Preparasi Sampel

Preparasi sampel adalah proses penyiapan sampel sebelum dilakukan analisi yang
bertujuan untuk memisahkan atau menyingkirkan pengotor atau zat yang tidak
diinginkan (selain analit) sehingga didapat hasil yang valid (Flanagan, et al., 2007).
Preparasi sampel merupakan hal paling penting dalam suatu analisis klinik karena
membutuhkan waktu paling lama diantara langkah yang lain. Lebih jauh lagi tidak jarang
banyak kesalahan terjadi dalam proses preparasi sampel. Preparasi sampel yang salah
dapat menyebabkan kesalahan dalam interpretasi data klinik yang diperoleh. Maka dari
itu setiap langkah dalam preparasi urin harus benar-benar diperhatikan. Sampel yang
digunakan dalam analisis klinik dapat berasal dari darah maupun urin. Untuk darah dapat
dipilih whole blood, serum, ataupun plasma, tergantung dari data yang diinginkan (Rai et
al.,2005).
Preparasi sampel sendiri merupakan bagian dari proses analisis yang sangat penting.
Karena teknik preparasi sampel adalah proses yang harus dilakukan untuk menyiapkan
sampel sehingga siap untuk dianalisis menggunakan instrumentasi yang sesuai. Secara
umum proses analisis minimal mempunyai 5 langkah, yaitu sampling (pengambilan
sampel), preservasi sampel (penyimpanan sampel), preparasi sampel (penyiapan sampel),
analisis (pengukuran), interpretasi data (analisis data), dan pembuatan laporan analisis.
Kesalahan pada salah satu tahap pada proses analisis akan menyebabkan terjadinya
kesalahan hasil analisis. Akibatnya akan dihasilkan data hasil analisis yang tidak valid.
Teknik preparasi sampel dilakukan dengan tujuan khusus untuk memisahkan analit dari
matriks sampel yang sangat komplek, memekatkan analit sehingga diperoleh analit
dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari semula, dan mengubah analit menjadi senyawa
lain yang dapat dianalisis dengan instrumentasi yang tersedia.

PREPARASI SAMPEL DARI

BERBAGAI MATRIKS
Analisis atau disebut juga Pengujian merupakan proses yang melibatkan penetapan dan
pengukuran suatu karakteristik bahan yang diuji serta penilaian terhadap suatu standar
tertentu untuk mengevaluasi tingkat kualitas dari bahan tersebut.
Analisis menjawab pertanyaan dua dasar dari keingintahuan manusia tentang bahan:
yaitu apayang ada dalam bahan (kualitatif) dan berapa banyak bahan tersebut
(kuantitatif).
Setelah mengetahui apa yang ada dalam bahan, analisis sering dilanjutkan dengan
berapa banyak dalam sample yang dimaksud.
Kuantitas bahan disebut major (bila >1%), minor (0,1% - 1%), trace (<0,1%)
serta ultra trace(bpj atau bpm).
Bahan dapat berwujud padat, cair ataupun gas. Bahan yang akan dianalisis disebut juga
sebagaisampel uji
Bahan berada dalam keadaan murni jika jumlahnya sekitar 100%, tetapi dapat juga
berada dalam keadaan campuran dengan bahan yang lainnya.
Bahan yang sedang atau akan dianalisis disebut sebagai analit dan merupakan bagian dari
sampel.
Bahan lain yang terdapat dalam sampel yang bukan analit disebut matriks.
Tahapan dalam Analisis
1.

Penentuan Masalah Analisis

2.

Pemilihan Metode

3.

Pengambilan Sampel

4.

Penyiapan sampel untuk analisis

5.

Perlakuan pemisahan analisis

6.

Pengukuran

7.

Perhitungan

8.

Pelaporan

1. Penentuan Masalah Analisis

Tujuan analisis : kualitatif atau kuantitatif.

 Kegunaan dari hasil analisis yang diperoleh

Siapa pengguna hasil analisis
Kapan hasil analisis ini digunakan
Seberapa jauh akurasi dan presisi hasil analisis yang diinginkan
Berapa dana yang disiapkan
Metode apa yang harus digunakan
Sampel yang akan dianalisis memerlukan pengambilan sendiri atau tinggal dianalisis saja.
2. Pemilihan Metode
Jenis dan ukuran sampel
Preparasi sampel yang diperlukan
Kadar senyawa aktif yang ditentukan
Bentuk sampel : murni atau campuran
Akurasi dan presisi hasil analisis yang diinginkan.
Peralatan/instrumen yang tersedia
Kepakaran yang tersedia
Dana yang disediakan
Kecepatan analisis yang diinginkan
Adanya metode standar atau metode dalam literatur
Bahan pembanding yang tersedia
3. Pengambilan Sampel
Jenis dan ukuran sampel
Homogenitas sampel
Stabilitas sampel
Pengambilan dilakukan sendiri atau sudah tersedia
Metode Pengambilan sampel baku
Statistika pengambilan sampel (SNI)
Transportasi, pengawetan dan penyimpanan sampel

4. Preparasi sampel
Jenis dan Wujud sampel : padat, cair, atau gas
Kelarutan analit dalam berbagai pelarut
Volatilitas analit ( perlu pemanasan atau tidak)
Jenis dan pengaruh matriks pada metode
Kadar analit ( perlu pemekatan atau tidak)
Pengubahan bentuk analit untuk pengukuran (derivatisasi)
Pengaturan kondisi ( pH, pereaksi atau pemanasan)
5. Perlakuan Pemisahan Analisis
Distilasi
Pengendapan atau pengendapan berfraksi
Ekstraksi pelarut
Solid Phase Extraction (SPE)
Pemisahan Kromatografi
Pemisahan Elektroforesis
Pemisahan Dialisis
Bentuk Pemisahan lainnya
6. Pengukuran
Kalibrasi instrumen
Validasi/Kualifikasi instrumen
Penggunaan blangko dan kontrol
Penggunaan bahan pembanding
Replikasi pengukuran
Analis yang mumpuni
Kebersihan dan perawatan yang baik
7. Perhitungan dan Pelaporan
Pemindahan data yang akurat

 Reliabilitas perhitungan ( penggunaan statistika atau komputasi)

Tata cara pelaporan (adanya pembatasan, akurasi, presisi, metode yang digunakan, dapat
dikopi atau tidak, dll)
Pustaka acuan : Christian G.D. Analytical Chemistry, 6th ed. John Willey & Sons, Inc. 2004
Sampel
Wujud sampel:
a. Bahan baku (raw material)
b. Sedian Farmasi (dosage forms)
c. Sampel biologi (darah, urin, jaringan, dll)
d. Sampel hasil riset dan pengembangan
e. Sampel lainnya (kosmetika, makanan, lingkungan)
Eksistensi analit dalam sampel:
a. Sebagai senyawa tunggal (aktif maupun non aktif)
b. Sebagai multikomponen (campuran > 2 senyawa
aktif/analit)
c. Dalam sampel biologi (sebagai senyawa utuh,
metabolit atau senyawa terikat)
Matriks (matrices):
Bagian dari sampel di luar analit yang tidak perlu dianalisis tapi dapat mengganggu
analisis terutama dalam sampel multikomponen , campuran atau sampel biologi.
Jenis matriks :
Bahan anorganik
Bahan organik
Cairan/jaringan biologi (darah, plasma, daging, dll)
Sifat matriks:
Inert, tidak mengganggu analisis
Mengganggu analisis karena turut terukur dan teranalisis
Merusak dan mengkontaminasi intrumen ukur

Preparasi sampel
Tujuan:
a)

Pemekatan analit

b)
Meningkatkan keterukuran analit melalui perubahan bentuk, reaksi kimia , derivatisasi,
agar kompatibel dengan metode analisis yang digunakan.
c)
dll.

Menghilangkan komponen pengganggu analisis melalui pemisahan, clean-up, filtrasi,

d)

Melindungi instrumen ukur dari kerusakan dan kontaminasi.

Perlakuan sangat tergantung pada:

a. Jenis sampel
b. Kadar analit
c. Metode analisis yang digunakan
d. Kualitas hasil analisis yang dipersyaratkan (akurasi dan presisi)
Tahap perlakuan menjadi tahapan penentu keberhasilan analisis untuk memperoleh
informasi hasil yang baik (akurat dan presisi).
Klasifikasi Teknik Pengukuran berdasarkan bentuk sampel yang diukur
Teknik analisis yang memerlukan sampel berupa larutan:

Volumetri

Spektrofotometri

Spektrofluorometri

Spektrometri serapan atom (AAS/FES)

Emisi plasma

Kromatografi (KLT, KCKT, KPI, KI, dll)

Elektrokimia (potensiometri, polarografi, amperometri)

Elektroforesis

2. Teknik Analisis yang memerlukan sampel padat ataupun larutan.

Analisis Fluoresensi Sinar X

Analisis Aktivasi Neutron

Sp. IR

3. Teknik Analisis yang memerlukan sampel padat

DC Arc Emission Spectroscopy

AC Arc Emission Spectroscopy

Micropobe techniques

Combustion techniques

Bentuk Preparasi Awal Sampel

Perlakuan awal untuk sampel cair:
Eksktraksi Cair-Cair
Ekstraksi Fase Padat (SPE)
Pemisahan dengan membran
Distilasi (untuk beberapa sampel)
Liofilisasi (untuk sampel biologi)
Perlakuan awal untuk sampel padat.
Pengurangan ukuran sampel
Pengeringan dan pencetakan
Pelarutan dalam pelarut yang sesuai
Ekstraksi
Derivatisasi: Pembentukan senyawa derivat yang dapat terukur oleh instrtument atau
terdeteksi oleh detektor.
Pemisahan berdasarkan proses
Teknik Pemisahan Umum
Ekstraksi Pelarut
Pengendapan
Elektrodeposisi
Pertukaran ion
Adsorpsi dan desorpsi

 Penguapan
Absorpsi
Kromatografi
Dialisis
Elektroforesis
Pemisahan dengan membran
Filtrasi
Sentrifugasi dan ultrasentrifugasi
Osmosis
Jenis Pemisahan
1.

Pemisahan Preparatif.

Tujuan pemisahan preparatif adalah memperoleh produk yang berharga dari suatu
campuran dengan cara menghilangkan pengotor sekecil-kecilnya.

Dapat dilakukan dengan skala besar, skala kecil dan skala sangat kecil.

Umumnya di industri dilakukan secara sinambung.

Teknik pemisahan yang paling banyak digunakan adalah ekstraksi, distilasi berfraksi,
kromatografi preparatif, kristalisasi , dll
2. Pemisahan Analitik,
Tujuannya untuk memperoleh informasi analitik yang bermutu (akurat, presisi) yang
dihasilkan melalui suatu pengukuran dari hasil pemisahan.
Skala pemisahan meliputi :makro, semi mikro , mikro, nano tergantung pada kadar
analit yang diperoleh dan teknik analisis yang digunakan. Dilakukan di laboratorium Analisis.
Meliputi:
a.

Pemisahan analit dari spesi yang mengganggu.

b.

Pemekatan analit dalam analisis runut

c.

Pengubahan analit kedalam fase yang sesuai

d.

Pengurangan dan penyederhanaan matriks (clean-up)

e.

Isolasi analit ke dalam bentuk murni

Pengertian Ekstraksi

Ekstraksi atau penyarian adalah proses pemindahan atau pengucilan suatu konstituen
dalam suatu sample ke suatu pelarut dengan cara mengocok atau melarutkannya.

Proses ekstraksi melibatkan dua fase ( kedua fase dapat berupa cairan tetapi tidak
bercampur) dan dapat dilakukan dengan satu kali ekstraksi (single extraction), beberapa kali
ekstraksi (multiple extraction), dan sinambung (continues extraction).

Dari segi teknik, ekstraksi dapat diklasifikasikan menjadi: Ekstraksi Cair-Cair

(ekstraksi pelarut), Ekstraksi Padat-Cair, dan Ekstraksi Super Kritik.
Ekstraksi Pelarut

Dalam proses ekstraksi cair-cair atau sering disebut juga sebagai ekstraksi pelarut, solut
dipindahkan dari pelarut satu ke pelarut yang lain dan tidak bercampur dengan cara
pengocokan yang berulang.

Di laboratorium ekstraksi pelarut dilakukan dalam suatu corong pemisah (separation

funnel).

Prosedur umum: Dalam corong pemisah, siapkan larutan solut dalam suatu pelarut.
Kalau perlu atur pH larutan atau tambahkan suatu pereaksi tertentu. Masukkan pelarut kedua
yang tidak bercampur dengan pelarut pertama dan kocok. Setelah pengocokan sempurna,
campuran dibiarkan memisah dalam dua lapisan (fase air dan fase organik). Salah satu
lapisan/fase diambil, sedangkan lapisan kedua dibuang atau diekstraksi kembali dengan cara
yang sama.
a. Koefisien Distribusi

Misalkan dalam corong pemisah, suatu spesi solut terdistribusi di antara dua pelarut/fase
yang tidak bercampur. Kesetimbangan yang terjadi adalah:
SB

SA

di mana SB adalah spesi solut dalam fase bawah, dan SA adalah spesi solut dalam fase
atas.

Secara termodinamika, pada saat kesetimbangan tercapai ratio antara aktifitas kedua
spesi solut dalam kedua fase selalu tetap (Hukum Distribusi NERNST). Untuk larutan encer,
aktifitas digantikan konsentrasi .

Koefisien Distribusi (KD) dapat ditulis sebagai berikut:

K D = CA / C B

di mana CA adalah konsentrasi spesi solut pada fase atas dan CB adalah konsentrasi dalam
fase bawah.
b.Jenis Pelarut

Pelarut yang digunakan hendaknya tidak bercampur satu sama lainnya (immiscible).
Pelarut berair (aqueous) biasanya berupa:
a. air suling
b. larutan dapar pH tertentu
c. larutan elektrolit dalam air
d. larutan pembentuk kompleks dalam air
e. larutan asam atau basa dalam air
f. kombinasi larutan-larutan tersebut di atas.

Pelarut organik yang tidak bercampur dengan air:

a. benzen, toluen, heksan, xilen
b. diklormetan, kloroform, tetraklormetan
c. dietil eter
d. metil iso butil keton
e. hidrokarbon alifatik

Pelarut organik yang bercampur dengan air: alkohol alifatik, asam karboksilat,
aldehida, keton, asetonitril, dimetilsulfoksida, dan dioksan, tidak sesuai digunakan sebagai
ekstraktan dari larutan berair, tetapi dapat digunakan sebagai ekstraktan dari larutan organik
yang tidak bercampur.
c. Ratio Distribusi (D)

Nilai KD selalu tetap pada suatu sistem dan suhu tertentu.

Nilai KD dapat berubah, jika:

a. Kedua pelarut bercampur secara sebagian (partial)
b. Solut mengalami disosiasi atau asosiasi dalam salah

satu pelarut yang digunakan

c. Solut bereaksi dengan pelarut (solvatasi)

Sesuai kondisi percobaan, maka Koefisien distribusi dapat digantikan dengan ratio
distribusi (D).
d. Persen Solut Terekstraksi

Kedua persamaan ekstraksi menunjukkan bahwa efisiensi ekstraksi tidak bergantung

pada konsentrasi awal dari solut, melainkan tergantung pada nilai KD atau D saja.

Jika pH larutan berubah maka nilai D akan berubah pula.

Nilai D selalu tetap pada kondisi percobaan, tetapi fraksi solut terekstraksi akan sangat
tergantung pada ratio volume dari kedua pelarut.

Jika volume pelarut organik yang digunakan besar maka fraksi solut terekstraksi akan
lebih banyak dalam fase organik agar nilai D tercapai pada kondisi tersebut.
e. Ekstraksi bertahap (multiple extraction)

Misalkan sejumlah berat W solut A dilarutkan dalam air lalu diekstraksi dengan
sejumlah tertentu pelarut organik:
KD = [A]o/[A]a = w/(W w)
w = W.KD/(1 + KD)
di mana w adalah berat A yang terekstraksi ke dalam fase organik.

Fraksi solut dalam fase organik dapat dihitung sebagai

fo = w/W = KD/(1 + KD),
dan fraksi dalam air fa = 1- fo = 1/(1 + KD).

Bila ekstraksi dilakukan secara bertahap n kali , maka sisa dalam air (fraksi sisa solut
dalam air) adalah :
fa = {1/(1+KD)}natau jika volumenya berbeda
fa = {Va/(Va + KD.Vo)}n

Efisiensi ekstraksi adalah fo = (1 fa) dan

%E = 100.fo

f. Aplikasi dalam penyiapan sampel

Ekstraksi pelarut sering digunakan dalam penyiapan sampel untuk analisis gravimetri,
volumetri, spektrofotometri dan kromatografi terutama untuk senyawa organik dalam
sediaan, dan dalam matriks lain seperti matriks biologi (urin dan darah).

Garam basa organik seperti sulfat atau hidrokloridanya serta garam asam organik
seperti garam Na atau K merupakan senyawa-senyawa yang mudah larut air. Sedangkan basa
organik dan asam organik melarut baik dalam pelarut organik non polar seperti kloroform
atau eter.

Dengan demikian dapat digunakan dalam desain prosedur ekstraksi.

Faktor yang mempengaruhi ekstraksibilitas analit

Tiga faktor utama adalah:

1.

Kelarutan analit dalam berbagai pelarut atau nilai Kd dalam sistem yang
digunakan dalam ekstraksi.

2.

Imisibilitas ( ketidakbercampuran ) pelarut yang digunakan harus optimum.

3.

Kesetimbangan kimia yang melibatkan analit dalam proses ekstraksi.

Syarat pelarut pengekstraksi:

1.

Pelarut hendaknya melarutkan solut sangat besar tetapi hanya tidak atau sedikit
saja melarutkan senyawa lain.

2.

Pelarut benar-benar tidak bercampur (immiscible) dengan larutan air atau sistem
berair.

3.

Pelarut mudah menguap dan mudah dimurnikan kembali.

Ekstraksi Sinambung
Ekstraksi sekali dan berulangkali dilakukan biasanya dengan menggunakan corong
pemisah ( separation funnel ).
Agar ekstraksi cair-cair dapat berlangsung secara sinambung sehingga lebih efisien dan
praktis maka digunakan ekstraktor sinambung.
Pada dasarnya ekstraktan (pelarut) yang digunakan dipanaskan lalu dikondensasikan
secara sinambung yang akan bersentuhan dengan larutan analit dalam pelarut yang lain.
Terjadilah ekstraksi analit ke dalam ekstraktan secara sinambung. Kedua pelarut harus tidak
bercampur (immiscible).
Dikenal dua ekstraktor:
1.

Ekstraktor dengan ekstraktan lebih ringan dibandingkan rafinat

2.

Ekstraktor dengan ekstraktan lebih berat dibandingkan rafinat.

Ekstraksi Padat Cair

Ekstraksi padat cair merupakan tahapan penting dalam preparasi sampel maupun
penyediaan obat seperti tintura.
Secara sederhana ekstraksi jenis ini dilakukan dengan melarutkan langsung sampel padat
dalam pelarut tertentu lalu disaring. Filtratnya diuapkan hingga kering lalu jika perlu
residunya dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dan digunakan sebagai larutan uji.
Teknik pemisahan yang populer adalah ekstraksi menggunakan ekstraktor Soxhlet atau
ekstraktorKumagawa, dimana digunakan ekstraktan yang mudah menguap pada pemanasan
dan terkondensasi sehingga ekstraksi berjalan secara sinambung. Perlu
diperhatikan ketahanan analitdalam suasana panas.
Kedua ekstraktor mempunyai cara kerja yang sama.

Faktor yang harus diperhatikan

Pelarut pengekstraksi harus melarutkan bahan yang akan diekstraksi secara sempurna
( lihat kelarutannya dalam pelarut yang dimaksud).

Analit dalam sampel harus tahan panas yaitu tidak terurai oleh panas.

Volume pelarut pengekstraksi dalam A harus cukup agar tidak kering ( dapat dihitung
perkiraan volumenya seperti pada ekstraksi sinambung).

Pelarut pengekstraksi tidak atau sedikit saja melarutkan bahan lain selain analit yang
dimaksud.
Ekstraksi Fase Padat (SPE)

Ekstraksi pelarut sangat berguna dalam pemisahan analitik, namun masih mempunyai
beberapa kelemahan.

Misalnya pelarut yang digunakan terbatas pada pelarut yang tidak bercampur untuk
sampel larut air dengan jumlah yang cukup besar. Di samping itu pada praktek sering
terbentuk campuran emulsi pada saat pengocokan sehingga menyulitkan pemisahan kedua
pelarut.

Beberapa kelemahan ini dapat ditanggulangi dengan digunakannya ekstraksi fase padat
(Solid Phase Extraction)
Solid Phase Extraction
Keunggulan SPE

Ekstraksi lebih efisien (> 99.9%)

Pelarut lebih sedikit

Koleksi analit lebih mudah

Menghilangkan partikulat

Dapat diotomatisasikan

Dapat digunakan dalam penyimpanan sampel

Kelemahan SPE

SPE sangat beragam (sesuai pabrik, ukuran dan isinya)

Dapat terjadi adsorpsi irreversibel pada catridge.

Tahapan pemisahan SPE

Pengkondisian
Melewatkan pelarut untuk meningkatkan daya serap sorben (hidrofob)

Pemisahan dan Retensi

Memasukkan sampel, dimana analit akan tertahan dan beberapa komponen lain akan
tertahan juga

Pencucian

Membilas/menghilangkan komponen lain yang tertahan katridge dengan suatu pelarut

tertentu.

Elusi
Mengelusi analit dengan pelarut tertentu

Penampungan Analit

Derivatisasi
Derivatisasi merupakan proses preparasi sampel yang melibatkan reaksi kimia antara
analit dengan suatu pereaksi untuk mengubah sifat fisika dan kimia dari analit.
Tujuan derivatisasi dalam analisis adalah:
v Meningkatkan detektabilitas/daya ukur analit
v Mengubah struktur molekul atau polaritas agar dapat terukur dengan lebih baik
v Mengubah sifat matriks agar diperoleh pemisahan yang lebih baik.
v Meningkatkan stabilitas kepekaan analit.
Secara ideal proses derivatisasi harus cepat, kuantitatif mungkin, dan sedikit
menghasilkan produk samping yang mengganggu. Tentu saja kelebihan pereaksi tidak boleh
mengganggu analisis.
Persyaratan pereaksi derivatisasi

Pereaksi harus stabil

Pereaksi dan hasil samping derivatisasi yang terbentuk harus tidak terdeteksi/terukur
atau dapat dipisahkan secara sempurna dari hasil reaksi dervatisasi analit

Pereaksi harus reaktif dan kalau perlu selektif terhadap analit (pada kondisi percobaan)

Jika dimungkinkan, pereaksi harus aman dan tidak toksik

Prosedur derivatisasi harus dapat mampu diotomatisasikan

Jenis reaksi derivatisasi

Reaksi esterifikasi
Reaksi asilasi

 Reaksi kondensasi
Reaksi Sililasi
Reaksi alkilasi
Reaksi pembentukan senyawa siklik (siklisasi)
Reaksi penggabungan (coupling reaction)
Reaksi pembentukan kompleks yang berwarna atau sifat kromoforiknya meningkat.
Hasil reaksi derivatisasi tersebut pada umumnya meningkatkan sifat kromoforik, sifat
fluoroforik dan volatilitas analit.
Gugus fungsi dan hasil derivatisasinya
Ringkasan

Preparasi sampel merupakan tahapan analisis yang sangat menentukan akurasi dan
presisi hasil analisis.

Preparasi sampel mengubah sampel menjadi sesuatu bentuk yang adaptif dan sesuai
dengan metode pengukuran, meliputi pengubahan bentuk (derivatisasi ) yang akan
meningkatkan detektabilitas pengukuran.

Preparasi sampel juga meningkatkan akurasi dan presisi hasil melalui pemisahan analit
yang bebas dari pengaruh matriks dan analit yang lain.

Preparasi sampel sangat tergantung pada jenis sampel, sifat alami analit , kadar analit
dan metode pengukuran yang digunakan.