LAPORAN PRAKTIKUM CARA PEMISAHAN DAN ELEKTROMETRI KI2221

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Nama : Ricky Iqbal Syahrudin

Nim : 10513013

Kelofasa gerakok :2

Hari/tanggal : Senin, 23 Februari 2015

Assisten :

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

BANDUNG

2014
A. TUJUAN
- Menghitung konsentrasi kafein dalam beberapa safasa gerakel minuman (kopi dan
teh) menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi

B. TEORI DASAR
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan partisi senyawa
dalam fasa gerak dan fasa diam. Pada HPLC, safasa gerakel cairan, atau safasa gerakel
padat terlarut dalam pelarut yang sesuai, dibawa melalui kolom kromatografi dengan fasa
gerak cair. Pemisahan ditentukan oleh interaksi zat terlarut / fasa diam, termasuk adsorpsi
cair-padat, partisi cair-cair, pertukaran ion dan eksklusi ukuran, dan dengan interaksi zat
terlarut/fasa gerak. Dalam setiap kasus, bagaimanapun, instrumentasi dasar pada dasarnya
sama. Sebuah diagram skematik alat HPLC khas ditunjukkan pada gambar.

Gambar 1 Skema HPLC

Kafein adalah senyawa polar yang larut dalam metanol. Apabila kadar kafein
ingin ditentukan dengan kromatografi, kafein harus diekstrak dari safasa gerakel ke
pelarut yang lebih non-polar. Tetapi, apabila fasa diam yang digunakan bersifat non-
polardengan fasa gerak yang polar, ekstrasi tersebut tidak perlu dilakukan. Pada monitor
kromatogram akan terbentuk dimana tingginya berbanding lurus dengan
konsentrasikafein, sehingga konsentrasinya dapat ditentukan.
C. ALAT DAN BAHAN

ALAT 1. Standar kafein 500

1. Alat HPLC ppm
2. Syringe 2. Asam pospat 5%
3. Ultrasonic Bath 3. Methanol
4. Gelas ukur 4. Aqua bidest
5. Gelas kimia 50 mL, 5. Safasa gerakel
100 mL, 250 mL minuman berkafein
6. Labu takar 10 mL (teh, kopi)
BAHAN

D. CARA KERJA
Standar kafein 20, 40, 60, 80, dam 100 ppm dibuat dengan mengencerkan
standar kafein 500 ppm. Standar 500 ppm dipipet sebanyak 1, 2, 3, 4, dan 5 mL kedalam
5 labu takar 10 mL. Kemudian labu diberi label masing-masing 20, 40, 60, 80, dam 100
ppm. Standar diencerkan dengan metanol safasa gerakai tanda batas dan dihomogenkan
dengan dibolak-balikkan. Safasa gerakel dibuat dengan mengencerkan kopi dan teh
kemasan dengan methanol. Sebanyak 5 mL safasa gerakel kopi dipipet kedalam labu
takar 10 mL kemudian diencerkan safasa gerakai tanda batas. Larutan dihomogenkan
dengan cara mengguncangkan labu. Sebanyak 5 mL teh kemasan dipipet kedalam labu
takar 10 mL kemudian diencerkan safasa gerakai tanda batas. Larutan dihomogenkan
dengan cara mengguncangkan labu. Untuk teh pengenceran dilakukan dua kali. Standar
kafein kemudian diinjeksikan kedalam alat HPLC masing-masing secara berurutan. Luas
kurva dan waktu retensi dicatat. Kemudian safasa gerakel kopi dan teh diinjeksikan
kedalam alat dan diukur luas kurva dan waktu retensinya.

E. DATA DAN PENGOLAHAN DATA
Standar 20 ppm

C R Ar

[
%
#
[min]
-
------- ----
--- --
-

1 1
BB
1.278 A
10


Standar 40 ppm

Pea Ar
k

[ [m
# min]

---
---- ---- ----

B
1.04 10.
B
1

B
1.27 B 21
5

Standar 60 ppm

Pea Ar
k

[ [m
# min]

---
---- ---- ----

B
1.28 25
B
4

Standar 80 ppm

Pea Ar
k


[ [m
# min]

---
---- ---- ----

B
1.28 33
B
8

Standar 100 ppm

Pea Ar
k

[
# min] [m
---
---- ----
----




B
1.29 38
B
1

Safasa gerakel Kopi

Pea Ar
k

[
# min] [m
---
---- ----
----

B
1.13 15
V
9

V
1.27 15
V
0

V
2.18 19
BA
0

Safasa gerakel Teh

Pea

k

#

----

1. V 6
14
3

1. VB 3
23
3

1. BB 3
37
4

1. BV 0
80
1

1. VBA 0
87
6

- Data alat HPLC

1. Tekanan : 400 bar
 2. Laju alir : 0.05 - 5.0 mL/min
3. Jenis kolom : LC Thermostatted Column
4. Panjang gelombang detector : 200 nm-300 nm








- Plot luas kurva terhadap konsentrasi kafein dalam larutan (Y=AX+B)

 1. Konsentrasi Kopi kemasan
Konsentrasi kopi dalam labu = 0,0274x-10.609 = 0,0274(1574.17566)-
10,609
= 32,52 ppm
Konsentrasi kopi dalam kemasan = factor
pengenceran x konsentrasi dalam labu
= 25 x 32,52 ppm = 813,085 ppm
2. Konsentrasi Teh dalam kemasan
Konsentrasi teh dalam labu = 0,0274(2642,12134)-
10,609 = 61,79 ppm
Konsentrasi teh dalam kemasan = factor
pengenceran x konsentrasi dalam labu
= 5 x 61,79 = 308,93 ppm




F. PEMBAHASAN

Pada HPLC fase gerak dialirkan melalui kolom ke
detektor dengan bantuan pofasa geraka. Safasa gerakel yang dilarutkan dalam solvent,
dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara injeksi. Di dalam kolom terjadi
pemisahan kofasa gerakonen-kofasa gerakonen cafasa gerakuran perbedaan kekuatan
interaksi anatara analit (solut-solut) dengan stationary phase pada kolom. Solut-solut
yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu.
Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tsb akan
keuar dari kolom lebih lama. Setiap kofasa gerakonen cafasa gerakuran yang keluar dari
kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram
GC yaitu jumlah peak menyatakan jumlah kofasa gerakonen, dan luas area peak
menyatakan konsentrasi dalam cafasa gerakuran. Sisitim HPLC dapat dihubungkan
dengan software pada kofasa gerakuter dan dioperasikan secara cofasa gerakuterize. Pada
HPLC pemilihan fasa gerak merupakan hal yang sangat penting fasa gerak harus bertindak
sebagaig pelarut yang baik untuk sampel fasa gerak yang dianalisis fasa gerak harus
murni sekali untuk menghindari adanya impurities yang akan mengganggu intepretasi
pada kromatogram dan mengotori kolom. Fasa gerak harus jernih sekali untuk
menghindarkan kolom kotor dan tersumbat. Pelarut harus disaring dan didegas.
.Fasa diam merupakan senyawa silika yang pada
permukaannya diberikan lapisan Xilena, sehingga fasa diam ini bersifat non-polar.
Komposisi metanol-air yang digunakan sebagai eluen dipilih 65-35 dikarenakan
komposisi tersebut yang memberikan hasil pemisahan kromatogram yang baik dengan
waktu analisis yang se-sebentar mungkin (dengan pembanding hasil percobaan pada
komposisi lain). Metoda peng-elusi-an analit yang dilakukan adalah elusi isokratik, yaitu
komposisi eluen yangdipakai selama proses elusi adalah tetap (65-35), tidak berubah,
sedangkan metodaelusi lainnya adalah elusi gradien, komposisi eluen berubah selama
proses elusi. Air merupakan fasa gerak yang lemah dan memiliki retensi yang besar,
sedangkan metanol memiliki kekuatan elusi yang lebih besar dibandingkan dengan air,
pelarut ini sering digunakan karena harga yang lebih murah dibandingkan pelarut
organik lain dan tidak terlalu berbahaya jika dibuang ke lingkungan.
Suatu komponen dapat terpisah dari komponen
penyusun senyawa lainnya dalam kromatografi dikarenakan perbedaan interaksi antara
komponen tersebut dengan fasa gerak dan fasa diam. Interaksi yang dimaksudkan dalam
HPLC ini adalah interaksi kemiripan sifat kepolaran, komponen suatu senyawa memiliki
sifat kepolaran yang berbeda-beda, sifat tersebut dapat dimanfaatkan untuk
dilakukan pemisahan. Kemiripan sifat kepolaran akan menyebabkan suatu komponen
akan lebih terlarut dalam satu fasa yang kepolarannya lebih mendekati dibandingkan fasa
yang lainnya. Kafein merupakan komponen yang ingin dipisahkan, komponen ini
memiliki sifat yang polar, maka dari itu digunakan HPLC fasa terbalik dengan tujuan
mempercepat waktu analisis. Kafein yang bersifat polar akan lebih terlarut dalam
fasadiam dan akan memiliki waktu retensi yang lebih rendah dibandingkan komponen
lainnya yang lebih bersifat non-polar namun akan memiliki waktu retensi yang
lebih besar dibandingkan komponen lainnya yang bersifat lebih polar dibandingkan
kafein. Waktu retensi akan bervariasi tergantung kepada: tekanan yang digunakan
(mempengaruhi laju alir pelarut); sifat fasa diam (komponen dan ukuran partikel);
komposisi pelarut; dan suhu kolom.
Detektor yang digunakan pada instrumen HPLC kali
ini adalah spektrofotometer UV-VIS, sebuah metoda umum yang mudah untuk
 menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet. Banyak senyawa organik menyerap
sinar UVdari beberapa panjang gelombang. Jika seberkas sinar UV dilewatkan pada
aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV berada pada bagian berlawanan
dari berkas cahaya, maka dapat akan didapatkan hasil
pembacaaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap
bergantung kepada jumlah senyawa tertentu yang melewati sinar pada saat itu. Pelarut
yang digunakan juga menyerap sinar UV, tetapi senyawa yang berbeda akan menyerap
sinar terkuat dalam bagian berbeda pada spectrum UV. Metanol menyerap panjang
gelombang dibawah 205 nm dan air dibawah 190 nm. Sehingga jika digunakan campuran
metanol-air sebagai pelarut harus digunakan panjang gelombang yang lebih besar dari
205 nm untuk mencegah pembacaan pelarut dalam analit.
Hasil analisis akan direkam sebagai rangkaian
puncak, masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melewati
detektor dan menyerap sinar UV. Tinggi dan luas puncak dapat digunakan untuk
mengukur jumlah dari senyawa ini. Konsentrasi kafein dalam percobaan ini ditentukan
dengan cara metoda kurva kalibrasi (penggunaan serangkaian larutan standar sebagai
pembanding). Perbedaan nilai konsentrasi dari kafein yang diperoleh berdasarkan
perhitungan dengan menggunakan luas kromatogram maupun tinggi kromatogram dapat
disebabkan oleh adanya udara yang masuk ke dalam kolom sehingga mempengaruhi
tekanan dalam kolom.

G. KESIMPULAN

Konsentrasi kafein dalam sampel teh dan kopi berdasarkan hasil kurva
dariluas area kromatogram adalah :

1. Konsentrasi Kopi kemasan adalah 813,085 ppm

2. Konsentrasi Teh dalam kemasan adalah 308,93 ppm

H. DAFTAR PUSTAKA

Skoog, D.A.,West, D.M., Holler, F.J.Fundamentals of Analyctical Chemistry 5 th
edition.,Saunders College Publishing,New York, 1988.
David Harvey. Modern Analyctical Chemistry 10 th edition., Mc.Grawhill, New
York, 2000.
www.scimedia.com/chem-ed/sep/lc/hplc.htm, diakses 22/02/2015 20:37 WIB