BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Metode Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental dengan rancangan atau
desain penelitian yang digunakan adalah rancangan Pretest-Postes dengan
kelompok kontrol (Pretets-Postets with Control Group) yaitu dilakukan
randomisasi pada kelompok kontrol dan kelompok eksperimen. Kemudian
dilakukan pretes atas kedua kelompok tersebut, dan diikuti intervensi kepada
kelompok eksperimen. Setelah beberapa waktu, dilakukan postes pada kedua
kelompok tersebut (Notoadmojo,2010).
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Automated Hematology
Analyzer, tabung eppendrof, mikro pipet, yellow tip, blender, panci infuse,
kompor, kain penyerkai (flanel), dan alat-alat gelas.
3.2.2

Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun tapak dara, EDTA,
kotrimoksazol, dan aquades.

3.3 Hewan percobaan

22

23

Hewam percobaan yang digunakan adalah tikus betina galur Wistar yang
berumur 2-3 bulan dengan bobot badan sekitar 200-250 gram sebanyak 35 ekor
yang diperoleh dari peternakan Institut Pertanian Bogor.
3.4 Pengumpulan Tanaman
Pengumpulan tanaman daun tapak dara(Catharanthus roseus [L.] G.Don)
yang diperoleh dari perkebunan Manoko Kecamatan lembang Kabupaten
Bandung, bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun
tapak dara (Catharanthus roseus [L.] G.Don).
3.5 Prosedur kerja
3.5.1 Determinasi
Determinasi tanaman daun tapak dara(Catharanthus roseus [L.] G.Don)ini
perlu dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan dalam
penelitian ini sesuai dengan tanaman yang dimaksud, sehingga menghindari
kesalahan pemilihan bahan tanaman tersebut. Determinasi tanaman dilakukan di
pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI).
3.5.2

Penafisan fitokimia
Penafisan fitokimiabertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit

sekunder yaitu golongan alkaloid, flavonoid, fenol, tannin,terpenoid, steroid,

triterpenoid, kuinon, dan saponin yang terkandung dalam daun tapak dara
1. Alkaloid

24

Simplisia ditambah amonia encer lalu digerus dalam mortir.

Tambahkan beberapa mili liter kloroform sambil terus digerus. Filtrate
di saring dan dikocok dengan asam klorida 2N. lapisan asam
dipisahkan kemudian diubah menjadi 3 bagian. Bagian pertama
digunakan sebagai blanko. Bagian kedua ditetesi dengan larutan
pereaksi mayer dan bagian ketiga ditetesi pereaksi drangendorff.
Terbentuknya endapan putih pada pereaksi mayer dan endapan jingga
coklat pada penambahan pereaksi dragendorffmenunjukan reaksi
positif adanya alkaloid.
2. Flavonoid
Simplisia digerus dalam mortir dipanaskan dengan air diatas penangas
air, kemudian disaring. Filtrat yang dihasilkan kemudian dimasukkan
kedalam tabung reaksi, setelah itu ditambahkan serbuk Zn, larutan
alkohol : HCl (1:1) dan amyl alkohol, kemudian campuran tersebut
dikocok kuat-kuat. Adanya flavonoid menyebabkan filtrat berwarna
merah, kuning atau jingga yang dapat ditarik oleh amyl alkohol.
3. Tanin dan Folifenol
Simplisia digerus dalam mortir dipanaskan dengan air diatas penangas,
kemudian disaring. Filtrat dibagi menjadi 2 bagian. Bagian pertama,
ditetesi dengan pereaksi besi (III) klorida. Terbentuknya warna biru
hitam menunjukan adanya tanin dan polifenolat. Bagian kedua
ditambahkan larutan glatin 1%. Adanya endapan putih menunjukan
bahwa dalam simplisia terdapat tannin.
4. Kuinon

25

Simplisia digerus dalam mortir dipanaskan dengan air diatas penangas,

kemudian disaring. Filtrat ditetesi dengan larutan NaOH. Terbentuknya
warna kuning hingga merah menunjukan adanya senyawa kuinon.
5. Triterpenoid dan Steroid
Simplisia disari dengan eter, sari eter kemudian diuapkan hingga
kering.

Pada

residu

ditetesi

pereaksi

Lieberman-bouchard.

Penambahan pereaksi dilakukan dalam keadaan dingin. Terbentuknya

warna ungu menunjukan bahwa dalam simplisia terkandung senyawa
triterpenoid, sedangkan bila terbentuk warna hijau biru menunjukan
adanya kelompok steroid.
6. Saponin
Simplisia ditambah air dan digerus dalam mortir, kemudian
dipindahkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan lagi sedikit air
dan dipisahkan. Setelah dingin tabung dikocok kuat selama beberapa
menit. Pembentukan busa sekurang-kurangnya setinggi 1cm dan
diamkan selama beberapa menit. Jika busa tidak hilang dengan
penambahan asam menunjukan adanya saponin.
7. Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid
Simplisia disari dengan eter, sari eter kemudian diuapkan hingga
kering. Pada residu ditetesi pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau
panilin-asam sulfat. Penambahan reaksi dilakukan dalam keadaan
dingin terbentuknya warna ungu menunjukan adanya senyawa
monoterpenoid dan seskuiterpenoid.
3.5.3

Penyiapan Hewan Percobaan

26

Sebelum percobaan, tikus diadaptasikan terlebih dahulu selama satu

minggu. Selama adaptasi tikus diamati kesehatanya dengan cara menimbang
bobot badan dan mengamati tingkah lakunya setiap hari. Tikus yang digunakan
dalam percobaan adalah tikus yang sehat yaitu tikus yang selama proses
pemeliharaan tersebut bobot badanya tetap atau tidak berubah tidak lebih dari
10%. Dan secara visual tidak menunjukan adanya kelainan tingkah laku dari
penyimpangan lainnya dan keadaan normal.
3.5.4

Pembuatan simplisia daun tapak dara

Daun tapak dara diperoleh dari tempat dan waktu yang sama daun tapak

dara dipisahkan dari tangkainya. Daun tapak dara kemudian di cuci dan di
keringkan, sehingga diperoleh simplisia daun tapak dara.

3.6 Pemberian zat uji pada hewan percobaan

3.6.1 Penentuan konsentrasi infusa daun tapak dara
Menurut Dalimartha (1999), dosis empiris daun tapak dara (Catharanthus
roseus [L.] G.Don), untuk pendarahan akibat trombositopenia adalah
sebanyak 15 gram.
Konversi ke tikus

= 15 gram x 0,018
= 0,27 gram/200 g BB tikus/2 mL.
Maka didapatkan konsentrasi dosis dengan variasi dosis yaitu :
Dosis I
= x 0,27 = 0,135 gram/200 g BB tikus
Dosis II
= 0,27 gram/200 g BB tikus
Dosis III
= 2 x 0,27 = 0,54 gram/200 g BB tikus
3.6.2

Penentuan dosis kotrimoksazol untuk menurunkan jumlah trombosit

tikus

27

Dosis kotrimoksazol untuk pengobatan pada manusia adalah sebesar 960

mg yang diberikan 2 kali sehari (Ganiswara, 2009), sehingga dosis
satukalinya adalah 960 mg. untuk berat badan orang dewasa sebesar 70 kg
dan berat badan tikus 200 gram, faktor konversi adalah 0,018. Sihingga
penetapan dosisnya adalah :
960 mg x 0,018
= 17,28 mg/200g
= 86,4 mg/kg BB
3.6.3

Pembuatan infusa daun tapak dara

Simplisia daun tapak dara ditimbang masing-masing sebanyak 0,135 g,

0,27 g dan 0,54 g, dicuci kemudian dimasukkan 100 mL air ditambah air ekstrak
sebanyak 2 kali bobot simplisia, dipanaskan dengan suhu 90 oc selama 15 menit
sambil sesekali diaduk, disaring selagi panas melalui kain kasa dan ditambah air
panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infusa 100 mL.
3.7 Pengambilan darah
Pengambilan darah hewan uji dilakukan pada vena ekor tikus dengan cara
memotong ekornya dengan memakai gunting bedah kemudian darahnya
ditampung pada tabung reaksi kecil. Sebelumnya terlebih dahulu tabung reaksi
ditambahkan EDTA 10% (Etilen Diamin Tetra Acid) sebagai antikoagulan
kemudian baru darah bisa ditampung pada tabung reaksi.

3.8 Perlakuan hewan uji

3.8.1 Pretets

28

Hewan uji sebanyak 35 ekor tikus dibagi secara random menjadi 6

kelompok. Setiap perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus. Sebelum dilakukan
perlakuan, trombosit awal (hari ke-0) seluruh tikus dihitung terlebih dahulu
dengan metode Automated Hematology Analyzer. Pembagian kelompok adalah
sebagai berikut :

Tabel 3.1 Pemberian kelompok hewan percobaan pretets

No.
I
II

Kelompok
Kontrol normal
(5 ekor)
KontrolInduksi
(5ekor)

Perlakuan
Diberi aquadest selama 8 hari 2,5 mL/200 g BB tikus
Diberi kotrimokszole selama 8 hari 86,4mg/kg BB (p.o)

III

Dosis 1
(5 ekor)

Diberi kotrimokszole selama 8 hari 86,4mg/kg BB (p.o)

IV

Dosis 2
(5 ekor)

Diberi kotrimokszole selama 8 hari 86,4mg/kg BB (p.o)

Dosis 3
(5 ekor)

Diberi kotrimokszole selama 8 hari 86,4mg/kg BB (p.o)

Pada hari ke-9 jumlah trombosit tikus dihitung kembali menggunakan

metode Automated Hematology Analyzer. Jumlah trombosit seluruh tikus pada
hari ke-0 di uji menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui normalitas data.
Jumlah trombosit hari ke-9 dan hari ke-0 pada kelompok kontrol normal dianalisis
dengan uji Paried T Test untuk mengetahui kebermaknaan perlakuan pada
kelompok kontrol normal. Selisih jumlah trombosit hari ke-9 dengan hari ke-0
pada semua kelompok dianalisis menggunakan uji One Way ANOVA pada taraf
kepercayaan 95%, dihasilkan nilai p=0,002 (berbeda bermakna) maka dilanjutkan

29

uji Post Hoc LSD pada taraf kepercayaan 95% pula untuk melihat kebermaknaan
antara 2 kelompok
3.8.2

Experiment
Tahap eksperimen merupakan tahap pemberian sediaan uji. Sediaan uji

diberikan secara p.o selama 3 hari, yakni pada hari ke-9, ke-10, dan ke-11.
Perlakuan terhada masing-masing kelompok adalah sebagai berikut :
Tabel 3.2 Pemberian kelompok hewan percobaan eksperiment
No.
I
II

Kelompok
Kontrol normal
(5 ekor)
KontrolInduksi
(5ekor)

III

Dosis 1
(5 ekor)

IV

Dosis 2
(5 ekor)

Dosis 3
(5 ekor)

Perlakuan
Diberi aquadest selama 3 hari 2,5 mL/200 g BB tikus
Diberi aquadest selama 3 hari 2,5 mL/200 g BB tikus
Diberi infusa daun tapak dara selama 3 hari 0,135 g/200 g
BB tikus (p.o)
Diberi infusa daun tapak dara selama 3 hari 0,27 g/200 g
BB tikus (p.o)
Diberi infusa daun tapak dara selama 3 hari 0,54 g/200 g
BB tikus (p.o)

3.8.3

Post Test

Jumlah trombosit pada hari ke-12 dihitung kembali menggunakan metode

Automated Hematology Analyzer. Jumlah trombosit hari ke-12 dan hari ke-9 pada
kelompok kontrol normal dan kelompok kontrol positif di analisis dengan uji
Paried T Test untuk mengetahui kebermaknaan perlakuan pada kelompok
tersebut. Selisish jumlah trombosit pada hari ke-12 dengan hari ke-9 semua
kelompok dianalisa menggunkan uji One Way ANAVO pada taraf kepercayaan

30

95%, dihasilkan nilai p<0,001 (berbeda bermakna) maka dilanjutkan dengan uji
Post Hoc LSD pada taraf kepercayaan 95% pula untuk mengetahui kebermaknaan
antara dua kelompok.

3.9 Analisis Data

Analisis data dilakukan untuk mengetahui perubahan jumlah trombosit
sebelum dan sesudah perlakuan infusa daun tapak dara. Pada hari ke-0, jumlah
trombosit tikus semua kelompok diuji Shapiro-Wilk untuk mengetahui normalitas
data semua kelompok. Jumlah trombosit kelompok normal pada hari ke-0, ke-9,
dan hari ke-12 diuji dengan uji Paried T Test. Selisih jumlah trombosit pada hari
ke-9 dengan hari ke-0 pada semua kelompok dianalisis menggunakan uji One
Way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc LSD pada taraf kepercayaan
95%. Jumlah trombosit pada ke-12 dan hari ke-9 pada kelompok kontrol normal
diuji menggunakan uji Paried T Test. Selisih jumlah trombosit sesudah perlakuan
infusa daun tapak dara (hari ke-12) dan sebelum perlakuan infusa daun tapak dara
(hari ke-9) pada semua kelompok dianalisis dengan uji One Way ANOVA.
Dihasilkan nilai p<0,001 (berbeda bermakna) maka dilanjutkan dengan uji Post
Hoc LSD untuk mengetahui kebermaknaan antara dua kelompok (Dahlan, 2008).