LTM 3 PEMILIHAN VEKTOR & HOST DAN METODE MUTAGENESIS

Desti Octavianthy (1406533586). Bioprocess Engineering, Department of Chemical Engineering,

University of Indonesia, Kampus Baru UI Depok, 16424, Indonesia

PENDAHULUAN

Mutagenesis merupakan suatu usaha pemuliaan galur mikroorganisme dengan cara memberi
perlakuan tertentu terhadap sel mikroorganisme sehingga terjadi perubahan dalam genotip maupun
fenotipnya. Mutasi yang terjadi dapat terjadi secara random atau terarah. Prinsip mutasi dengan rekayasa
genetik, yaitu informasi genetik yang dituju, diisolasi dari organisme donor dan dipotong menjadi bagian
tunggal menggunakan enzim restriksi. Potongan ini digabungkan di dalam suatu DNA pembawa (vektor)
dan selanjutnya bersama vector tersebut ditransfer ke dalam suatu sel inang (host). Sel inang akan
bereplikasi dan mensekresi metabolit yang sesuai dengan informasi genetik yang ditransfer sebelumnya.
Cytochrome c (CYT c) adalah hemoprotein kationik dari 100 residu asam amino yang menunjukkan
fleksibilitas fungsional yang luar biasa. Fungsi utamanya adalah transfer elektron dalam rantai respirasi.
Selain itu, CYT c juga diakui sebagai komponen kunci dari jalur apoptosis intrinsik, mesin protein oksidatif
mitokondria lipat, dan sebagai sensor redoks dalam sitosol. In vitro, interaksi langsung CYT c dengan
cardiolipin, modifikasi pasca-translasi seperti tirosin nitrasi, fosforilasi, metionin sulfoksidasi, dan mutasi
menyebabkan berbagai negara konformasi yang memiliki relevansi biologi. Identifikasi dari konformasi
alternatif dan penjelasan dari fungsi in vivo terus menjadi tantangan utama. CYT c mengalami perubahan
konformasi selama kondisi normal dan perubahan homeostasis seluler. Pada rantai transpor elektron
mitokondria, cyt.c berputar secara aksial dan radial dengan tiga tahap kecepatan yang bergantung pada rasio
lipid:protein rantai lipid asil, dari membran ganda sardiolipin yang mengikatnya.
Pemilihan Vektor

Vektor merupakan agen pembawa fragmen DNA masuk ke dalam sel makhluk hidup yang berfungsi untuk
memperbanyak fragmen DNA. Beberapa vektor kloning yang umum digunakan adalah plasmid, vektor
lamda, virus, kromosom bakteri buatan, kromosom khamir buatan, dan cosmid. Suatu vektor kloning harus
dapat disambungkan atau menyatu dengan fragmen DNA yang ingin ditransfer kemudian dapat dimasukkan
ke dalam sel.
Dalam memilih vector yang tepat, maka hal yang harus diperhatikan adalah :

Ukuran fragmen DNA yang akan ditransfer

Memiliki Selectable markers (penanda selektif)

Memiliki Restriction sites (situs restriksi)

1

Memiliki origin of replication (ori)

Memiliki multiple cloning site (MCS) dalam menjalankan fungsinya

Fungsi khusus dari suatu vector (dalam kasus ini compatible apabila mutagenesis dilakukan)

Inkompatibilitas (ketidaksesuaian)

Untuk vector yang digunakan untuk menginsersi gen mutan ke dalam host cell pada kasus yang diberikan,
maka diperlukan plasmid pET-24d. Vektor ini membawa sekuens N-terminal T7.Tag dan sekuens Cterminal opsional His.Tag. Vektor ini sedikit berbeda dari pET-21a-d (+), yaitu pada bagian selection
marker kanamisin dengan resistensi ampisilin. Vektor ini disediakan sebagai plasmid DNA yang
dimurnikan (10 mg). Setiap urutan pET DNA juga termasuk strain induksi kontrol (disediakan sebagai stok
gliserol). Vektor ini sering digunakan dan baik untuk ekspresi protein rekombinan.

Gambar 1. Peta Plasmid pET-24d beserta Restriction Sitenya

Sumber : www.neb.com

Molekul pET-24d ini berbentuk lingkaran untai ganda kecil, memiliki panjang 5307 bp, dan
memiliki sejumlah salinan yang tinggi. pET-24d adalah salah satu molekul vektor yang paling banyak
digunakan sebagai rekombinan dan dapat dengan mudah dibedakan dari non-rekombinan berdasarkan
perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan.
Alasan pemilihan plasmid pET-24d sebagai vector dalam kasus ini adalah karena plasmid pET-24d
memiliki keunggulan sebagai berikut :

Memiliki origin of replication (ori) untuk replikasi plasmid pada sel inang

Memiliki selectable markers (penanda selektif) yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke
dalam sel inangnya nanti dan cocok untuk gen mutan.

Memiliki Restriction sites (situs restriksi) dan multiple cloning site (MCS)

Ukuran yang sesuai, memiliki ukuran yang relatif kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang
sehingga dapat dengan mudah melintasinya.

Vektor ini mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan metode yang sederhana dan relatif murah (seperti
heat shock) dan dapat dengan cepat bereplikasi dan mudah diseleksi (Yanisch-Perron, 1985; Chung, et al.,
1989). Vektor ini juga compatible apabila mutagenesis dilakukan sehingga gen mutan dapat disisipkan
dalam plasmid dan dapat ditransformasi dengan baik ke dalam host cell.
Pemilihan Host Cell
Host cell merupakan sel inang yang cocok sebagai growth strain bagi vektor (plasmid). Host cell yang
digunakan dalam kasus yang diberikan untuk menyisipkan gen mutan melalui proses mutagenesis adalah
E. Coli BLD21(DE3). Strain BL21 adalah keturunan dari E. coli B saring dan secara khusus dibuat untuk
3

ekspresi tingkat tinggi dari protein rekombinan. Strain ini memiliki dua atribut penting yang membuat strain
ini ideal untuk ekspresi protein: penanda genetik dan inducibility ekspresi protein. Penanda genetik yang
paling penting membantu RNA rekombinan dan / atau protein mengakumulasi ke tingkat tinggi tanpa
degradasi. Inducibility membantu untuk meminimalkan efek racun dari beberapa protein rekombinan.
Alasan pemilihan E.Coli BLD21(DE3) ini adalah :
1.

Transformasinya efisien, strain ini memiliki tingkat efisiensi tinggi dengan besar transformasi
sebesar 15 x 107 cfu/g pUC19 DNA

2.

Disablement yang baik, memiliki penanda (marker).

3.

Dapat membuat replikasi plasmid berjalan dengan stabil.

4.

Resistant terhadap Phage T1

Kombinasi vector pET-24d dengan host cell E.Coli BLD21(DE3) telah sukses digunakan untuk ekspresi
sejumlah enzim rekombinan (Machielsen, et.al, 2006). Klon-klon pembawa gen mutan yang aktif secara
fungsional dapat diseleksi berdasarkan keberadaan penanda resisten antibiotic dan gen lac I pada vector.

Metode-Metode Mutagenesis

Mutagenesis didefinisikan sebagai perubahan dalam informasi genetik dari suatu organisme secara stabil
dengan menggunakan mutagen fisik dan kimia. Ini dikembangkan oleh Charlotte Auerbach. Yang
merupakan

ilmuwan

wanita

pertama

yang mempelajari

tentang pengaruh

mutagen

kimia.

Mutagenesis digunakan sebagai alat genetik untuk menginduksi mutasi pada cara-cara tertentu yang pada
gilirannya dapat digunakan untuk menentukan fenotipe organisme, fungsi gen dan bahkan nukleotida.
Mutasi dapat terjadi secara random atau terarah. Ada berbagai jenis metode mutagenesis, seperti :

DIRECTED MUTAGENESIS

Directed Mutagenesis didefinisikan sebagai perubahan kode asam amino di tingkat DNA. Struktur 3D
ditandai dari protein menggunakan X-Ray kristalografi dan prosedur analitis lainnya membantu dalam
menentukan asam amino dari protein harus diubah untuk mencapai properti tertentu. Namun, ini tidak
mungkin untuk sebagian besar protein dan karenanya strategi trial and error digunakan untuk membuat
perubahan dalam nukleotida untuk menghasilkan perubahan tertentu dalam protein.
Keuntungan :
- Harga Mutasi tinggi
- Semua mutasi dapat diinduksi
- Investigasi sistematis dan rinci dari mutasi ditargetkan dapat dibuat.

Protein

dikodekan,

kemudian

diuji

untuk

perubahan

yang

diinginkan

dalam

protein.

Berbagai jenis Directed Mutagenesis adalah:

a. Oligonukleotida Directed Mutagenesis Dengan M13 DNA
b. Oligonukleotida diarahkan Mutagenesis dengan Plasmid DNA.
c. PCR Amplified oligonukleotida Directed Mutagenesis
PCR Mutagenesis digunakan untuk mengubah urutan nukleotida metode DNA dan dapat digunakan
untuk mengubah asam amino untuk menguji fungsi dari domain dalam protein dan untuk menilai fungsi
promotor. Berbagai cara memperkenalkan mutasi pada PCR adalah Directed Mutagenesis Site. Seperti
namanya, metode ini memperkenalkan mutasi pada lokasi tertentu di primer DNA strand.
Keuntungan:
Metode berdasarkan PCR berguna dalam studi mutasi tertentu dalam DNA yang pada gilirannya berguna
dalam studi aspek yang berbeda dari fungsi protein
Akan tetapi, metode ini mempunyai keterbatasan, yaitu :
-

Mutasi DNA sulit untuk meniru sebagai sel kompeten yang akan digunakan adalah mahal.

Membutuhkan sequencing untuk mengkonfirmasi mutasi.

Primer spesifik diperlukan.

RANDOM MUTAGENESIS

Random Mutagenesis juga dikenal sebagai pemuliaan molekuler. Dalam hal ini gen yang non spesifik
berubah pada satu atau lebih tingkat kodon untuk menghasilkan campuran gen bermutasi yang pada
gilirannya dapat dipilih dan disaring untuk gen dengan aktivitas katalitik yang diinginkan. Oligonukleotida
primer adalah satu set heterogen urutan DNA untuk menghasilkan serangkaian mutasi di bagian
didefinisikan dari gen sasaran.
Keuntungan :
- Peran asam amino dalam kerja protein tersebut tidak diperlukan.
- Sejak berbagai mutan diproduksi dalam proses ini, beberapa protein yang menarik dan berguna dapat
dihasilkan.
Random mutagenesis terbagi menjadi beberapa jenis, yaitu :
1. Error-prone PCR. Pendekatan ini menggunakan " sloppy " versi PCR, di mana polimerase memiliki
tingkat kesalahan yang cukup tinggi (sampai 2%) untuk mengamplifikasi jenis sekuens. PCR dapat
menyebabkan kesalahan, termasuk meningkatkan MgCl2 dalam reaksi, menambahkan MnCl2 atau
menggunakan konsentrasi yang tidak sama dari masing-masing nukleotida. Setelah amplifikasi, urutan
pengkodean mutan harus dikloning ke dalam plasmid yang sesuai. Kelemahan dari pendekatan ini adalah
ukuran perpustakaan yang dibatasi oleh efisiensi langkah kloning. Meskipun mutasi titik adalah jenis yang
5

paling umum dari mutasi rawan kesalahan PCR, penghapusan memungkinkan. Ada sejumlah error-prone
PCR kits tersedia, termasuk dari Stratagen dan Clontech.
2. Rolling circle error-prone PCR adalah varian dari error-prone PCR di mana jenis sekuen pertama
dikloning ke plasmid, maka seluruh plasmid diperkuat dalam kondisi error-prone. Amplifikasi seluruh
plasmid kurang efisien daripada memperkuat urutan coding sendiri.
3. Strain mutator. Dalam pendekatan ini jenis sekuen yang dikloning ke plasmid berubah menjadi strain
mutator, seperti Stratagen XL1-Red. XL1-merah strain E.coli yang kekurangan tiga dari jalur perbaikan
DNA primer (muts, mutD dan Mutt) menyebabkannya untuk membuat kesalahan selama replikasi dari itu
DNA, termasuk cloning plasmid. Akibatnya setiap salinan plasmid direplikasi di strain ini memiliki potensi
untuk menjadi berbeda dari tipe lain. Salah satu keuntungan dari strain mutator adalah berbagai mutasi
dapat dimodifikasi termasuk substitusi, delesi dan frame-shift. Kelemahan dengan metode ini adalah strain
menjadi semakin lemah karena terakumulasi semakin banyak mutasi di dalamnya genom sendiri sehingga
beberapa langkah pertumbuhan, plasmid isolasi, transformasi dan pertumbuhan kembali yang biasanya
diperlukan
4. Temporary mutator strains. Temporary mutator strains dapat dibuat dengan mengekspresikan alel
mutator seperti mutD5 (versi negatif dominan mutD) yang membatasi kemampuan sel untuk memperbaiki
lesi DNA. Dengan mengungkapkan mutD5 dari promotor diinduksi adalah mungkin untuk memungkinkan
sel untuk siklus antara mutagenik (mutD5 ekspresi) dan normal (mutD5 ekspresi off) periode pertumbuhan.
Periode pertumbuhan yang normal memungkinkan sel untuk pulih dari mutagenesis, yang memungkinkan
strain ini tumbuh selama lebih dari strain mutator konvensional. Jika plasmid dengan asal suhu-sensitif
replikasi digunakan, plasmid mutagenik dapat dengan mudah dihapus mengembalikan perbaikan DNA
normal, yang memungkinkan mutan yang akan ditanam untuk analisis / skrining.
5. Insertion mutagenesis. Finnzymes memiliki kit yang menggunakan sistem berbasis transposon secara
acak memasukkan sepasang urutan 15-base seluruh urutan kepentingan, baik itu insert terisolasi atau
plasmid. Ini menyisipkan 5 kodon ke urutan, memungkinkan setiap gen dengan penyisipan untuk
diekspresikan (yaitu tidak ada frame-shift atau menghentikan kodon yang penyebabnya). Oleh karena
penyisipan adalah acak, setiap salinan dari urutan akan memiliki sisipan yang berbeda dan menghasilkan
sejumlah besar mutan dengan mencakup biaya rendah dan kecepatan yang tinggi.
6. Ethyl methanesulfonate (EMS) adalah mutagen kimia. EMS aklylates residu guanidin, menyebabkan
mereka harus benar disalin selama replikasi DNA. Sejak EMS langsung kimiawi memodifikasi DNA, EMS
mutagenesis dapat dilakukan baik secara in vivo (yaitu seluruh sel mutagenesis) atau in vitro. Contoh in

vitro mutagenesis dengan EMS di mana gen PCR mengalami reaksi dengan EMS sebelum diikat ke plasmid
dan ditransformasikan.
7. Nitrous acid adalah mutagen kimia lain. Kerjanya dibantu oleh adenin dan sitosin residu yang dapat
menyebabkan titik transversi mutasi (A / T untuk G / C dan sebaliknya).
8. DNA shuffling adalah metode yang sangat kuat di mana salinan gen yang sama masing-masing dengan
berbagai jenis mutasi secara acak dikocok. Hal ini dilakukan acak dengan DNA sel kemudian secara acak
kembali bergabung dengan fragmen menggunakan self-priming PCR.
Metode yang Digunakan (Dipilih)
Site-directed mutagenesis adalah metode biologi molekuler yang digunakan untuk membuat perubahan
tertentu dan disengaja untuk urutan DNA dari gen dan produk gen. Site-directed mutagenesis disebut juga
spesifik lokasi mutagenesis atau oligonukleotida diarahkan mutagenesis, digunakan untuk menyelidiki
struktur dan aktivitas biologis DNA, RNA, dan molekul protein, dan untuk rekayasa protein. Site-directed
mutagenesis adalah salah satu teknik yang paling penting dalam laboratorium untuk memperkenalkan
mutasi ke urutan DNA. Namun, dengan mengurangi biaya sintesis oligonukleotida, sintesis gen buatan
sekarang, terkadang digunakan sebagai alternatif untuk site-directed mutagenesis.
PCR site-directed mutagenesis
Keterbatasan situs pembatasan dalam cassette mutagenesis dapat diatasi menggunakan polymerase
chain reaction (PCR) dengan oligonukleotida primer, sehingga sebuah fragmen yang lebih besar dapat
dihasilkan, meliputi dua situs restriksi. Amplifikasi eksponensial dalam PCR menghasilkan fragmen yang
mengandung mutasi yang diinginkan dalam jumlah yang cukup untuk dipisahkan dari aslinya, plasmid
unmutated dengan elektroforesis gel, yang kemudian dapat dimasukkan dalam konteks aslinya
menggunakan teknik biologi molekuler rekombinan standar. Ada banyak variasi teknik yang sama.
Metode yang paling sederhana menempatkan situs mutasi ke salah satu ujung fragmen dimana salah
satu dari dua oligonukleotida digunakan untuk menghasilkan fragmen mengandung mutasi. Ini melibatkan
satu langkah dari PCR, tetapi masih memiliki masalah yang melekat memerlukan situs pembatasan cocok
dekat lokasi mutasi kecuali primer yang sangat panjang digunakan. variasi lain, oleh karena itu,
mempekerjakan tiga atau empat oligonukleotida, dua di antaranya mungkin oligonukleotida non-mutagenik
yang mencakup dua situs restriksi nyaman dan menghasilkan sebuah fragmen yang dapat dicerna dan
diligasi ke plasmid, sedangkan oligonukleotida mutagenik mungkin melengkapi lokasi dalam fragmen yang
jauh dari situs pembatasan.

Metode ini memerlukan beberapa langkah dari PCR sehingga fragmen final yang akan diligasi dapat
berisi mutasi yang diinginkan. Proses desain untuk menghasilkan fragmen dengan mutasi yang diinginkan
dan situs restriksi yang relevan dapat menjadi rumit. Site-directed mutagenesis sangat berguna untuk
menjelaskan fungsi dari gen atau protein, atau untuk menciptakan varian enzim dengan fungsi baru dan
ditingkatkan. Sekarang ada banyak pendekatan yang tersedia untuk menghasilkan mutan site directed.
Teknik yang akan memungkinkan untuk menghasilkan berbagai mutasi, yaitu diantaranya :

Teknik 1 : PCR dengan primer yang telah dimodifikasi

Jenis site-directed mutagenesis menggunakan primer PCR dirancang untuk mengandung perubahan yang
diinginkan. PCR primer urutan hanya menggantikan urutan asli, dengan syarat adanya perubahan yang
cukup minimal untuk memungkinkan primer untuk anil untuk sasaran yang dituju.
Syarat penggunaan :

Limited base identity berubah pada akhir urutan target

5 'atau 3' sisipan terminal <100 basa

Teknik 2 : Ekstensi Primer PCR

Gambar 2. Ekstensi primer PCR

Sumber : www.neb.com

Ekstensi primer menggunakan nested primer untuk mutasi daerah sasaran. Dalam diagram, primer
B dan C mengandung urutan mis-matched untuk menyisipkan basa. Putaran pertama PCR menggunakan
primer A-B dan C-D untuk membuat dua produk dengan urutan mutasi.

Tahap kedua PCR adalah di mana urutan baru dibuat. Karena primer B dan C mengandung urutan
komplementer, produk dari putaran pertama akan berhibridisasi setelah mereka berubah sifatnya mengikuti
siklus PCR pertama. Primer A-D kemudian dapat digunakan untuk memperkuat produk yang sangat
panjang yang berisi mutasi yang diinginkan. Perubahan metode ini juga dapat membuat penghapusan atau
penambahan kembali.
Syarat penggunaan :

Terbatas, non-random basa mengubah internal menjadi sekuens target

Insersi >100 basa

Delesi < 50 basa

Delesi > 50 basa

Teknik 3 : Invers PCR

Inverse PCR digunakan untuk bermutasi plasmid. Metode ini menggunakan dua primer back-to-back untuk
memperkuat seluruh plasmid dan produk linear kemudian diikat kembali ke bentuk melingkar. Primer
daerah yang mengikat dapat diubah dengan mengubah urutan primer mengandung mutasi yang diinginkan.
Sisipan dapat dibuat di sekitar daerah mengikat primer dengan menambahkan urutan mengapit ke primer,
dan penghapusan dapat dilakukan dengan hanya menyisakan ruang antara dua primer.
Syarat penggunaan :

Insersi > 100 basa

Delesi < 50 basa

Delesi > 50 basa

Site directed mutagenesis, ekspresi protein, dan purifikasi dalam pemicu (iso-1-sitokrom c)
Asli ragi iso-1-sitokrom c (Tipe VIII-A) dibeli dan digunakan tanpa purifikasi lanjutan. Mutagenesis
terarah digunakan untuk menghasilkan bentuk mutan ragi iso-1-sitokrom c. Iso-1-sitokrom c dinyatakan
dalam Saccharomyces cerevisiae galur GM3C-2 dan dipurifikasi. Struktur primer dan kemurnian mutan
dibuktikan dengan menggunakan UV-visible spectroscopy, SDS PAGE, electro-spray ionization mass
spectrometry. Purifikasi protein disimpan pada suhu -800C.
Purifikasi sitokrom c sepenuhnya teroksidasi dengan penambahan NH4 [Co (dipicolinate) 2] sekitar
2 mg protein dan dihilangkan garamnya menggunakan gel kromatografi filtrasi (PD-10, Pharmacia) untuk
menghapus oksidan. Sampel kemudian dibawa ke protein konsentrasi 50 WM dalam fosfat atau natrium
buffer asetat. Protein sepenuhnya berkurang disiapkan dengan menambahkan 50 setara (7.88 mM
konsentrasi akhir) dari dithiothreitol untuk kedua protein sampel dan buffer berjalan segera sebelum
melakukan percobaan DSC. Konsentrasi protein untuk kedua sampel teroksidasi dan berkurang yang
9

diperoleh pada spektrofotometer Cary 1 Bio UV-terlihat menggunakan cuvettes kuarsa dengan jalur optik
1-cm. Absorbansi pada 410 nm diukur dan konsentrasi protein kemudian dapat dihitung.

REFERENSI

B.T. Nall, 1996. Cytochrome c folding and stability, in: G.A. Mauk, R.A. Scott (Eds.), Cytochrome
c: A Multidisciplinary Approach. University Sciences Press, Sausalito, pp.167-200.

C. Marc, Lett. 1999. Rational design of a more stable yeast iso-1-cytochrome c. Department of
Chemistry, University of Waterloo, Waterloo, Ont. N2L 3G1, Canada

Hemsley A et al (1989) A simple method for site-directed mutagenesis using the polymerase chain
reaction. Nucleic Acids Res. 17(16):6545-6551

Ho SN et al (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain

reaction. Gene 77(1):51-59

Integrated DNA Technologies, 2011. Mutagenesis Application Guide. Dalam www.neb.com

(diakses pada 29 Oktober 2016)

Kadowaki H, et al (1989). Use of polymerase chain reaction catalysed by Taq DNA Polymerase for
site-specific mutagenesis Gene 76(1):161-166

Novagen. 2002. pET-24d Mapping dalam www.novagen.com (diakses pada 30 Oktober 2016)

R.L. Cutler, G.J. Pielak, A.G. Mauk, M. Smith. 1987. Protein Eng. 1, pp 95-99.

Robert, Agustinus. 2006. Metode Mutagenesis. Squalen Vol.1 No.1

S.C. Inglis, J.G. Guillemette, J.A. Johnson, M. Smith.1991. Protein Eng. 4 pp 569-574

W.A. McGee, F.I. Rosell, J.R. Liggins, S. Rodriguez-Ghidarpour,. Y. Luo, J. Chen, G.D. Brayer,
A.G. Mauk, B.T.Nall. 1996. Biochemistry 35 pp 1995-2007.

10