PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS

TERHADAP BAKTERI
Filed under: Bakteriologi, MyCollage 1 Komentar
Januari 31, 2011

4 Votes

Untuk melihat bentuk-bentuk bakteri dan sifatnya terhadap pengecatan maka yang terlebih
dahulu dilakukan adalah membuat sediaan yang dapat dilakukan dengan cara :

1) Membuat sediaan dari spesimen/ perbenihan cair.

Dengan ose yang telah disteril pada nyala api dan telah dingin, spesimen/perbenihan cair
diambil, lalu dioleskan pada permukaan bagian tengah dari seebuah kaca objek yang bersih
dan kering sedemikian rupa sehingga diperoleh sediaan yang agak tipis, rata dengan ukuran
sekitar 2 x 2 cm, kemudian dikeringkan pada udara terbuka yang tidak langsung berhubungan
dengan sinar matahari.

2) Membuat sediaan dari perbenihan padat.

Terlebih dahulu satu mata ose NaCl 0.9% steril diletakkan pada permukaan bagian tengah
dari suatu kaca objek, kemudian dengan ose steril dan dingin koloni/pertumbuhan bakteri
diambil sedikit dengan ose tadi, yang selanjutnya dicampur dan dioleskan sedemikian rupa
pada tetesan NaCl tadi sehingga diperoleh sediaan yang agak tipis, rata dengan ukuran 2 x 2
cm. sediaan dikeringkan pada suhu kamar yang terhindar dari cahaya matahari langsung.

Sediaan yang telah kering terlebih dahulu difiksasi melalui nyala api 3 kali dimana
permukaan sediaan berada sebelah atas waktu fiksasi.

Tujuan fiksasi adalah :

Melekatkan sediaan pada kaca objek.

Mematikan bakteri dengan segera.

Mempermudah dicat.

Sediaan tahan untuk dismpan jika belum sempat dicat.

Adapun pengecatan sediaan yang sering dilakukan dilaboratorium bakteriologi adalah :

1. Pengecatan Gram

2. Pengecatan Ziehl Neelsen

3. Pengecatan Neisser

4. Pengecatan Sederhana

5. Pengecatan Kapsul

6. Pengecatan Flagella

7. Pengecatan Spora

8. Pengecatan Negatif
Pengecatan ziehl-neelsen
Untuk melihat bakteri basil tahan asam (BTA) terutama M. Tuberculosis dan M. Leprae yang
terlihat berbentuk batang warna merah dengan latar belakang biru, dilakukan pengecatan ZN.

a) Persiapan

1) Sediaan yang akan dicat

Untuk spesimen sputum dibuat sediaan yang berukuran 2 x 3 cm, sedangkan spesimen dari
reitz serum sediaan dengan ukuran 1 x 1,5 cm, yang langsung diambil dari penderita.
Ketentuan lainnya sama dengan sediaan secara umum.

2) Larutan Karbol Fuchsin

Basic fuchsin : 0,3 gr

Alkohol 96% : 10 ml

Aquadest : 85 ml

Fenol : 5 ml

Basic fuchsin digerus dalam mortar sampai hancur, kemudian dilarutkan dalam alkohol,
ditambahkan aquadest dan fenol, kocok dan saring kedalam botol yang berwarna.

3) HCL-Alkohol 3% atau asam sulfat 20-25%

HCl pekat : 3 ml

Alkohol 96 % : 97 ml

4) Larutan Air Methylene blue

Methylene blue : 0,1 gr

Aquadest : 100 ml
Methylene blue digerus dalam mortar sampai hancur, tambahkan sdikit aquadest sambil
digerus hingga methylene blue larut. Cukupkan volumenya menjadi 100 ml dan saring
kedalam botol yang berwarna.

b) Cara pengecatan dan pembacaan hasil.

Sediaan dicat dengan karbol fuchsin smpai menutupi seluruh permukaan kaca objek.

Dengan api kecil kaca objek dipanasi dari bawah sampai zat warna menguap (tidak
boleh mendidih ), hal ini dilakukan 3 kali dalam waktu 5 menit

Zat warna dibuang dan sediaan dicuci dengan air kemudian dilunturkan dengan HCl
alkohol 3 % ( untuk M. Leprae dipakai HCl alkohol 1 % ) samai semua zat warna keluar dari
sediaan.

Sediaan dicuci air kemudian dicat dengan air methylene blue selama 20-30 detik.

Sediaan dicuci air, dikeringkan dan diperiksa minimal 100 LP dan hasil dilaporkan.

BTA TBC :

Tidak ditemukan atau hanya 1-3 BTA dalam 100 LP

Ditemukan antara 4-9 BTA dalam 100 LP

+ ditemukan 10-99 BTA dalam 100 LP

++ ditemukan rata-rata > 1 BTA tiap LP

BTA Leprae :

Tidak ditemukan BTA dalam 100 LP

Ditemukan 1-10 BTA dalam 100 LP

Ditemukan 1-10 BTA dalam 10 LP

+ ditemukan 10-99 BTA dalam 100 LP

Pengecatan Gram
Filed under: Bakteriologi, MyCollage 1 Komentar
Januari 31, 2011

Maksud dari pengecatan ini adalah untuk mengetahui bentuk dan sifat bakteri terhadap
pengecatan Gram, yang berwarna merah termasuk kelompok bakteri yang Gram negatif
sedangkan yang berwarna ungu adalah kelompok bakteri yang bersifat gram positif.

a) Persiapan

1) Sediaan yang ingin dicat

2) Larutan karbol gentian/kristal violet :

Kristal / gentian violet : 1 gr

Alkohol 96% : 10 ml

Aquadest : 87 ml

Fenol : 3 ml

Kristal/ gentian violet digerus dalam mortar sampai hancur, kemudian dilarutkan dalam
alkohol dan ditambahkan Aquadest dan fenol, selanjutnya larutan ini disaring dengan kertas
saring kedalam botol yang berwarna dan disimpan pada tempat yang gelap.

3) Alkohol 96%

4) Larutan Lugol :

Iodium kristal : 1 gr

Kalium iodide : 2 gr

Aquadest : 300 ml

Iodium dan kalium iodide digerus bersama-sama dalam mortar dan ditambahkan Aquadest
sedikit demi sedikit sambil digerus sampai larut. Larutan ini disaring kedalam botol yang
berwarna dan sisa aquadest semuanya dimasukkan kedalam botol melalui kertas saring.

5) Larutan Air Fuchsin :

Basic fuchsin : 1 gr

Alkohol 96% : 10 ml
 Aquadest : 90 ml

Basic fuchsin digerus dalam mortar sampai hancur, dilartukan dalam alkohol kemudian
aquadest ditambahkan selanjutnya saring kedalam botol yang berwarna.

b) Cara pengecatan dan pembacaan hasil

Sediaan yang telah difiksasi dan dingin, dicat dengan larutan karbol gentian / kristal
violet selama 1 menit.

Zat warna dibuang dicuci dengan aquadest dan dicat dengan larutan lugol selama 1
menit.

Larutan zat warna dibuang dan sediaan dicuci dengan alkohol 96% sampai semua zat
warna keluar.

Sediaan dicuci dengan aquadest.

Sediaan dicat dengan larutan fuchsin selama 30 detik.

Bilas dengan aquadest dan sediaan dimiringkan.

Setelah kering, kemudian diperiksa pada mikroskop dengan menggunakan lensa

objektif 100 x.

Diperiksa minimal 100 lapangan pandang, dilaporkan bentuk dan sifat bakteri terhadap
pengecatan Gram serta jumlah bakteri secara semi kuantitatif.

Negatif ( ) : tidak ditemukan bakteri

+ : jumlah bakteri < 100 dalam 100 LP

++ : jumlah bakteri antara 100 200 dalam 100 LP

+++ : jumlah bakteri antara 201 300 dalam 100 LP

++++ : jumlah bakteri > 300 dalam 100 LP.

Untuk bahan dari secret alat kelamin, maka Diflokokus gram negatif yang ada dilaporkan
apakah intra atau ekstraseluler, sedangkan clue cell yang ada dilaporkan dalam jumlah
persentase, sedangkan untuk spesimen sputum jumlah PMN dilaporkan rata-ratanya per
lapangan pandang ( objektif 10X dan okuler 10 X ).
Pewarnaan Kapsula Bakteri

Kebanyakan bakteri mengeluarkan lendir pada permukaan selnya yang melapisi dinding sel.
Jika lapisan lendir ini cukup tebal dan kompak maka disebut dengan kapsula. Pada beberapa
bakteri adanya kapsula menunjukkan sifat yang virulen. Kapsula bakteri tidak berwarna
sehingga untuk mengetahui ada tidaknya kapsula bakteri perlu dilakukan pewarnaan khusus
(Hastuti, 2008). Pewarnaan ini bisa dilakukan dengan menggunakan nigrosin, merah kongo
atau tinta cina. Setelah ditambahkan pewarna yang tidak menembus kapsul, maka kapsul
dapat tampak dengan menggunakan mikroskop cahaya. Ini merupakan penampilan negatif
kapsul yang terlihat jernih dengan latar belakang gelap (Schlegel, 1994).

Kapsula merupakan lapisan polimer yang terletak di luar dinding sel. Jika lapisan polimer ini
terletak berlekatan dengan dinding sel maka lapisan ini disebut kapsula. Tetapi jika polimer
atau polisakarida ini tidak berlekatan dengan dinding sel maka lapisan ini disebut lendir
(Darkuni: 2001). Baik kapsula maupun lendir terdiri dari polisakarida dan polipeptin
(komplek polisakarida dengan protein). Kapsula bukan organ yang penting untuk kehidupan
sel bakteri. Hal ini terbukti bahwa sel bakteri yang tidak dapat membentuk kapsula mampu
tumbuh dengan normal dalam medium. Kapsula berfungsi dalam penyesuaian diri dengan
lingkungannya. Misalnya berperan dalam mencegah terhadap kekeringan, mencegah atau
menghambat terjadinya pencantelan bakteriofag, bersifat antifagosit sehingga kapsul
memberikan sifat virulen bagi bakteri. Kapsula juga berfungsi untuk alat mencantelkan diri
pada permukaan seperti yang dilakukan oleh Streptococcus muans (Darkuni, 2008).

Hal yang serupa juga dijelaskan dalam Dwidjoseputro (2005) bahwa lapisan lendir terdiri atas
karbohidrat dan pada beberapa spesies tertentu, lendir itu juga mengandung unsur N atau P.
Lendir bukan suatu bagian integral dari sel, melainkan suatu hasil pertukaran zat. Lendir
memberikan perlindungan terhadap kekeringan, seakan-akan merupakan suatu benteng
untuk bertahan. Kapsula merupakan gudang cadangan makanan (Pelczar: 2007). Kapsula
bakteri-bakteri penyebab penyakit (patogen) berfungsi untuk menambah kemampuan bakteri
untuk menginfeksi. Selain itu, bakteri berkapsula juga menyebabkan adanya gangguan lendir
dalam proses industri. (Pelczar:2007). Ukuran kapsula sangat dipengaruhi oleh medium
tempat ditumbuhkannya bakteri tersebut. Pada beberapa kejadian tebalnya kapsula hanya satu
per sekian diameter selnya, namun dalam kasus-kasus lainya ukuran kapsula jauh lebih besar
daripada diameter selnya.
Lapisan kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu diperlukan suatu
pewarnaan khusus. Salah satu cara pewarnaan kapsula menurut Raebiger yaitu dengan
menggunakan pewarna larutan formol-gentian violet Raebiger atau kristal violet. Satu lagi
cara untuk perwarnaan kapsula bakteri adalah dengan pewarnaan negatif (pewarnaan tidak
langsung ). Pada pewarnaan negatif latarbelakangnya diwarnai zat warna negatif sedangkan
bakterinya diwarnai dengan zat warna basa. Kapsula tidak menyerap warna sehingga terlihat
lapisan terang yang tembus dengan latar belakang yang berwarna (Waluyo, Lud: 2007).

Kapsul tidak memiliki aktifitas yang besar

terhadap bahan-bahan cat basa. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau
larut bila dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-
zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama.
Beberapa cara pewarnaan telah dikemukakan dalam usaha memperlihatkan adanya kapsul,
cara tersebut antara lain adalah cara pewarnaan negatif dan cara pewarnaan kapsul (Irianto,
2006). Hasil pewarnaan dengan menggunakan cara pewarnaan negatif menunjukkan bakteri
berwarna merah, sedangkan kapsul tampak sebagai daerah yang kosong di sekitar tubuh
bakteri, dan latar belakang berwarna gelap. Cara pewarnaan negatif ini dikemukakan oleh
Burri-Gins (Irianto, 2006). Menurut Tarigan (1988), pengecatan negatif bertujuan untuk
mewarnai latar belakang atau bidang pandang di bawah mikroskop dan bukan untuk
mewarnai sel-sel mikroba yang diperiksa. Pengecatan negatif dapat digunakan untuk melihat
kapsul yang menyelubungi tubuh bakteri dengan hanya menggunakan satu macam cat saja.
Sedangkan pewarnaan kapsul (pewarnaan positif) pertama dikemukakan oleh Tyler. Dalam
pewarnaan positif ini digunakan senyawa kristal violet 0,18 gram. Hasil dari pewarnaan
kapsula ini adalah kapsul tampak berwarna biru-ungu yang terletak disekitar tubuh bakteri.
Sedangkan bakterinya sendiri berwarna biru kelam (Irianto, 2006).
 PEWARNAAN FLAGELLA
Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Flagel mengakibatkan
bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel adalah sub unit protein yang
disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah. Berdasarkan jumlah dan
letak flagelnya, bakteri dibedakan menjadi monotrik, lopotrik, amfitrik, peritrik dan
atrik.

Prinsip pewarnaan flagella adalah membuat organel tersebut dapat dilihat

dengan cara melapisinya dengan mordant dalam jumlah yang cukup. Dua metode
pewarnaan flagella, yaitu metode Gray dan metode Leifson. Metode Gray digunakan
untuk mendapat hasil yang lebih baik dan mengena walaupun dalam metode ini
tidak dilakukan pencelupan yang khusus.

Pewarnaan Flagella

19.02 Bakteriologi No comments

I. Cara GRAY.

Larutan-larutan yang diperlukan:

Kalium aluin 10% dalam air : 5 ml.

Sublimat 20% dalam air : 2 ml.

Asam tanine 20% dalam air : 2 ml.

Basic-fuchsin 3% dalam : 0,1 ml.

 alkohol kemudian 1 ml alkohol basic fuchsin + 9 ml phenol
5%

Caranya:

1. Di dalam sebuah tabung reaksi dibuatlah suspensi kuman dari tanaman (lebih baik diambil
dari media zwerm agar yaitu media untuk bulu cambuk), 1 ose penuh disuspensikan
dengan 1 ml air garam faal steril.

2. Simpan dalam inkubator 37C selama 2 jam (lebih).

3. Satu ose dari suspensi ini diapuskan di atas objek gelas yang bersih, keringkan dan fiksasi di
atas api 3x.

4. Pulas dengan larutan pewarnaan Gray : 10 detik.

5. Cuci bersih dengan aquadest, kemudian dipulas dengan larutan carbolfuchsin selama 10
detik.

6. Cuci dengan aquadest, keringkan dengan kertas saring atau pada suhu kamar.

7. Lihat dengan mikroskop dan hasil pewarnaan:

Flagella (bulu cambuk) berwarna : merah jambu.

II. Cara LEIFSON (Leifson : J. Bact, 20: 203, 1930).

Larutan pulas Leifson, terdiri dari:

Basic fuchsin : 1 gram.

NaCl : 1 gram.

Asam tanine : 2 gram.

Ketiga zat ini dicampur baik-baik, kemudian 1,7 gram campuran dilarutkan dalam 35 ml
alkohol 95% + 65 ml aquadest. Larutan pulas ini disimpan beberapa minggu dalam botol
bertutup rapat, baru dipakai.

Caranya :

1. Sediakan suspensi bakteri dalam air sampai sedikit keruh, yang diambil dari tanaman agar
atau sediment dari bouillon.
2. Satu tetes dari suspensi diteteskan pada objek gelas sedemikian rupa sehinggga tetesan
mengalir pada objek.

3. Keringkan (biarkan) kering pada suhu kamar, kemudian bubuhi larutan pulas, biarkan 10
menit.

4. Cuci dengan air, bubuhi dengan borax-methylen biru yang encer (1,0 g borax + 0,1 g
methylen biru dalam 100 ml aquadest), biarkan 5-10 menit.

5. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas saring, lihat dengan mikroskop.

6. Hasil pewarnaan:

Flagella : merah jambu.

Badan bakteri : agak kebiru-biruan.

PEWARNAAN ENDOSPORA
Bakteri tertentu seperti Clostridium, Desulfumoculatum (anaerob) dan
Bacillus (aerob) mempunyai kemampuan untuk membentuk suatu struktur dalam sel
pada tempat-tempat yang khas, disebut endospora. Endospora dibentuk apabila
kondisi lingkungan tidak memungkinkan untuk kelangsungan hidup sel vegetatif
bakteri. Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten dan dapat
bertahan dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, dan unsur-
unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi dan bahan-bahan kimia
yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membentuk endospora. Endospora
dikelilingi oleh suatu lapisan yang kedap air (impermeabel) yang disebut selubung
spora. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora
dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.

Letak endospora
1. Sentralis
2. Terminalis
3. Sub terminalis 1 2 3

Tahapan Sporulasi (pembentukan dari bakteri menjadi spora)

Pertumbuhan sel vegetatif menjadi lambat
Membran sel mengkerut ke bagian tengah atau ujung
Terbentuk lapisan dinding sel yang bersifat permeabel (dapat menyerap cairan
terutama yang menguntungkan bakteri)
Membentuk endospora

Prinsip Pewarnaan
Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar endospora sehingga zat warna
primer (malakit hijau) dapat masuk masuk ke dalam endospora sehingga berwarna
hijau. Melalui pendinginan warna primer akan terperangkap di dalam spora, dengan
pencucian zat warna primer yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga
pada saat debri counterstain dengan safranin, sel vegetatif akan berwarna merah

Untuk mempermudah pengamatan, terutama pada spora

bakteri dilakukan metode pewarnaan spora agar peneliti ataupun pengamat mampu melihat
spora, membedakan dengan vel vegetatif ataupun mengamati bentuknya. Menurut Waluyo
(2004) endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal inilah yang
menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan Hijau Malakit. Metode
Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan Hijau Malakit. Pada pengecatan
ini, sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakukan larutan
Hijau Malakit. Teknik ini akan menghasilkan warna hjau pada endospora dan merah pada sel
vegetatif.

Pada pengecatan endospora dengan larutan Hijau Malakit, bakteri penghasil endospora
menunjukkan reaksi positif yaitu larutan Hijau Malakit akan berikatan dengan spora sehingga
saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup Safranin tidak bisa masuk/diikat
oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan
Hijau Malakit tidak dapat diikat (Fardiaz, 1992).

Prosedur pewarnaan spora bakteri adalah sebagai berikut:

1. Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api spritus.

2. Teteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut

3. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa lalu letakkan di atas
tetesan aquades itu kemudian ratakan perlahan-lahan

4. Ambillah kaca benda lain yang bersih lalu letakkan di ats kaca benda sediaan tersebut
sehingga membentuk sudut 450

5. Geserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata, biarkan
sampai mengering

6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api lampu
spritus dengan cepat
 7. Teteskan larutan hijau malakit di atas sediaan itu lalu panaskan sediaan tersebut diatas
nyala api spritus selama 3 menit, jagalah jangan sampai sediaan mendidih atau mengering,
jika mengering, tambahkan tetesan larutan hijau malakit. Selama pemanasan jepitlah sediaan
dengan pinset.

8. Letakkan larutan hijau malakit di atas kawat penyangga yang diletakkan di atas
mangkuk pewarna, lalu biarkan sampai dingin

9. Cucilah kelebihan larutan hijau malakit dengan air kran dalam botol penyemprot

10. Teteskan larutan safranin di atas sediaan tersebut, lalu biarkan selama satu menit

11. Cucilah kelebihan larutan safranin pada sediaan itu

12. Keringkan sediaan dengan kertas penghisap dan amatilah di bawah mikroskop.

Jika pewarnaan ini berhasil dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan berwarna merah,
jika sel membentuk spora maka spora akan Nampak berwarna hijau.

Pewarnaan Negatif (Pewarnaan Burry)

02.11 Bakteriologi No comments

Bahan pulas dipakai tinta-cina, karena itu sering juga disebut pewarnaan tinta-
cina. Pewarnaan Burri dipakai untuk mengetahui adanya golongan spirochaetales dan juga
untuk memperlihatkan adanya selubung (kapsul) pada kuman-kuman yang tertentu seperti
pada Diplococcus pneumoniae, Klebsiella Frielander, dll.

Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang tidak langsung. Kita hanya mewarnai latar
belakang dari bakteri tersebut, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengambil zat-zat warna.
 Pada negatif staining pada umumnya tidak dilakukan fiksasi, maka praktis bakteri tidak
mengalami perubahan-perubahan, tidak mengerut. Dengan demikian pewarnaan negatif
berguna untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk
pengukuran-pengukuran bakteri.

Pada pewarnaan bakteri ini sel-sel kuman kelihatan transparan (terang jernih)
sedangkan latar belakangnya kelihatan gelap (dengan tinta-cina).

a) Spirochaetales (Treponema pallidum, leptospira).

1. Pada objek gelas yang bersih, pada pinggir sebelah kanan diteteskan 1 tetes tinta-cina.

2. Kepada tetesan tinta-cina tersebut, diteteskan 1 tetes bahan yang diperiksa, campur baik-
baik.

3. Dengan sediaan yang lain, campuran itu diratakan pada objek gelas hingga merupakan
lapisan tipis dengan jalan seperti membuat preparat hapus pada pemeriksaan malaria.

4. Keringkan pada suhu kamar kemudian dilihat dengan mikroskop.

5. Dengan pewarnaan ini latar belakang preparat kelihatan agak gelap dan abu-abu, sedangkan
spirochaetanya sendiri tidak mengambil zat warna dan kelihatan tidak berwarna (transparan),
berkilat putih.

b) Pewarnaan selubung (kapsul) kuman.

Selubung kuman kelihatan juga bila diwarnai dengan tinta-cina, karena kapsul itu tidak
menagkap tinta-cina. Dia kelihatan putih dengan latar belakang gelap. Kapsul kelihatan
seperti daerah yang tipis yang tidak berwarna mengelilingi bagian lainnya dari badaan kuman
yang tercat. Untuk melihat tubuh bakteri sendiri dengan jelas, dibubuhi zat warna yang
mudah dilihat yang dapat diambil oleh tubuh kuman itu sendiri, misalnya : carbolfuchsin,
carbolthionine, dll.

pewarnaan kapsul dengan tinta-cina ini bisa juga disempurnakan lagi menurut Cara GINS
dan lazimnya disebut BURRI GINS.

Cara Burri-Gins :
1. Larutan bahan yang diperiksa (umurnya kira-kira 24 jam dalam bouillon) diambil 1 ose
kemudian dicampur dengan campuran tinta-cina dan aquadest (NaCl 0,9%) sama banyak.

2. Setetes dari campuran itu diratakan pada gelas objek yang bersih seperti kalau kita membuat
sediaan apus malaria.

3. Sediaan dikeringkan di udara kemudian direkatkan dengan sublimat jenuh, cuci dengan air
kran.

4. Dipulas denganlarutan karbolthionine, selama kira-kira 5-10 menit.

Larutan karbolthionine, yaitu larutan thionine yang jenuh dalam alkohol, 10 ml. Dicampur
dengan larutan karbol 5% sebanyak 90 ml.

5. Cuci dalam air lalu keringkan dalam udara, lihat dengan mikroskop.

6. hasil pewarnaan :

~ Bakteri warnanya : biru.

~ Kapsul : jernih (terang).

~ Latar belakang : hitam-abu2.

Catatan :

Larutan karbolthionine juga dapat diganti dengan larutan methylen biru 1% hasilnya sama.

Jika karbolthionine diganti dengan carbolfuchsin encer selama 1-3 menit, maka terdapat:
bakteri berwarna merah, kapsul: jernih dan latar belakang: hitam.