MAKALAH

BIOKIMIA ANALISIS DAN KETEKNIKAN BIOKIMIA

PEMISAHAN SECARA DIALISIS IN VITRO

ROSALENA FRANSISKA
G851160071

Dosen: Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

I PENDAHULUAN

Pemisahan molekul dari bahan biologis merupakan bagian penting dari

penelitian biokimia, dan banyak melibatkan isolasi senyawa yang mempunyai
kemiripan sifat. Metode yang biasa dari kimia organik tidak lagi memadai
sedangkan teknik-teknik fisika yang digunakan untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan kecil dalan sifat-sifatnya. Secara umum kondisi ekstrem
dari pH, suhu, pelarut organik dan pengunaan senyawa pengoksidasi dan pereduksi
harus dihindari ketika melakukan pemisahan molekul dari bahan-bahan hidup,
sebab hal ini berisiko menyebabkan hilangnya aktivitas biologi melalui proses
denaturasi
Studi In Vitro
Metode ini meliputi inkubasi bahan-bahan biologis dalam lingkungan fisik
dan kimia buatan. Istilah in vitro dapat diterapkan pada preparas enzim, organela,
mikroorganisme utuh, dan organ hewan dan tumbuhan. Faktor lingkungan dapat
diatur untuk memacu tingkat pertumbuhan, diferensiasi dan perkembangan pada
batas tertentu seperti yang terjadi didalam sel, jaringan dan organ hewan dan
tumbuhan. Pemahaman yang paling mendasar bahwa kultur sel mefasilitasi
penelitian pontensim perkembangan sel (totipotesi) seperti kemampuan sel dalam
membentuk beberapa jenis sel yang berbeda dalam satu jenis sel yang berbeda
dalam satu organisme, yang diberi perlakundengan suatu kimia dan linkungan fisik
tertentu. Secara umum, ulasan percobaan secara in vitro mungkn dapat diterapkan
untuk keadaan in vivo

II PEMBAHASAN

Dialisis adalah suatu teknik pemisahan dengan cara menggunakan membran

yang memisahkan dua fasa cairan. Membran tersebut bersifat semipermeabel
terhadap partikel solute. Partikel solut berpindah melalui membran ke larutan
dengan konsentrasi rendah. Dialisis digunakan untuk memisahkan garam-garam
dari suspensi dalam biokimia dengan tujuan mencegah koagulasi.
Metode Dialisis digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang besar
dari molekul-molekul yang berukuran kecil. Suatu membram semi permeabel
membiarkan molekul-molekul kecil keluar melaluinya, tetapi mencengah molekulmolekul yang besar melalui membrab tersebut. Dalam suatu percobaan, campuran
dari molekul-molekul besar dan kecil ditempatkan dalam suatu kantong dialisis
yang dicelupkan kedalam pelarut berair dalam jumlah yang lebih banyak. Molekulmolekul yang berukuran kecil akan keluar dari membran semipermeabel kedalam
pelarut atau buffer sampai tercapai keseimbangan antara cairan didalam dan diluar
kantong (Gambar 1) campuran dari molekul-molekul ini dapat dibebaskan dengan
melakukan dialisis terhadap air yang melir atau dengan berulangan kali
mengantikan pelarutnya.
FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KECEPATAN DIALISIS
Kecepatan dialisis tergantung pada faktor-faktor sebagai berikut
1. Membran.
Selofan bahan yang umum digunakan sebaga membran dalam proses dialisis.
Selofan ini merupakan tabung yang dibuat oleh Visking Division dari Unio
Carbide.
Membran selofan mengandung sejumlah kecil senyawa-senyawa sulfur,ion
logam, dan beberapa enzim, oleh karena itu dianjurkan agar setiap tabung
dididihkan selama 30 menit dalam alkali EDTA (Na2CO3 10 g/L, EDTA 1 mmol/L)
untuk mecegah hilangnya aktivitas molekul-molekul yang didialisis. Setelah
didinginkan, tabung-tabung tersebut lalu dicuci dengan aquades, kemudian salah
satu ujungnya diikat dengan benang rami (gambar 1). Tabung yang berbentuk

kantung diisi dengan bahan yang akan didialis, dan ujung yang satunya diikat lagi.
Dialisis paling baik dilakukan dengan tabung yang baru saja disiapkan, karena bila
sudah basa, kantung akan peka terhadap serangan mikroorganisme. Jika harus
disimpan, maka kantung selofan harus disimpan dalam larutan yang telah dibubuhi
sedikit asam benzoat sebagai pengawet.

Kantung dialisis
yang diikat kedua
ujungnya

.
..
. ..
.
.
. .. .
.
.
. .
.

Campuran yang
dipisahkan
Pelarut
aquaeous (air,
larutan bufer)

Magnet
Pengaduk
bermagnet

Gambar 1. Dialisis campuran yang mengandung molekul besar () dan molekul

kecil ()

Batas permeabilitas dari tabung visking yang telah dipersiapkan, tergantung

pada ukuran dan perlakuan awal. Membran dapat dipakai jika bersifat permeabel
bagi senyawa-senyawa yang berat molekulnya dibawah 30.000 dan bila dialisisnya
dilakukan dari malam sampai pagi hari. Pada prakteknya, tidak ada ketentuan yang
pasti bahwa molekul yang lebih besar dapat berdifusi melalui membran tersebut
bila waktu dialis diperpanjang. Terdapat sejumlah bahan-bahan komersial dengan
laju alir yang tingi dan batas-batas yang cukup jelas untuk permeabilitas yang dapat
digunakan dalam pemisahan-pemisahan yang lebih halus

2.

Pelarut
Pada umumnya, kecepatan dialis akan maksimal jika menggunakan pelarut

aquades, meskipun kecepatan dialisis suatu larutan ditentukan oleh pH dan

kekuatan ionisasi zat terlarut yang diperlukan untuk menstabilkan molekul-molekul
yang didialisis.
Selama dialisis terjadi, proses osomosis menyebabkan masuknya air kedalam
kantong dialisis, sehingga kantung dialisis selalu terisi penuh sebelumnya untuk
menghidari terjadinya pengenceran yang berlebih dari molekul-molekul yang ada
di kantung analisis. Jika larutan pekat dari suatu senyawa yang inert dengan berat
molekul yang tinggi digunakan sebgai larutan pengganti, maka air dalam katung
dialisis akan keluar karena terjadinya osomosis. Pada kondisi ini yang banyaknya
kira-kira 200 mL dapat keluar dari kantug dialisis dalam waktu semalam, sehingga
yang tinggal hanya beberapa mL di dalam kantung. Dalam hal ini terjadi pemekatan
didalam katung.
3.

Sifat-sifat Fisik
Kecepatan dialisis juga tergantung pada suhu, sehingga semakin tinggi suhu

disekitarnya, maka semakin tinggi pula kecepatan dialisisnya. Jika suhu

ditingkatkan , maka viskositas dari pelarut berkurang, sehingga kecepatan dialisis
meningkat. Sebaliknya, banyak makromolekul yang sensitif terhadap terhadap
suhu, jadi dialisis terhadap protein dan sebagainya selalu dilakukan pada suhu yang
lebih rendah (dalam kondisi dingin atau di dalam ruangan berpendingin)
Pemisahan antara molekul-molekul byang besar dan kecil dapat pula oleh
tekanan atau perubahan yang terjadi pada membran. Hal ini dapat dilakukan secara
mudah dengan menempatkan kantung dialisis dalan suatu ruang vakum. Air dan
molekul-molekul yang kecil akan keluar dari kantung dialisis menembus membran,
membentuk suatu ultrafiltrasi, sedangkan molekul-molekul yang besar tetap akan
tertinggal di dalam kantung dalam keadaan terkonsentrasi. Proses seperti ini dikenal
dengan nama ultrafiltrasi.
4.

Kesetimbangan membran Donnan

Bila suatu larutan makromolekul seperti protein dipisahkan dari suatu larutan

garam dengan membram semipermeabel, maka protein yang bermuatan listrik tidak
dapat menembus membran tersebut, akan tetapi ion-ionnya yang muatan yang

berlawanan cenderung dapat menembus membran. Hal ini mengakibatkan suatu

distribusi yang tidak merata dari ion-ion dan akan terjadi suatu perbedaan
pontensial listrik melalui membran.
Efek Donnan merupakan dasar dari fenomena listrik dalam fisiologi. Akan
tetapi efek ini tidak mudah diamati (sulit terjadi) bila dialisisnya dilakukan dengan
menggunakan aquades sebagai pelarutnya dan terjadi perubahan pH. Misalnya,
apabila suatu larutan protein yang bermuatan negatif dalam larutan NaCl didialisis
dalam aquades (yang ada diluar dialisis), maka protein ini tidak dapat menembus
dinding kantung, akan tetapi ion-ion yang bermuatan positif (Na+) bebas untuk
menembus dinding kantung dialisis. Hal ini akan mengakibatkan kelebihan kation
diseluruh medium, dan muatn elektrik medium akan dinetralisasi. Air berionisasi,
dan ion-ion hidrogen bermigrasi masuk kedalam kantung dialisis. Dengan demikian
pH didalam protein kompartemen ( medium yang didalam kantung mengandung
protein) mengalami penuruna, sedangkan yang berada di luar kantung mengalami
kenaikan (Gambar 2)
Membran semipermeabel

Kantung dialisis

Protein

+
Na
Protein

Lingkungan medium

Na

H2O

Na
Air garam

Cl
pH menurun

Na

Cl

H + OH

pH meningkat

Gambar 2. Efek donnan terlihat ketika larutan protein berada didalam larutan garam
yang akan didialisis berlawanan dengan aquades

Apabila protein didalam kantung dialisis bermuatan positif, maka perubahan pH

yang akan terjadi sebaliknya, perubahan-perubahan pH seperti ini tidak
dikehendaki, dan mengakibatkan presipitasi atau denturasi protein.
Distribusi yang tidak merata dari ion-ion ini tidak dikehendaki, untuk
mengurangin efek donnan ini, dialisis sering kali dilakukan terhadap larutan-larutan
dengan konsentrasi garam yang kadarnya sedang (lebih kecil dari 1 mol/L). Skema
efek Donnan ketika larutan protein dalam larutan garam NaCl didialisis dengan
aquades ditunjukan pada gambar 2.

APLIKASI DIALISIS DALAM TEKNIK PEMISAHAN BIOKIMIA

1.

Pemisahan Protein Albumin Dan Globulin Dari Larutan Garam

Dengan Teknik Dialisis
Jenis protein globular yaitu globulin dan albumin. Albumin adalah protein

yang dapat larut dalam air serta terkoagulasi oleh panas. Larutan albumin dalam air
dapat diendapkan dengan penambahana monium sulfat hingga jenuh. Albumin
antara lain terdapat pada serum darah dan putih telur. Globulin mempunyai sifat
sukar larut dalam air murni, tetapi dapat larut dalam larutan garam netral, misalnya
NaCl encer. Larutan globulin dapat diendapkan dengan penambahan garama
monium sulfat hingga setengah jenuh. Globulin akan mengendap dan dapat
dipisahkan. Seperti albumin, globulin antara lain terdapat dalam serum darah, pada
otot, dan jaringan lain. Molekul globulin mempunyai berbagai macam bentuk. Ada
molekul globulin yang terdiri atas rantai tunggal polipeptida saja, seperti albumin.
Akan tetapi, cukup banyak juga yang terdiri atas beberapa subunit, seperti
hemoglobin. Ada pula molekul globulin oligomer (yang terdiri atas beberapa
subunit polipeptida) yang mempunyai susunan yang lebih rumit lagi daripada
hemoglobin, karena subunit penyusunannya tidak sama panjang. Molekul seperti
ini misalnya ialah berbagai jenis imunoglobulin (Ig). Bahkan ada lagi globulin yang
juga tergolong ke dalam kelompok Ig ini, yang mempunyai susunan sangat rumit,
seperti imunoglobulin M (IgM).

Dialisis adalah proses perpindahan molekul terlarut dari suatu campuran

larutan yang terjadi akibat difusi pada membran semi-permeabel. Molekul terlarut
yang berukuran lebih kecil dari pori-pori membran tersebut dapat keluar, sedangkan
molekul lainnya yang lebih besar akan tertahan di dalam kantung membran.
Metode dialsis banyak digunakan dalam pemurnian protein (terutama enzim).
Dalam proses ini, dialisis digunakan untuk menghilangkan molekul garam, seperti
amonium sulfat, sebelum dilanjutkan dalam proses pemurnian berikutnya ataupun
pada tahap akhir pemurnian. Pada praktikum kali ini, albumin dan globulin diambil
dari serum sapi yang dipisahkan dengan teknik Salting Out. Setelah dipisahkan dari
serum, albumin dan globulin dibersihkan dari larutan garam dengan cara dialisis.
Percobaan ini bertujuan untuk memisahkan protein dari serum kemudian
memurnikan protein dari garam yang terlarut dengan teknik dialisis.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan alat dalam praktikum ini antara lain, serum sapi, ammonium sulfat
kristal, BaCl, HCl, aquades, kertas saring, corong, gelas kimia, selofan, dan alat
elektroforesis Helena.
pemisahan protein
dengan teknik
Salting Out

pemisahan protein
dari garam dengan
teknik dialisis

elektroforesis

Gambar 3. Bagan permunian Protein

HASIL DARI DIALISIS

Selofan yang berisi presipitat dan filtrat direndam dalam aquades yang ditempatkan
pada gelas kimia. Proses ini dilakukan untuk menghilangkan garam-garam yang
terlarut pada presipitat dan filtrat. Aquades yang digunakan untuk merendam
diganti setiap hari hingga kandungan sulfatnya tidak ada lagi. Untuk mengetahui
ada atau tidaknya sulfat dilakukan dengan mereaksikan aquades yang digunakan
untuk merendam dengan HCl dan BaCl, apabila hasilnya berwarna putih, artinya
sulfat masih ada, namun apabila hasilnya tetap bening maka artinya sulfatnya sudah
tidak ada.

Gambar 2. Selofan yang direndam dalam aquades

2.

PEMURNIAN ENZIM KITINASE

Pemurnian enzim bertujuan untuk memisahkan enzim yang dikehendaki

dari enzim lain yang tidak diinginkan. ada tiga strategi yang harus diperhatikan
dalam pemurnian enzim: 1) kualitas, perlu tindakan untuk mempertahankan
aktivitas enzim dengan mengurangi proteolisis dan denaturasi, 2) kuantitas, perlu
diperhatikan jumlah pemakaian akhir protein murni, dan 3) ekonomis, perlu
dipertimbangkan biaya apabila diterapkan dalam skala laboratorium maupun
industri.
Pemurnian enzim umumnya dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu:
fraksinasi dengan garam atau pelarut organik, sentrifugasi, dialisis, dan pemisahan
dengan kromatografi kolom.

Langkah-langkah pemurnian enzim sebagai berikut:

Pengendapan dengan Amonium Sulfat
Pengendapan dengan garam anorganik atau pelarut organik bertujuan
untuh meningkatkan konsentrasi enzim dan merupakan langkah awal proses
pemurnian enzim. Prinsip pengendapan dengan amonium sulfat berdasarkan pada
kelarutan protein yang merupakan interaksi antara gugus polar dengan molekul air,
interaksi ionik protein dengan garam dan daya tolak menolak protein yang
bermuatan sama. Berdasarkan fenomena ini, proses

kelarutan protein terbagi dua

yaitu: proses salting in dan salting out. Kelarutan protein pada pH dan suhu tertentu

akan meningkat saat konsentrasi garam meningkat sampai pada konsentrasi tertentu
(salting in). Selanjutnya pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu,
kelarutan protein akan menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan
ion-ion garam semakin banyak sehingga terjadi penarikan air yang mengelilingi
permukaan protein. Peristiwa pengendapan ini mengakibatkan protein saling
berinteraksi, berdegradasi, dan mengendap (Harris, 1989; Scopes, 1987) seperti
terlihat pada (Gambar 3). Filtrat enzim yang telah dijenuhi dengan amonium sulfat
dibiarkan satu malam pada suhu 4oC agar protein terdegradasi dan mengendap
sempurna, endapan yang diperoleh adalah protein (Scrimgeour, 1977).
pelarut

Sel Hidrat

Garam masuk
Garam keluar

Konsentrasi Garam

Gambar 3. Proses pengendapan protein (Koelman dan Roehm, 2005)

2.

Dialisis
Pemurnian enzim tidak menghendaki adanya kelebihan garam, oleh karena
itu garam yang tersisa dari proses pengendapan dipisahkan dengan cara dialisis.
Dialisis merupakan metode yang paling dikenal untuk menghilangkan molekul
pengganggu, seperti garam atau ion-ion lain yang berukuran kecil (Gambar 4).

Larutan
Protein

Stirer

Kantung Dialisis

Larutan Bafer

Gambar 4. Proses pemisahan protein dengan dialisis (koelman dan Roehm, 2005)

Proses dialisis ini dapat terjadi karena konsentrasi garam lebih tinggi di
dalam membran dialisis daripada di luar membran, sehingga menyebabkan larutan
penyangga atau air masuk ke dalam dialisat. Hal ini terjadi pada awal proses
dialisis. Selanjutnya garam akan keluar melalui membran hingga tercapai kondisi
keseimbangan. Setelah proses dialisis kadang terjadi penurunan aktivitas enzim
yang kemungkinan disebabkan oleh hilangnya ion penting yang dapat berfungsi
mengaktifkan enzim atau disebut sebagai kofaktor

III KESIMPULAN

Adapun kesimpulan dari makalah ini adalah sebagai berikut

1.

Prinsip dasar dari dialisis ini adalah perbedaan molekul-molekul atar

membram semipermeabel dapat dilalui oleh molekul kecil dan dapat menahan
molekul besar. Alat yang digunakan yaitu wadah tertutup terbuat dari bahan
semipermeabel (sperti selofan), gelas piala.

2.

Laju dialisis ddipengaruhi oleh, membran, pelarut, sifat-sifat kimia dan

kesetimbangan membran Donnan

3.

Aplikasi dialisis digunakan untuk proses pengendapan dan permurnian

protein maupun enzim dari senyawa yang tidak diinginkan.

DAFTAR PUSTAKA

Bintang, Mariah. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga

Lehninger, L. A., 1982, Dasar-Dasar Biokimia, alih bahasa oleh Thenawidjaja, M,
144-146, Erlangga: Jakarta.
Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Supriyanti. 2007. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta:
UI press.