Perbaikan dalam produksi FIX rekombinan

Dilaporkan bahwa tingkat sekresi FIX rekombinan dari baris sel produksi relatif rendah: ca.
30mg/l [37]. Ini dapat ditingkatkan 30-50% dengan penambahan 1nM metil testosteron pada
media kultur [38] atau dua kali lipat setelah penambahan phorbol 12-miristat, 13-ac-etate, dan
kalsium ionophore [39]. Munculnya pergerakan FIX yang tidak diinginkan dalam media
kultur dapat dikontrol dengan mengurangi Ca2 ion + konsentrasi 0,5 mM dari 1,12 mM [40];
dalam studi lain dari kelompok yang sama, ditemukan bahwa peningkatan Ca2 + ion 1,3 mM
menyebabkan peningkatan produksi FIX sebanyak 30%, tanpa kenaikan yang signifikan
dalam tingkat FIXa [41].
Dalam penelitian awal FIX rekombinan dari sel CHO, ditemukan bahwa pengolahan
propeptide yang disekresi dalam FIX tidak selesai dan FIX yang terikat dengan propeptide
tidak aktif [42]; selesai atau hampir selesai pengolahan propeptide dapat dicapai oleh coekspresi Subtilisin / Kexin-seperti konvertase PACE / furin. Homolog konvertase PC5 [43]
juga dapat digunakan [44].

Kegiatan pro- koagulasi FIX membutuhkan gamma karboksilasi lengkap dari 10 residu Glu
pertama dalam domain Gla: 2 residu terakhir mungkin tidak terkarboksilasi [45]. ]. Natural
FIX is completely -carboxylatedin all 12 residues, dan tingkat dari y-karboksilasi di
rekombinan FIX berkurang pada 2 residu terakhir, menghasilkan rata-rata 11,5 residu Gla per
molekul [37] dan aktivitas pembekuan normal (tidak kurang dari 200 IU / mg). Dalam kasus
sel inang BHK, aktivitas pro-koagulan dari sekresi FIX sangat menurun untuk memproduksi
line (ga yakin yang ini: the pro-coagulant activity of the secreted FIX declined for highly
producing line), dan dari vitamin K 2 berlebih, 3 epoksida reduktase enzim (VKOR), yang
menghasilkan kofaktor untuk reaksi -karboksilasi, memulihkan aktivitas relatif pro-koagulan
ke level normal [46].
Tidak ada penelitian langsung terhadap rasio batas maksimal dalam modifikasi pascatranslasi kaskade untuk FIX rekombinan, dan berbagai perangkat tambahan dalam beberapa
tingkat enzim CHO dapat meningkatkan sekresi FIX yang diproses. Setidaknya satu jenis
modifikasi - pengolahan propeptide - dapat dilakukan dalam media kultur memanfaatkan coexpresed larutan varian PACE yang terpotong [37]. Dalam kasus protein VKD ho-mologous protein C manusia (HPC) - ditemukan bahwa rasio batas maksimal untuk HPC rekombinan,
dinyatakan dalam 293 sel manusia, adalah N-glikosilasi [47]; dalam kasus lain VKD homolog

- faktor VII dinyatakan dalam sel CHO - baik glikosilasi dan -karboksilasi membatasi
sekresi produk [48]. Sangat menarik untuk dicatat bahwa tingkat sekresi khas faktor VII
adalah ~ 5 kali lebih tinggi dari FIX di baris sel industri dan bahwa satu-satunya perbedaan
yang signifikan dalam modifikasi pasca-translasi dari dua protein ini adalah O-glikosilasi
yang lebih berlimpah pada FIX.
Baris turunan sel CHO, yang saat ini bekerja untuk produksi FIX rekombinan, dapat
menggantikan yang lebih produktif. FIX alami diproduksi oleh sel-sel hati, dan telah
ditetapkan bahwa garis sel hepatoma manusia HepG2 menghasilkan 1,5 kali lebih FIX
rekombinan dari 293 garis sel ginjal manusia setelah transfeksi dengan vektor retroviral yang
sama [39]. kultur sel Nonvertebrate juga dievaluasi untuk pengekuaran FIX, dan dalam
Drosophila yang diturunkan garis sel SF2 terdeteksi 12-kali lipat peningkatan sekresi FIX
fungsional aktif dibandingkan dengan sel CHO[49].
organisme transgenik
Susu dari hewan transgenik telah dianggap sebagai sumber yang lebih baik dari protein
terapeutik rekombinan selama dua puluh tahun terakhir. FIX telah dinyatakan dalam domba
transgenik sebagai gen fusi yang terdiri dari beta-laktoglobulin dan urutan FIX, dan sejumlah
kecil dari FIX aktif telah terdeteksi dalam susu [50]. telah dicapai dengan menggunakan
teknik transfer nuklir yang dikembangkan oleh PPL Therapeutics [51]. Spesies yang
memproduksi dibuat menggunakan teknik yang sama dengan yang digunakan untuk Dolly
domba dan disebut Molly dan Polly. Hasil serupa telah diperoleh untuk kambing transgenik 13,7 ug / l dengan> 90% bentuk aktif "gamma-glikosilasi" [52], dan tikus - hingga 60 mg / l
pada 50% dari FIX biologis aktif [53] .
Studi yang paling sukses adalah studi yang menggunakan babi [54-56]. Meskipun baik hasil
prediksi teoritis, tingkat produksi faktor IX yang sebenarnya sudah cukup (diringkas pada
Tabel 2). seharusnya batas rasio maksimal dalam sekresi FIX oleh sel kelenjar susu babi
adalah -karboksilasi. Spesifik aktivitas penuh (yaitu karboksilasi lengkap) dari produk
tersebut terkenal karena binatang ini, memproduksi FIX pada 200 mg / l [54], dan hanya 1020% dari aktivitas spesifik normal yang tercatat untuk FIX dari babi, memproduksi di tingkat
2-3 g / l [55]. Namun demikian, proses pemurnian yang layak dikembangkan untuk sumber
ini dari bawah FIX terkarboksilasi, dan produk yang dimurnikan, sangat diperkaya di FIX
yang sepenuhnya terkarboksilasi, ditemukan tepat untuk glikosilasi [56] dan diharapkan
untuk dimasukkan dalam uji klinis. Perlu dicatat bahwa penggunaan susu dari babi

transgenik, sebagai pengganti dari hasil media bioreaktor, menyebabkan kira-kira 10 kali lipat
konsentrasi yang lebih tinggi dari protein target dengan mengorbankan tingkat yang jauh
lebih tinggi dari kontaminasi protein, lipid, dan kurangnya sterilitas . Protein lain dengan
struktur kompleksitas sebanding - antitrombin III - dinyatakan dalam susu kambing pada 1-2
g / tingkat l dan dimurnikan untuk kelas farmasi dengan hasil 53% [57]. Konsumsi FIX di AS
dapat diperkirakan 2 kg / tahun; dan konsumsi dunia, pada 40 kg / tahun. Berdasarkan hasil
susu yang dikenal, 40 babi akan mencakup pasar AS dari FIX dan 800 akan mencakup dunia
pada tingkat pengeluaran sekarang dan 50% total hasil proses.
Potensi sumber lain dari biofarmasi protein adalah benih dan jaringan tanaman transgenik.
Saat ini, produksi protein VKD fungsional aktif dalam tanaman transgenik adalah mustahil,
karena tanaman kekurangan -carboxylases [60]. Keterbatasan ini dapat dilewati oleh coexpression dalam tanaman dari mamalia -carboxylases dan co-enzim, tetapi tidak mungkin
sepertinya tugas yang kompleks ini akan dicapai dalam waku dekat.
Pengeluaran FIX aktif dalam tanaman transgenik hingga saat ini telah terdapat dalam tomat
transgenik [61] dan biji kedelai [62]. Tingkat pengeluaran FIX dalam tomat cukup rendah:
15,84 ug / kg buah-buahan segar. Dalam benih kedelai, tingkat pengeluaran 800 mg / kg yang
sangat menjanjikan telah dicapai. Kedua sistem menghasilkan bentuk glikosilasi dewasa dari
protein target.
Dalam beberapa kasus hemofilia B yang jarang terjadi (1,5-3%), titer besar dari antibodi yang
dikembangkan oleh sistem kekebalan tubuh pasien dalam menanggapi terapi penggantian
oleh persiapan FIX [63]. inhibitor antibodi ini membuat terapi biasa dan profilaksis oleh FIX
tidak efektif dan memerlukan dosis yang lebih tinggi dari FIX atau toleransi kekebalan
induksi (ITI) dengan sering infusi FIX dalam jumlah yang sangat tinggi. protokol ITI untuk
hemofilia B terakhir dari bulan ke tahun dan berbahaya bagi pasien karena perkembangan
sindrom nefritik dan reaksi anafilaksis yang mengancam jiwa. Setidaknya beberapa efek
samping dalam perawatan ITI disebabkan oleh aktivitas pro-koagulan berlebihan dari FIX
terserap, Dan beberapa varian FIX tidak aktif mungkin lebih berguna sebagai agen yang
menginduksi

kekebalan dan toleransi tubuh. Protein fusi FIX dan dikenal pembawa

transmucosal toksin kolera -subunit yang dikeluarkan dalam kloroplas tembakau (400 mg /
kg dari jaringan daun) dan diberikan sebagai bubuk daun oral beku yang diuji untuk
pencegahan pembentukan inhibitor antibodi pada FIX tikus yang diobati dengan FIX manusia
[64]. Hewan kontrol, diberi makan bubuk daun tembakau yang belum ditransformasikan,

dikembangkan 2-90 unit Beteshda per ml (BU / ml) dari inhibitor antibodi terhadap FIX
manusia, dan pada tikus yang diberi bubuk daun dengan fusi dienkapsulasi dari subunit toksin
dan FIX, tingkat inhibitor tidak bisa dibedakan dari baseline. Data-data ini didukung oleh
angka kematian diperlakukan dan kontrol tikus - 10% vs 75% setelah delapan suntikan
mingguan FIX manusia.
Varian FIX rekombinan
Dahulu kala penggunaan turunan plasma FIX untuk terapi hemofilia B didikte pemanfaatan
FIX rekombinan utuh sebagai obat. Salinan rekombinan yang tepat dari FIX alami
diharapkan menjadi non imunogenik untuk pasien dan melakukan perbandingan untuk
membuktikan perisapan turunan plasma. Pada saat yang sama, terapi penggantian saat
menggunakan FIX membutuhkan infus sangat sering dalam jumlah besar dari obat FIX
dengan harga tinggi. Modifikasi untuk membuat molekul FIX lebih aktif atau lebih stabil
dalam aliran darah dapat membuktikan kegunaan signifikan terhadap pasien dan perawatan
kesehatan profesional yang terlibat.
Aktifitas spesifik dari FIX dalam (pengujian kadar logam/assay) koagulasi darah dapat
meningkat tiga kali lipat oleh mutasi titik tunggal, Arg338-> Ala338 [65], tanpa
mempengaruhi perakitan tenase kompleks.Pertukaran 2 aminoacids dan 2 loop permukaan
singkat antara molekul FIX dan faktor X cukup untuk penciptaan molekul hibrida dengan
aktivitas proteolitik yang sangat tinggi dan spesifitas enzim, yang khas dari faktor X [66].
Pekerjaan lebih lanjut membatasi set minimal dari titik mutasi yang dibutuhkan untuk 3 Lys98, Tyr177, dan Tyr94 [67]. Tidak ada data aktivitas pro-koagulan dikumpulkan untuk
bentuk-bentuk mutan dari FIX.
Karena sebagian besar penderita hemofilia menderita karena tidak adanya faktor VIII,
kofaktor protein dari FIX, varian rekayasa FIX mampu mengaktivasi langsung dari FX da
dapat berfungsi sebagai terapi untuk hemofilia A. Mereka juga sensitif terhadap inhibitor
antibodi terhadap faktor VIII. Mutan triple FIX Val181Ile, Lys265Thr, dan Ile383Val
digunakan sebagai terapi vektor gen berhasil dilewati faktor VIII dan dikoreksi hemofilia A
fenotipe pada tikus [68].
Sifat farmakokinetik FIX dapat ditingkatkan dengan fusi genetik dengan protein plasma tahan
lama atau kovalen konjugasi dengan polimer hidrofilik. Fusi FIX dan serum albumin manusia
telah diwujudkan melalui linker peptida pendek yang tidak terpotong atau linker peptida yang

dapat terpotong oleh faktor Xia, bersamaan dengan aktivasi FIX [69]. Linker yang tidak
dapat terpotong dalah (G) 6V dan SS (GGS) 6Gs, linker yang dapat terpotong berasal dari
FIX dan terdiri dari aktivasi terminal-amino yang meliputi asam amino 136-154 atau 137-154
dari FIX matang. Aktivasi Rix-FP dengan hasil linker tidak dapat terpotong dalam molekul
FIXa diaktifkan dengan albumin yang masih melekat, dan aktifasi dari rIX-FP dengan hasil
linker yang dapat terpotong dalam melepaskan albumin dan molekul FIXa yang berbeda dari
tipe liar FIXa hanya dari fragmen linker terminal-C pendek yang berasal dari molekul FIX itu
sendiri (Gambar. 3A). Pemanfaatan linker yang dapat dipotong menghasilkan peningkatan 10
hingga 30 kali lipat dalam aktivitas spesifik FIX tergabung dalam uji koagulasi, dan varian
fusi albumin menunjukkan peningkatan yang signifikan pada model hewan setengah hidup
(half-life) dan khasiat dalam mengurangi waktu perdarahan di FIX (- / -) tikus.
Kehadiran domain Fc dari imunoglobulin G memungkinkan protein fusi untuk mengikat ke
reseptor Fc neonatal (FcRn), heterodimer dari MHC kelas I-seperti protein rantai berat
dengan beta-2-mikroglobulin. FcRn melindungi Fc mengandung molekul IgG dari
katabolisme oleh ikatan reversibel ke permukaan sel endotel [70].
Fusi FIX dan fragmen Fc dinyatakan dalam sel HEK-293H manusia dan terisolasi sebagai
kovalen heterodimer dari rantai FIX-Fc dan Fc bebas rantai (Gambar. 3B) memiliki aktivitas
pro-koagulan spesifik yang dapt diterima (ca. 50 IU / mg) dan telah menunjukkan
peningkatan yang signifikan dalam terminal paruh dalam banyak model hewan [44]. Waktu
paruh di monyet adalah 47,3 9,1 jam dibandingkan 12,7 jam untuk FIX utuh. Sebuah
peningkatan 3 kali lipat sejenis di paruh tercatat dalam fase I / II uji klinis dari fusi FIX-Fc
[71].
Lampiran kelompok spesifik bagian PEG ke N-gylcans dari FIX (Gambar 2) akan
menyebabkan konjugat, yang akan dikonversi ke alam FIX, diaktifkan, meninggalan PEG
yang melekat pada pelepasan aktifasi peptida. Konjugat semacam ini, dengan sebuah
kelompok 40-kDa PEG yang terpasang (N9-GP), digunakan dalam studi hewan [72] dan uji
klinis pada tingkat dosis 25-100 U / kg, menunjukkan rata-rata paruh 93 jam, 5 kali lebih
tinggi dibandingkan dengan FIX utuh [73]. Sangat menarik untuk dicatat bahwa pemulihan
bertahap dari N9-GP adalah 94% lebih tinggi dibandingkan dengan FIX rekombinan, sebuah
indikasi tepat bahwa kelompok PEG dapat melindungi molekul FIX dari interaksi yang tidak
diinginkan dengan permukaan sel atau memblokir kemampuan dari N-glycans untuk

menengahi interaksi tersebut. Perbedaan dalam pemulihan kegiatan ini juga dapat disebabkan
oleh full sialation of glycans performed in vitro after purification of the FIX.
Tindakan berkepanjangan FIX dapat dicapai dengan berbagai teknik enkapsulasi,
memungkinkan pelepasan lambat dari protein yang terperangkap ke dalam sirkulasi. ahan
pembawa dapat menjadi biodegradable polimer, liposom, dll Sebuah penjelasan rinci tentang
bidang ini keluar dari ruang lingkup dari tinjauan ini. Sebuah metode yang sangat tidak biasa
dari enkapsulasi FIX baru-baru ini dikembangkan untuk uji coba manusia [74]. Sel darah
merah dicampur dengan FIX ex vivo, terkejut akan enkapsulasi dari protein target di dalam
sel, dan disuntikkan kembali ke pasien. FIX yang terperangkap perlahan dilepaskan dari sel
darah merah pada lisis mereka dalam aliran darah.
Terapi gen hemofilia B
Bersamaan dengan perkembangan rekombinan terapi protein FIX, strategi terapi gen untuk
pengobatan hemofilia B telah dikembangkan. Terapi substitusi protein memiliki keterbatasan
yang jelas: pengobatan tidak kuratif, dan selama seluruh kehidupan pasien tetap ada risiko
yang signifikan dari perdarahan dan kerusakan sendi kronis. Kelemahan umum infus protein
konstan lainnya adalah tingginya biaya pengobatan, terbatasnya ketersediaan obat, rendah
paruh faktor pembekuan, dan risiko pembentukan antibodi (inhibitor) terhadap protein FIX
yang diberikan.
Kedua bentuk hemofilia adalah target yang sangat baik untuk terapi gen karena mereka cacat
akibat gen tunggal yang diketahui memiliki jendela terapeutik yang luas: pencapaian 1% dari
tingkat normal FIX plasma dapat mencegah risiko pasien yang paling berbahaya, dan
konsentrasi dari faktor pembekuan setinggi 150%, juga, tidak diperkirakan menyebabkan
efek samping. Untuk terapi gen, tingkat terapeutik dari FIX yang dikeluarkan biasanya
dianggap sebagai 5-10% dari tingkat plasma normal; dalam hal ini suntikan protein lebih
mungkin dihindari. Tingkat pengeluaran rendah (di bawah-terapi) dari FIX mungkin masih
cukup untuk induksi toleransi imun pada pasien yang menderita beberapa penyakit.
Transfer gen FIX in vivo adalah mungkin bahkan oleh DNA plasmid telanjang, seperti yang
telah ditunjukkan pada model binatang. Injeksi hidrodinamik dari pengeluaran plasmid yang
mengandung cDNA FIX manusia dan bagian kontrol hati adalah cukup untuk mencapai
tingkat terapeutik FIX pada tikus yang kurang sempurna untuk 210 hari [75]. Teknik yang
digunakan - injeksi 50 mg dari plasmid dalam 2 ml larutan dalam 5-8 detik ke dalam vena

ekor - adalah sangat tidak cocok untuk terapi manusia, dan modifikasi signifikan injeksi
hidrodinamik harus ditemukan sebelum studi klinis dapat berlangsung.
Target cDNA dapat memberi hasil lebih efisien dengan mengintegrasikan kromosom dari
retroviral (RV) atau

sumber lentiviral (LV) atau dengan predominantly episomal

adenoviruses/ adenovirus didominasi episom (AV) atau adeno-assoiated viruses (AAV).

Menurut sejarah, partikel RV telah digunakan pertama kali untuk transduksi ex vivo fibroblas
dari hewan percobaan dengan FIX cDNA dan reim- plantasi berikutnya dari sel-sel yang
dimodifikasi. Tingkat rendah dari FIX manusia terdeteksi dalam plasma dari hewan yang
dirawat [76]. Sebuah persentase yang sangat kecil dari hewan dengan tes positif tertranduksi
fibroblas yang ditanamkan kembali untuk produksi FIX, tapi efeknya tetap stabil selama lebih
dari 600 hari pada percobaan kelinci [77]. Sebuah fase I percobaan klinis untuk hemofilia B
dilakukan dengan kulit autologus tertranduksi fibloblas ex vivo dengan kode -retroviral
vektor FIX [78] dan menghasilkan transien, peningkatan moderat dalam tingkat FIX plasma
dalam dua pasien.
Vektor lentiviral, berbeda dengan vektor gamma-retroviral , mampu transduce hepatosit hati
dewasa in vivo. Tingkat terapeutik FIX telah dicapai (transien) pada tikus hemophilic dewasa,
sesudah injeksi intravena LV [79]. LV juga dapat secara efektif transduce sel antigenpresenting limpa/antigen-presenting cells (APC), yang mengarah ke respon imun terhadap
beredarnya protein transgenik [80]. Kemampuan yang tidak diinginkan dari LV ini dapat
berkurang dengan membatasi pengeluaran transgen untuk jenis sel tertentu dengan
memanfaatkan urutan promotor spesifik Jaringan dan dari co-expression microRNA ini,
menghilangkan pengeluaran dari target. Pengeluaran FIX jangka panjang pada tikus
menggunakan promotor hepatosit-spesifik dan sel hematopoietik spesifik microRNA mir142-3p telah menghasilkan tingkat lebih dari 10% dari FIX beredar selama 280 hari pada
hemofilia model B tikus [81]. Tidak ada antibodi terhadap FIX yang terdeteksi, dan semua
hewan selamat setelah tantangan ekor-klip ( a challenge by tail-clip.) -BINGUNG
WAKAKAKA
Pengeluaran FIX juga dapat dibatasi untuk sel hematopoietik untuk memastikan ketersediaan
yang lebih baik dari protein target ke situs aksinya. Promotor Integrin alfa II b yang
terhubung dengan konstruksi LV, pengeluaran ditargetkan menuju megakariocytes, yang
digunakan dalam model hemofilia B tikus dan menunjukkan hasil yang menjanjikan:

akumulasi FIX dalam butiran-alpha dari trombosit dan dilepaskan setelah aktivasi [82], dan
koreksi fenoti telah dibuktikan dengan full survivability after tail-clip.
Common to all integrating viral vectors, including RV and LV,