Optimasi metode HPLC untuk penentuan cefixime menggunakan 2thiophenecarboxaldehyde sebagai derivatizing reagen: Sebuah pendekatan

baru
Abstrak
Penentuan cefixime memiliki kepentingan klinis dan analitik akibat spekrum
aktivitas antimikroba yang luas dan stabil. Cefixime adalah anggota penting dari
oral aktif generasi ketiga sepalosporin dan memiliki aktivitas yang sangat baik
terhadap berbagai patogen. Itu untuk pertama kalinya bahwa kami telah
mengembangkan metode HPLC-DAD baru untuk analisis turunan imin cefixime
dengan menggunakan metode refluks pada 100C selama 50 menit tanpa larutan
penyangga. 2 TCA digunakan pertama kali sebagai reagen untuk derivatisasi obat
cefixime. Selanjutnya, pemisahan tiga kompenen, obat (cefixime), reagen
(2TCA), dan derivat dilakukan dengan menggunakan kromasil 100 C-18 (15 mm
x 0,46 mm, 5 m) kolom dengan elusi isokratik methanol: 0,1% asam format
encer (70:30 v/v) dengan laju alir 1 ml min-1 pada waktu retensi 1,8;2,4;dan 3,3
menit, masing-masing; sementara, total waktu nya adalah 5 menit. Metode yang
dikembangkan adalah berulang dengan standar deviasi relatif (RSD) dari 0,811,88% untuk turunan imin. Batas deteksi dan kuantifikasi turunan imin diperoleh
dalam kisaran 0,32-0,401 mg ml-1 dan dibandingkan dengan obat cefixime sebagai
0,30-0,90 mg ml-1, masing-masing. Namun, pembentukan turunan imina
dikonfirmasi dengan membandingkan tinggi puncak, waktu retensi dan perubahan
spektral. Metode ini cepat, sederhama, sangat stabil dan akurat untuk pemisahan
dan penentuan turunan imin dari cefixime.
1. Pengenalan
Cefixime (CFX) 1 [(6R, 7R, E) -7- (2- (2-aminothiazol-4-yl)-2(carboxymethoxyimino) asetamido) -8-okso-3-vinil-5-thia-1- azabicyclo asam
[4.2.0] Oktober-2-ene-2-karboksilat], dianggap sebagai anggota penting dan aktif
sefalosporin generasi ketiga. Cefixime yang ada di off kristal putih, memiliki titik
leleh 250-220 C dan larut dalam alkohol (Troy dan Beringer, 2005). Sebuah

cefixime oral aktif memiliki aktivitas yang sangat baik terhadap patogen seperti,
Anaerob, Enterobacteriaceae, spesies gram negatif seperti Escherichia coli,
klebsiella, Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, Neisseria
gonorrhoeae, Serratia marcescens, Providencia, Haemophilus, dan
Meningococcus termasuk memproduksi strain -laktamase (Troy dan Beringer,
2005; Katzung, 2006; Sayed et al., 2013). Beserta spektrum luas aktivitas
antimikroba dan stabilitas, cefixime dianggap sebagai yang paling nyaman di
dosis yang tepat untuk orang dewasa serta pediatri dan banyak diresepkan antara
keluarga cephalosporin di Pakistan. Berbagai metode analisis telah dilaporkan
untuk analisis cefixime dan antibiotik lain setelah kompleksasi dan derivatisasi
dengan berbagai reagen bahan kimia (Sayed et al, 2013;. El-Shaboury et al, 2007;.
Wani dan Patil, 2013; Ahmed et al, 2011.; Adegoke dan Quadri, 2012; Adegoke
dan Umoh, 2009). Metode ini melibatkan metode spektrofotometri (Thakkar dan
Mashru, 2012; Azmi et al, 2013.; Ethiraj et al, 2012.; Attimarad et al, 2012.;
Ramadan et al, 2013.; Shah dan Kilambi, 2006; Agbaba et al., 1997; El-Wailily et
al., 2000), metode voltametri (Rajeev et al., 2010), elektroforesis kapiler
(Ahemed, 2013), studi klinis (Khan et al., 2008), spektrofotometri injeksi
mengalir (Abass et al., 2011), HPLC / massa tandem spektrometri (Ronaldo dkk.,
2001), UPLC / HPLC & IPLC (Ion-Pairing Liquid Chromatography) (Uslu dan
Ozden, 2013; Manna dan Valvo, 2004), Metode infus kontinu alternative
(Hiroyuki et al., 2006) dan Total reflektansi dilemahkan (ATR) Fourier Transform
inframerah (FT-IR) spektroskopi (Kandhro et al., 2013). Di antara teknik ini, UV /
Vis spektrofotometri dianggap sebagai salah satu teknik yang paling banyak
digunakan untuk penentuan cefixime setelah derivatisasi (Sayed et al, 2013;. ElShaboury et al, 2007;. Wani dan Patil, 2013; Ahmed et al, 2011.; Adegoke dan
Quadri 2012; Adegoke dan Umoh, 2009; Thakkar dan Mashru 2012; Azmi et al,
2013.; Ethiraj et al, 2012.; Attimarad et al, 2012.; Ramadan et al, 2013.; Shah dan
Kilambi, 2006; Agbaba et al., 1997; El-Wailily et al., 2000; Rajeev et al, 2010.;
Ahemed, 2013; Al-Momani, 2001). Selanjutnya, kasus HPLC yang bersangkutan,
literatur yang tersedia untuk penentuan cefixime tanpa derivatisasi nya
(Falkowisky et al., 1987; Joy et al., 1987; Leroy et al., 1995; Mikawa et al., 1989;

Fang et al., 2005; Raj et al, 2010.; Khandagle et al, 2011.; . Da-xing et al, 2013);
Namun, tidak ada apapun laporan tentang HPLC untuk analisis cefixime setelah
derivatisasi dengan beberapa aldehid yang cocok. Meskipun, HPLC jauh lebih
canggih dibandingkan dengan metode yang dilaporkan sebelumnya karena
memberikan informasi spesifik untuk semua analit bersama dengan sesuai
spektrum UV / Vis secara bersamaan, alat yang sangat berguna untuk analisis
komponen yang tidak diketahui dari campuran. Oleh karena itu, dengan tetap
melihat kebutuhan untuk analisis dan kegunaan dari HPLC, kami memutuskan
untuk menggunakan aldehida sebagai agen derivatisasi untuk cefixime dan
mengembangkan metode HPLC baru untuk analisisnya.
2-Thiophenecarboxaldehyde (2-TCA) 2 (juga dikenal sebagai tiofen 2
carbaldehyde) merupakan senyawa aldehida yang digunakan untuk proses
kondensasi dan menengah untuk produksi farmasi, senyawa aroma dan pestisida
(Alexandru et al., 2008). Alexandru et al. telah memanfaatkan 2TCA untuk
kondensasi alkylazulenes, namun tidak ada laporan untuk 2-TCA untuk digunakan
sebagai derivatizing agen untuk obat khusus cefixime. 2-TCA adalah cairan
berwarna kuning memiliki titik didih 198 C larut dalam alkohol dan pelarut
organik lainnya, heterosiklik cincin bantalan aldehida yang mengembun dengan
amina untuk menghasilkan turunan imina. Reaksi umumnya amina dengan amina
aromatik primer atau amina alifatik membentuk N-tersubstitusi produk yang
dikenal sebagai turunan imina dan basa Schiffs atau Reaksi azomethines dapat
dilakukan dengan memanaskan campuran amina dan aldehida dalam proporsi
molar yang sama atau dengan pengencer atau media seperti asam asetat atau
alkohol.
Reaksi umum dapat direpresentasikan sebagai Skema 1.
Dimana R mungkin alkil, sikloalkil, atau cincin heterosiklik dan R mungkin
benzena atau cincin aril. Aldehid dan amina aromatik menghasilkan zat berwarna
stabil misalnya basa Schiffs dari substitusi benzaldehida dan amina yang lebih
stabil dibandingkan dengan amina murni alifatik (C 5 -C 10) (Raj et al., 2010).
Dalam karya ini, kami melaporkan pertama kali penggunaan 2thiophenecarboxaldehyde sebagai reagen derivatizing untuk penentuan cefixime

dan mengembangkan metode HPLC-DAD baru yang secara bersamaan bisa

memisahkan tiga komponen yaitu obat, reagen dan imina derivatif masingmasing. Kualitatif, metode ini juga didukung oleh berbagai lain otentik analitis
teknik seperti UV / Vis, dan TLC untuk karakterisasi dari pengembangan derivatif
imina baru.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Bahan kimia dan reagen
Semua reagen dan bahan kimia yang dari farmasi atau kelas analisis.
Aquabidesilata digunakan selama penelitian diperoleh dari tanaman distilasi
semua terbuat dari kaca. Zat aktif cefixime (CFX) diperoleh dari Bosch (PVT)
LTD. (Karachi, Pakistan), 2-thiophenecarboxaldehyde dan asam format yang
dibeli dari Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA) dan Metanol
(HPLC grade) dari Fisher Bahan kimia (Fair Lawn, NJ, USA).
2.1.1. Persiapan standar
Larutan stok 100 mg L-1 obat cefixime disiapkan baru setelah setiap lima
hari. Sampel dibuat dengan pengenceran larutan stok dalam jumlah yang tepat
dari metanol. Namun, (1% v / v) larutan 2-TCA disiapkan dalam pelarut metanol
dalam 100 ml labu volumetrik.

Skema 1 Diagram perwakilan untuk prosedur reaksi umum dari reaksi Schiff
dasar
2.2.

Prosedur derivatisasi
10 ml larutan metanol masing-masing reaktan (2-TCA dan cefixime)

dicampur di refluks dilengkapi labu alas bulat dan direfluks pada 90-100 oC pada
mantel pemanas listrik. Selama refluks berkala setelah setiap 10 menit, deteksi
HPLC dilakukan dan perubahan diamati setelah 50 menit. Campuran tersebut

dianalisis dalam HPLC untuk pemisahan dari tiga komponen yaitu cefixime, 2TCA dan imina derivatif. Jalur sintetik turunan imin ditunjukkan dalam Skema 2.

Skema 2 Rute buatan untuk derivatisasi dari cefixime menggunakan 2TCA

sebagai derivat reagen
2.3.

Analisis HPLC cefixime, 2-TCA dan turunan imina

Pemisahan cefixime, 2-TCA dan derivatif imin mereka dicapai dalam sistem

SCM Spectra 1000 (Thermo Finnigan, California, USA) chormatograph cair

dilengkapi dengan degasser vakum dan sistem DAD. Sebuah teknokroma
KROMASIL 100 C-18 (15 mm x 0,46 mm, 5 M) kolom (Spanyol) dipilih untuk
pemisahan. Fase gerak terdiri dari metanol (A) dan 0,1% asam format encer (B),
dan semua analisis itu dilakukan dalam 5 menit di aliran isoratic 70:30 (A: B v /
v). Laju aliran adalah 1 ml min-1 sedangkan volume injeksi adalah 20L. Deteksi
UV dilakukan pada dua panjang gelombang yang berbeda. Cefixime dan 2-TCA
terdeteksi pada 280 nm, dan imin derivatif terdeteksi pada 350 nm.
Software yang digunakan untuk akuisisi data dan evaluasi adalah
Chromquest, Versi 4.2. Identifikasi dan karakterisasi cefixime, 2-TCA dan turunan

imina baru berdasarkan waktu retensi, tinggi puncak, spektrum UV, dan TLC.
Kurva kalibrasi didirikan dengan mengencerkan larutan stok turunan imina di
kisaran 1-50 g ml-1 yang disuntikkan ke dalam sistem HPLC-DAD secara
berurutan.
2.4.

Prosedur kromatografi lapis tipis

Satu tetes (~ 1 l) cefixime, 2 TCA dan turunan imina ditempatkan di dasar

silika dilapisi plat dengan pipa kapiler jet. Piringan sampel ditempatkan di
chromatojar TLC yang sudah berisi fase gerak jenuh (metanol: heksana 1: 4 v / v).
Setelah 15 menit waktu elusi, ketinggian pemisahan komponen yang berbeda
adalah 1 cm, piringan (silica) diambil dengan hati-hati dari chromatojar dan
pengukuran jarak dielusi dilakukan dalam pencahayaan dari D2 Lamp. Nilai RF
berada di urutan penurunan turunan imina, cefixime dan 2-TCA, berturut-turut.
2.5.

Prosedur ekstraksi pelarut untuk turunan imina

Sekitar 10 ml sampel derivatisasi diekstraksi dengan 10 ml n-heksana dalam

corong pisah dengan kocokan kuat (baik cefixime dan 2-TCA jarang atau kurang
larut dalam pelarut yang dipilih). Turunan imina larut dalam heksana dan
dipisahkan dari campuran dengan kembali diekstraksi dengan 5x2 ml pelarut nheksana segar. Fraksi yang terkumpul dari n-heksana diuapkan menggunakan
rotary evaporator pada 60 oC dan isi kering itu dilarutkan kembali dengan
metanol untuk analisis lebih lanjut pada HPLC.
2.6.

Validasi metode HPLC untuk derivatisasi

Metode HPLC baru dikembangkan untuk analisis turunan imin cefixime

divalidasi sesuai dengan pedoman internasional ICH (ICH 2005) untuk linearitas,
akurasi, pemulihan%, sensitivitas, presisi dan stabilitas larutan.
2.6.1. Linearitas
Tujuh konsentrasi yang berbeda dari turunan imina dalam kisaran 1-50 g
ml-1 digunakan untuk kalibrasi dan linearitas. Metode linearitas ini ditentukan
dengan memplot puncak daerah terhadap konsentrasi turunan imina. Slope (m),
intercept (b), dan koefisien korelasi (r2) ditentukan dari analisis regresi.
2.6.2. Ketepatan (Akurasi)

Akurasi dari metode yang dikembangkan ditentukan dengan menggunakan

metode penambahan standar internal. Sekitar 5 g ml-1 sebelum dianalisis larutan
turunan imina diambil dan tiga tingkat yang berbeda (80%, 100% dan 120%) dari
obat standar (cefixime) ditambahkan. Jumlah total obat dan reagen diperkirakan
dengan menggunakan metode yang diusulkan dalam rangkap tiga.
2.6.3. Pengukuran persen pemulihan
% pemulihan diukur dengan menambahkan obat murni (cefixime) dengan
larutan turunan imina
% pemulihan = ((Dt Ds)/Da) x 100
sebagai mana Dt adalah konsentrasi obat keseluruhan setelah penambahan standar;
Ds adalah konsentrasi obat dalam campuran turunan imina dan Da adalah
konsentrasi obat yang ditambahkan.
2.6.4. Kepekaan
Sensitivitas dari metode yang diusulkan ditentukan oleh batas deteksi
(LOD) dan batas bawah dari kuantifikasi (LLOQ) dari turunan imina
menggunakan sinyal untuk rasio kebisingan (/s) dari 3,3 /s dan 10 /s masingmasing; di mana adalah standar deviasi dari sinyal dan s adalah kemiringan
yang sesuai kurva kalibrasi.
2.6.5. Ketelitian
Ketelitian sistem ditentukan dengan menyuntikkan campuran obat
(cefixime), reagen (2-TCA) dan turunan imina setidaknya 7 kali, yang dinyatakan
dengan pengulangan dari daerah puncak dan waktu retensi analit dan ditentukan
sebagai rata-rata standar deviasi ( SD) dan persen relatif standar deviasi (%
RSD) yang dihitung dari data yang diperoleh. Untuk menentukan presisi
menengah (intra hari dan inter hari), dimana larutan turunan imina dianalisis oleh
tiga interval dalam sehari pada pukul 08:00, 16:00, dan 24:00 untuk pengulangan
dan selama tiga hari berturut-turut untuk reproduktifitas. Hasilnya dinyatakan
sebagai rata-rata SD dan persen relatif standar deviasi (% RSD).
3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Derivatisasi dan pemisahan HPLC-DAD

Reaksi derivatisasi sebagian besar digunakan untuk mengkonversi analit

untuk kemudahan deteksi dalam rangka meningkatkan sensitivitas, selektivitas
dan stabilitas oleh metode analisis instrumental. Untuk metode pemisahan,
derivatisasi terutama digunakan untuk modifikasi fungsi analit untuk
mengaktifkan pemisahan kromatografi. Produk baru yang umumnya dikenal
sebagai derivatif, memiliki struktur yang mirip atau terkait erat dengan analit tapi
tidak sama dengan senyawa modifikasi asli.

Gambar 1 Verifikasi (waktu retensi dan UV spektrum) dan pemisahan larutan

metanol (a) cefixime (obat) dan (b) 2TCA (reagen) oleh HPLC-DAD.

Gambar 2 Perbandingan UV spektrum dari turunan imina, cefixime dan reagen

2TCA oleh detektor array dioda.

Gambar 3 (a) pemisahan kromatografi cair tekanan tinggi dari tiga komponen
termasuk cefixime 1 (obat), 2TCA (reagen) 2 dan turunan imina 3, (b) pemisahan
kromatografi cair tekanan tinggi setelah penambahan internal dua komponen
termasuk cefixime 1, dan reagen 2TCA 2 dengan turunan imina 3.

Skema 2 menunjukkan reaksi 2-thiophenecarboxaldehyde 2 dengan gugus amino

primer pada cincin tiazol dari cefixime 1 selama metode refluks dan turunan imina
baru turunan 3 cefixime disiapkan. Sebelum derivatisasi, bentuk murni obat dan
reagen dianalisis secara terpisah oleh RP-HPLC untuk verifikasi waktu retensi dan
data spektral masing-masing. Gambar 1a dan b menunjukkan waktu retensi (1,83
dan 2,37 menit) serta UV spektrum ( max 287 nm dan 261 nm) dari kedua obat
dan reagen, masing-masing. Reaksi awalnya dipantau oleh HPLC mengikuti
interval setiap sepuluh menit dan akhirnya reaksi lengkap dianalisis setelah 50
menit. Tidak ada perubahan yang diamati pada pemanasan lagi dan derivatif
sangat stabil pada suhu kamar untuk waktu yang luas (lebih dari dua minggu).
Penampilan fisik larutan derivatisasi juga berubah (dari kuning ke hijau muda);
selanjutnya, larutan didinginkan pada suhu kamar dan dianalisis di integrator
HPLC (Kolom) untuk pemisahan tiga komponen dari campuran yaitu cefixime, 2
TCA dan turunan imina, sedangkan spektrum UV dari derivatif dianalisis di 350
nm dengan detektor array dioda.

Gambar 4 Kromatogram HPLC dari puncak diekstrak turunan imina dan spektrum
UV di max dari 349 nm.

Gambar 5 Perbandingan spektra UV (di max 349 nm) dari turunan imina
sebelum dan sesudah ekstraksi dari campuran dengan pelarut n-heksan dengan
detektor DAD.

Perbandingan spektrum UV dari tiga komponen ditunjukkan pada Gambar. 2, di

mana max dari cefixime, 2-TCA dan turunan imin yang berbeda satu sama lain
secara berturut-turut yaitu 235, 287 nm; 261, 287 nm dan 261, 287, 349 nm.
Setelah reaksi sempurna dari reagen 2-TCA dengan cefixime, pemindahan
penyerapan terhadap gelombang yang lebih panjang (pergeseran batokromik)
diamati dan perubahan spesifik yaitu 349 nm diamati pada spektrum UV dari
turunan imin (Gambar. 2).
Gambar. 3a menunjukkan pemisahan bersama dari tiga komponen (cefixime, 2TCA dan turunan imina) dengan HPLC-DAD dengan waktu retensi yang khusus
menggunakan sistem isokratik (70:30) fase gerak (metanol: asam formiat 0.1% )
pada laju alir 1 ml min-1; namun, metode penambahan standar internal yang
diterapkan untuk konfirmasi lebih lanjut dari cefixime dan 2TCA dalam
campuran. Gambar. 3b menunjukkan ketinggian peningkatan cefixime dan 2TCA

dengan waktu retensi yang sama setelah penambahan standar internal relatif dan
tidak berpengaruh pada ketinggian turunan imina.
Namun, konfirmasi lebih lanjut untuk preparat turunan imin dilakukan dengan
metode TLC menggunakan campuran biner metanol dan n-heksana (1: 4). Sebuah
pemisahan yang baik dengan minimal bagian akhir yang dicapai mengungkapkan
bahwa turunan dielusi untuk jarak yang lebih jauh dari masing-masing komponen
lainnya (cefixime dan 2-TCA). Akurasi dan presisi dari metode yang dilakukan
oleh kinerja diulang dengan konsentrasi diencerkan, dan hasil kualitatif tetap tidak
berubah mengenai tinggi dan daerah komponen. Metode yang diusulkan adalah
alat yang penting dalam konfirmasi derivatisasi dan aplikasi tersebut.

Gambar 6 Kromatografi HPLC dari kalibrasi linear dari turunan imina dalam
rentang konsentrasi 1-50 g mL-1

3.2 Ekstraksi dan pemisahan turunan imina dari campurannya

Ekstrak turunan imina dari campuran telah ditarik oleh cairan-cairan
pengekstraksi. Metode TLC telah mengindikasikan dengan jelas, turunan imina
dapat larut didalam n-hexana dan dipisahkan dari campurannya. Itulah alasan
mengapa n-hexana dapat digunakan untuk mengekstraksi turunan dalam
pemisahannya dengan pengocokan secara ekstensif. Hexan menguap dari fraksi
turunan imina pada suhu 60C menggunakan rotary evavorator, dan sisanya
dilarutkan kembali dengan metanol dan dianalisis menggunakan HPLC. Gambar 4
menunjukan prinsip pemisahan secara kromatografi dari ekstrak derivate imine
dari campurannya dengan spektrum UV pada panjang gelombang maksimal
sebesar 349 nm, yang diindikasikan dengan jelas bentuk dari derivate imine dari
obat cefixime.
Gambar 5 menunjukan perbandingan spektrum UV dari derivate imine
sebelum dan setelah ekstraksi dengan larutan n-hexana yang juga memberikan
bukti lain.
3.3 Validasi metode HPLC pada turunan imina
Tabel 1 menunjukan ringkasan parameter validasi untuk analisis turunan
imina mengikuti pedoman internasional ICH (ICH, 2005) untuk linieritas,
sensitivitas, pemulihan dan ketepatan metode HPLC yang baru dikembangkan.
3.3.1 Linearitas
Linearitas pada turunan imina dievaluasi sampai tujuh konsentrasi pada
kisaran 1-50 g ml-1. Kurva kalibrasi diplot dengan mendapatkan daerah puncak
dengan rata-rata (n = 3) terhadap konsentrasi turunan dan hasilnya dianalisis
dengan metode regresi linier. Sebuah koefisien regresi ditabulasi , pada tabel 1
yaitu 0,998 yang menegaskan bahwa metode ini sesuai untuk penentuan turunan
imina. Gambar 6 menunjukan kalibrasi turunan imina setelah injeksi pada
serangakaian konsentrasi ke HPLC dan terdeteksi oleh detector array dioda.
3.3.2 Kepekaan
Kepekaan dari metode yang diusulkan dilakukan dengan menghitung batas
deteksi dan batas kuantifikasi dengan pengenceran seri campuran turunan imina
sehingga sinyal untuk rasio kebisingan mencapai nilai tiga untuk LOD dan

sepuluh untuk LOQ. Batas deteksi dan kuantifikasi diringkas dalam Tabel 2
dengan 0,1 dan 0,4 lg ml-1 secara berturut-turut. Selanjutnya, Tabel 2
menunjukkan perbandingan LOD dan LOQ dari turunan imina dan obat cefixime
yang jelas yang menunjukkan bahwa setelah derivatisasi kepekaan untuk deteksi
meningkatkan dibandingkan dengan cefixime yang tidak diderivatisasi.
3.3.3 Persen pemulihan
Tiga persentase yang berbeda yaitu 80%, 100% dan 120% dari standar
cefixime ditambahkan selama derivatisasi dan pemulihan diperoleh dalam kisaran
95-99% dengan persen deviasi standar rendah yang menunjukkan akurasi yang
tinggi dari derivatisasi yang diusulkan dan metode analisis (Tabel 1).
3.3.4 Ketelitian
Ketelitian antar-hari dan intra-hari untuk turunan imina dinilai dengan
menyuntikkan campuran di HPLC dan hasilnya diringkas dalam Tabel 1. Untuk
ketelitian intra-hari sampel disuntikkan tiga kali dalam hari yang sama sedangkan
untuk ketelitian antar-hari sampel disuntikkan setelah setiap hari sampai tiga hari.
hasil yang memuaskan dicapai dengan menghitung RSD untuk ketelitian
keduanya dari intra-hari dan inter-hari. Rendahnya persentase RSD menunjukkan
pengukuran kemampuan reproduksi yang tinggi dan pengulangan dalam kondisi
arus eksperimental. Data ini membenarkan kegunaan dari metode yang akan
menunjukkan stabilitas.
4. Kesimpulan
Dalam penelitian kali ini, metode baru yang sederhana telah dikembangkan,
dimana 2 thiophenecarboxaldehyde digunakan pertama kali untuk derivatisasi
cefixime dan pemisahan berkelanjutan dari 3 komponen, yaitu cefixime, 2CTA,
dan turunan imina yang telah dipengaruhi dalam waktu yg sangat singkat oleh
HLPC-DAD. LOD dan LOQ dari turunan imina didapatkan dalam rentang 0,1320,401 (symbol) ml-1. Data ini juga dibandingkan dengan underivat cefixime dan
hasilnya menunjukkan peningkatan sensitifitas dan selektifitas dari derivat.
Hasilnya di konfirmasi lebih dalam dengan menggunakan teknik standar
penambahan. Imine derivative dikonfirmasi dengan membandingkan tinggi

maksimum, waktu retensi dan perubahan spektral dengan cefixime dan reaksi
2TCA dan juga di konfirmasi ulang dengan menyuling (mengekstrak) campuran
menggunakan pelarut n-hexane. Lebih jauh lagi metode HPLC telah divalidasi
berdasarkan aturan ICH internasional yang mengungkapkan bahwa metode
tersebut cepat, sesuai, akurat, tepat/peka, pengindikasian yang stabil dan dapat
digunakan untuk mempertimbangkan imina dari turunan cefixime.