacturonase activity. USA: HortScience.
DellaPenna, D. 1989. Polygalacturonase isozymes and pectin depolymerization in
transgenic rin tomato fruit. New York: Plant Physiol.
Ghazahl, HM and Leong, CK. 1987. Methodology for Enzyme. ePlantscience:
FoodChem.
Lehninger, A. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Jakarta:Erlangga.
Pressey, R and Avants. 1973. Extraction and assay of tomato polygalacturonases.
USA: HortScience.
Wiseman, A. 1989. Handbook of Enzymes Biotechnology. Edisi kedua.
New York: EllisHoward.

LAMPIRAN

Gambar 1. Campuran tomat dan larutan NaCl 5%

Gambar 2. Proses pemblenderan tomat dengan larutan NaCl 5%

Gambar 3. Hasil Blender

Gambar 4. Ampas dan Hasil Dekantasi

Gambar 5. Pelet 1

Gambar 6. Hasil Uji Biuret Supernatan 1

Gambar 7. Pelet 2 dan Hasil Sentrifuse

Gambar 7. Isolasi Pektin dari Buah Tomat

Gambar 8. Spektrofotometer UV-Vis dan kuvet