Sitotoksik dan Apoptosis-Mendorong Aktivitas triterpen Glikosida dari Holothuria

scabra dan Cucumaria frondosa terhadap Sel HepG2

Juanjuan Wang 1, , Hua Han 2, , Xiangfeng Chen 1, Yanghua Yi 3 dan Hongxiang

Sun 1, *

1 Kunci Laboratorium Hewan Virologi dari Departemen Pertanian, Sekolah Tinggi

Ilmu Hewan, Universitas Zhejiang, Hangzhou 310058, Cina; E-Email:
wjuanjuanhaohao@126.com (J.W.); chenxiangfneg@163.com (X.C.)

2 School of Medicine, Universitas Tongji, Shanghai 200092, Cina; E-Mail:

hanhua@tongji.edu.cn

3 Pusat Penelitian Kelautan Obat, Sekolah Farmasi, Second University Medical

Militer, Shanghai 200433, Cina; E-Mail: yiyanghua@hotmail.com

penulis ini kontribusi sama untuk pekerjaan ini.

* Penulis untuk siapa korespondensi harus ditangani; E-Mail: sunhx@zju.edu.cn;

Tel./Fax: + 86-571-8898-2091.

Menerima: 9 Februari 2014; dalam bentuk revisi: 4 April 2014 / diterima: 8 April
2014 / Diterbitkan: 24 Juli 2014

Abstrak: efek sitotoksik tiga belas glikosida triterpen dari Holothuria scabra dan
Cucumaria frondosa Gunnerus (Holothuroidea) terhadap empat baris sel manusia
terdeteksi dan hubungan sitotoksisitas-struktur mereka didirikan. Kegiatan
apoptosis-inducing dari lebih ampuh glikosida echinoside A (1) dalam sel HepG2
diteliti lebih lanjut dengan menentukan efeknya pada morfologi, mitokondria
transmembran potensial (m) dan ekspresi mRNA tingkat gen terkait apoptosis.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah residu glikosil dalam rantai gula dan
rantai sisi aglycone dapat mempengaruhi sitotoksisitas mereka terhadap sel-sel
tumor dan sitotoksisitas selektif. 1 viabilitas sel secara signifikan menghambat dan
diinduksi apoptosis pada sel HepG2.

1 juga nyata menurun rasio m dan Bcl-2 / Bax mRNA cepat, dan up-diatur tingkat
ekspresi mRNA dari Caspase-3, Caspase-8 dan Caspase-9 dalam sel HepG2. Oleh
karena itu, 1 induksi apoptosis pada sel HepG2 baik melalui jalur intrinsik dan
ekstrinsik. Temuan ini berpotensi mempromosikan penggunaan glikosida ini sebagai
senyawa terkemuka untuk mengembangkan obat antitumor baru.

Kata kunci: scabra Holothuria; Cucumaria frondosa; triterpen glikosida; echinoside

A;

sitotoksisitas; hubungan struktur-aktivitas; apoptosis; mekanisme

1. Perkenalan

kemoterapi konvensional dan ditargetkan agen antineoplastik telah dikembangkan

berdasarkan pada gagasan sederhana bahwa kanker merupakan penyakit genetik
atau epigenetik sel-otonom. Terlepas dari keberhasilan antitumor tinggi, banyak
digunakan saat ini obat-obat kemoterapi menunjukkan cukup efek samping dan
toksisitas kumulatif termasuk imunosupresan, saraf dan cedera gastrointestinal.
Selanjutnya, pengembangan resistensi terhadap kemoterapi dianggap sebagai
hambatan utama untuk pengobatan berbagai jenis kanker, sebagai proporsi penting
dari tumor kambuh dan mengembangkan perlawanan, akhirnya mengakibatkan
resistensi multidrug berikut paparan beberapa obat antikanker dengan struktur
umum dan mekanisme aksi [1 ]. Apoptosis, suatu kematian sel sangat diatur, telah
menjadi masalah kepentingan besar dalam terapi kanker dan onkologi karena
potensi tinggi berbagai agen kemoterapi dalam mendorong apoptosis dalam
berbagai sel kanker [2]. Oleh karena itu, penemuan dan identifikasi produk alami
dan sintetis mampu merangsang apoptosis pada sel kanker telah menjadi tujuan
penting dari penelitian di antitumor farmakologi dan oncotherapy.

produk alam laut yang diturunkan mengandung berbagai senyawa kemoterapi yang
telah terbukti untuk mencegah perkembangan kanker [3]. Beberapa sulfat glikosida
triterpen laut yang diturunkan menunjukkan ganda antiangiogenic dan antitumor
efek [4,5], menunjukkan bahwa mereka glikosida triterpen mungkin menjadi
sumber yang kaya untuk agen terapi kanker. teripang echinodermata bertubuh
lunak seperti cacing yang termasuk ke dalam kelas Holothuroidea [6]. Mereka
memiliki kepentingan ekonomi di negara-negara Asia, terutama di Cina, di mana
beberapa spesies digunakan dalam pengobatan tradisional atau dimakan sebagai
makanan lezat [7,8]. teripang yang mendapatkan perhatian lebih karena fitur
struktural beragam dan bioactivities. Teripang 'glikosida triterpen (holothurins)
digunakan sebagai obat potensial dalam industri farmasi dan sebagai nutraceuticals
dalam industri makanan [9].

Sejauh ini, lebih dari 170 glikosida triterpen telah diisolasi dari teripang [10].
Mayoritas glikosida teripang adalah turunan lanostane dengan 18 (20) aglycone
-lactone dan rantai karbohidrat terkait dengan C-3 dari aglycone yang [6]. Rantai
gula glikosida ini memiliki 2-6 residu monosakarida termasuk xylose, quinovose,
glukosa dan 3-O-methylglucose, dan kadang-kadang 3-O-methylxylose, 3--
methylquinovose, asam 3--methylglucuronic (MeGlc) dan

6--acetylglucose. Mereka juga mungkin berisi salah satu, dua, atau tiga kelompok
sulfat [11,12]. Biasanya, aglikon triterpen menunjukkan 12, 16 dan kelompok 17-
hidroksi dengan 9 (11) atau 7 (8) ikatan ganda, dimana rantai samping diversifikasi
banyak dengan menghadirkan ikatan ganda dan oksidasi sampai batas tertentu
[12,13] . Semua ini terdiri cukup banyak analog holothurin.

Glikosida triterpen telah terbukti menjadi prinsip bioaktif utama teripang, dengan
spektrum yang luas dari kegiatan biologis seperti antijamur, sitotoksik, hemolitik,
dan efek imunomodulator [14-21]. Teripang glikosida triterpen juga telah dianggap
sebagai agen yang bertanggung jawab untuk perlindungan terhadap beberapa
bentuk kanker. Oleh karena itu, banyak penelitian telah dilakukan untuk
mengeksplorasi efek antikanker mereka. Namun, hubungan mereka struktur-
aktivitas dan mekanisme untuk tindakan antikanker belum dijelaskan dengan baik
[9]. Sementara itu, dalam menemukan terapi dari produk alami, selalu preferensi
diberikan kepada senyawa yang memiliki kekhususan tinggi terhadap sel-sel kanker,
dan meminimalkan kerusakan sel-sel normal. Namun, sitotoksisitas selektif glikosida
teripang di neoplastik dibandingkan sel normal belum diteliti dengan baik. Studi
khusus dan sistematis pada struktur-sitotoksisitas dan sitotoksisitas selektif
teripang glikosida triterpen menggunakan serangkaian analog dimurnikan dan
struktural berturut-turut mungkin berguna untuk modifikasi lebih lanjut dan
optimasi dalam mengembangkan obat antikanker baru.

Dalam tulisan ini, tiga belas glikosida triterpen struktural berturut-turut (Gambar 1
dan Tabel 1) diisolasi dari Holothuria scabra Jaeger (1-9) dan Cucumaria frondosa
Gunnerus (13/10) dievaluasi untuk kegiatan sitotoksik mereka terhadap garis sel
neoplastik dan normal untuk menilai kontribusi karakteristik struktural pada
bioactivities dan mempertimbangkan faktor-faktor struktural penting untuk efek
antitumor fundamental dan cytotoxicities selektif glikosida ini. Sementara itu,
echinoside A (1), glikosida lebih kuat dengan membandingkan efek pada
pertumbuhan sel HepG2 karsinoma hepatoma dan hepatosit sel HL-7702 normal,
dipilih untuk menyelidiki lebih lanjut mekanisme aktivitas apoptosis-inducing dalam
sel HepG2.

Gambar 1. Struktur kimia dari triterpen glikosida 1-13 dari H. scabra dan C.
frondosa. Glc: beta-D-glucopyranosyl; MeGlc: 3-O-metil--D-glucopyranosyl; Qui:
beta-D-quinovo-pyranosyl; Xyl: beta-D-xylopyranosyl; S1: Qui- (1 2) -4-O-SO3Na-
Xyl-; S2:

2. Hasil dan Pembahasan

2.1. Sitotoksisitas terhadap Sel Tumor dan Hubungan Struktur-Aktivitas

Aktivitas sitotoksik triterpen glikosida 1-13 menuju hepatoma manusia (HepG2),

kanker serviks manusia (HeLa) dan leukemia manusia (K562) sel diukur dengan
menggunakan assay MTT. Seperti ditunjukkan pada Tabel 2, semua tiga belas
glikosida dipamerkan kegiatan sitotoksik yang tinggi terhadap tiga baris sel tumor
manusia dengan nilai-nilai I50 menjadi 110 ug / mL. Namun, masih ada perbedaan
aktivitas sitotoksik senyawa yang berbeda dengan struktur kimia khusus, terutama
terhadap sel K562. Dalam rangka untuk mengevaluasi kontribusi dari sebagian gula
ke sitotoksisitas terhadap sel tumor, kami membandingkan sitotoksisitas tiga
pasang holothurins termasuk 3 dan 6, 4 dan 8, 10 dan 11, masing-masing. Dua
senyawa per pasang glikosida memiliki aglikon yang sama dengan hanya sedikit
perbedaan dalam rantai gula yang melekat pada C-3 dari aglycone, yaitu, berbeda
terakhir dari bekas dengan penambahan satu atau dua residu monosakarida
(Gambar 1). Semua enam glikosida sangat menghambat pertumbuhan sel HepG2,
HeLa dan K562. Dua glikosida per pasang, mantan memiliki aktivitas sitotoksik lebih
kuat daripada yang terakhir, menunjukkan bahwa potensi sitotoksik dari glikosida
ini menuju sel-sel tumor bisa menurun dengan meningkatnya jumlah residu
monosakarida di sebagian gula. Yan et al. [22] melaporkan sitotoksisitas lima
glikosida triterpen 1, 2, 3, 6 dan B echinoside terhadap kanker lambung manusia
MKN-45 sel dengan nilai IC50 mereka menjadi 1,86, 1,60, 1,59, 2,37 dan
0,18 umol / L, masing-masing. Senyawa 6 berbeda dari 3, dan 1 dari echinoside B
dengan penambahan

dua monosakarida. The cytotoxicities dari 6 dan 1 melawan MKN-45 sel lebih rendah
dibandingkan 3 dan B echinoside, masing-masing. Hal ini juga dilaporkan bahwa 3
memiliki aktivitas sitotoksik lebih kuat dari 6 melawan leukemia HL-60 manusia dan
hepatoma BEL-7402 sel manusia [22].

Zou et al. [27,28] ditentukan sitotoksisitas beberapa glikosida triterpen dari

intercedens Mensamaria terhadap sepuluh baris sel tumor manusia dan
menemukan bahwa intercedenside H menunjukkan aktivitas antitumor lebih
signifikan daripada intercedenside C, terutama pada kanker payudara manusia
MCF-7, IA9s kanker ovarium, kanker ginjal Caki -1, dan melanoma SK-MEL-2 sel.
Intercedenside C berbeda dari intercedenside H oleh hanya tambahan satu
kelompok -D-xylopyranosyl. korelasi tersebut antara aktivitas dan struktur kimia
konsisten dengan temuan kami.

Glikosida triterpen holothuroid memiliki tindakan membranolytic kuat terhadap

membran sel dan model, yang merupakan dasar dari hemolitik mereka, antijamur
dan kegiatan sitotoksik [19]. Struktur kimia termasuk lanostane aglycone bagian,
jenis dan jumlah kelompok glikosil di unit rantai gula, dan beberapa kelompok
fungsional khusus dipengaruhi aksi membranolytic dari glikosida triterpen
holothuroid terhadap membran sel dan model [19]. Oleh karena itu, informasi
tentang hubungan antara aktivitas hemolitik dan rantai gula mungkin berguna
untuk menilai potensi kontribusi rantai gula aktivitas sitotoksik. Kalinin et al. [29]
menunjukkan bahwa kehadiran 3-O-metil di unit monosakarida terminal sangat
meningkat hemolisis tersebut. Avilov et al. [30] menjelaskan alasan dari rasa
hormat dari evolusi. Hal itu dikonfirmasi oleh fakta bahwa cucumarioside A2-2
memiliki aktivitas antitumor lebih aktif daripada cucumarioside A4-2 [31], dengan
satu-satunya perbedaan struktural menjadi kehadiran (A2-2) atau tidak adanya (A4-
2) dari

Kelompok 3-O-metil di unit monosakarida terminal. The sulfatasi rantai gula juga
merupakan faktor yang signifikan terkait dengan bioaktivitas. Kehadiran kelompok
sulfat di C-4 dari residu xilosa pertama melekat C-3 dari aglycone meningkatkan
efek terhadap membran dan aktivitas hemolitik [29], yang juga dikonfirmasi oleh
temuan bahwa sitotoksisitas okhotosides B2 (IC50 13,0 mg / mL) terhadap sel HeLa
yang lebih kuat daripada okhotosides B3 (IC50 17,8 mg / mL) [32]. Kehadiran sulfat
di C-4 dari xylose pertama di pentanosides bercabang memiliki kelompok 3-O-metil
pada monosakarida terminal dapat meningkatkan aktivitas. Namun, sulfat yang
sama dapat menurunkan aktivitas pentanosides bercabang, yang memiliki glukosa
sebagai residu terminal [33]. Baru-baru ini, Zhao et al. [34] dibandingkan kegiatan
antitumor dari echinoside A dan ds-echinoside A in vitro dan in vivo. Ds-echinoside
A adalah triterpen glikosida non-sulfat, yang berasal dari reaksi desulfurisasi dari
echinoside A. ds-echinoside A lebih kuat menghambat kelangsungan hidup sel
HepG2, diinduksi penangkapan siklus sel danapoptosis in vitro, dan pertumbuhan
tumor menghambat in vivo dari 1 [34]. Hasil ini menunjukkan bahwa jumlah residu
gula, kehadiran kelompok 3-O-metil pada unit monosakarida terminal dan kelompok
sulfat dalam rantai samping gula bisa mempengaruhi aktivitas sitotoksik teripang
glikosida triterpen.

Teripang glikosida triterpen memiliki struktur yang cukup rumit dan dapat
dibedakan dengan banyak karakter yang relatif independen, seperti posisi ikatan
ganda dalam sistem siklik dari aglycone, jumlah dan posisi ikatan ganda dalam
rantai sisi aglycone, serta jumlah dan posisi yang berbeda dari hidroksil, kelompok
epoxy, asetil dan kelompok okso di aglycone, kecuali untuk sebagian gula. Pengaruh
rantai samping di aglycone glikosida pada sitotoksisitas terhadap sel tumor juga
dibahas. Di antara 13 glikosida, 5 dan 9 hanya dua senyawa yang mengandung
gugus karbonil pada rantai samping aglycone. Nilai-nilai IC50 dari 5 dan 9 terhadap
HeLa, HepG2, dan sel-sel K562 secara signifikan lebih tinggi daripada glikosida 11
triterpen lainnya. Struktur kimia dari 5, 9 dan 1 sangat mirip dengan pengecualian
bahwa gugus karbonil tambahan hadir di bekas dua senyawa. perbandingan lebih
lanjut sitotoksisitas melawan HeLa, HepG2 dan sel K562 menunjukkan bahwa 5 dan
9 adalah terutama lemah dari 1, menunjukkan bahwa kehadiran kelompok karbonil
pada rantai samping dari aglycone secara signifikan dapat menurunkan
cytotoxicities mereka.

fitur struktural umum yang sama yang dipamerkan oleh 1 dan 6, kecuali untuk
penambahan kelompok epoxy di rantai samping dari aglycone untuk 6. Nilai-nilai
IC50 dari 6 terhadap sel HeLa, HepG2 dan K562 lebih tinggi daripada 1 oleh 25
lipatan. Berbeda dari 1 adalah 7 dan 8, karena penambahan satu gugus hidroksil. Di
antara tiga glikosida tersebut, kegiatan sitotoksik 1 menuju HeLa, HepG2 dan K562
sel juga lebih kuat dibandingkan dengan 7 dan 8 dengan 2-5 kali. Hasil ini
menunjukkan bahwa kehadiran hidroksil dan epoxy kelompok di rantai samping dari
aglycone bisa menurunkan aktivitas sitotoksik terhadap sel tumor. Hal itu juga
dikonfirmasi oleh hasil yang diperoleh dalam penelitian ini bahwa kegiatan
sitotoksik 2 menuju sel HeLa, HepG2 dan K562 secara signifikan lebih kuat daripada
8. Menariknya, 2 dan 8 adalah glikosida dari jenis holostane dengan rantai
karbohidrat yang identik; 2 memiliki

24 (25) obligasi -Double, sementara 8 memiliki gugus hidroksil pada C-25 dalam
rantai samping. Namun, 2 dan 7 berbeda satu sama lain dalam struktur rantai
samping mereka: 2 memiliki ikatan -Double 24 (25) dan 7 memiliki gugus hidroksil
pada C-21. Zhao et al. [35] melaporkan efek sitotoksik 2 dan 7 pada HepG2, B16,
Penambahan Kalsium Karbonat-2, sel HeLa, P388 dan S180 dan aktivitas anti-
metastasis in vitro dan in vivo, dan menemukan bahwa 2 memiliki sitotoksik lebih
kuat dan anti-metastasis kegiatan dari 7. di atas semua, karbonil, hidroksil dan
gugus epoksi pada rantai samping dari aglycone memainkan peran negatif dalam
menghambat tumor sampai batas tertentu.
2.2. Sitotoksisitas selektif pada Tumor dan Normal Sel

Untuk membandingkan cytotoxicities diferensial dari 1-13 di neoplastik

dibandingkan berkembang biak sel normal, aktivitas sitotoksik terhadap sel HL-7702
juga ditentukan dengan menggunakan uji MTT, dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel
2. Semua tiga belas glikosida juga menunjukkan aktivitas sitotoksik ditandai
terhadap HL-7702. Kami menghitung rasio dari nilai IC50 terhadap HL-7702 dan
HepG2 sel untuk mengevaluasi sitotoksisitas selektif mereka pada sel tumor.
Menariknya, kami menemukan bahwa beberapa senyawa yang lebih aktif terhadap
sel tumor seperti 1 dan 10 memiliki rasio yang lebih tinggi, bahkan lebih dari 2,
yang menunjukkan bahwa dua glikosida ini memiliki lebih potensial untuk
dieksplorasi sebagai obat antitumor novel dengan efek samping yang lebih rendah.
Sebaliknya, senyawa triterpen dengan cytotoxicities rendah terhadap sel tumor
tampaknya lebih sensitif terhadap sel-sel normal. Kecenderungan sitotoksisitas
senyawa 1-13 menuju sel NRK ginjal normal manusia adalah konsisten dengan yang
melawan sel-sel HL-7702 (data tidak ditampilkan). Selain itu, kami juga menemukan
bahwa sitotoksisitas selektif glikosida ini terhadap sel tumor itu berkaitan erat
dengan struktur kimianya.

Seperti ditunjukkan pada Tabel 2, empat frondosides, dengan pengecualian dari 11,
dipamerkan sitotoksisitas selektif yang lebih baik terhadap sel tumor dibandingkan
dengan sembilan glikosida lainnya. Terbukti, 11 berbeda dari 10 oleh xylose
tambahan. Meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kegiatan sitotoksik
terhadap sel HL-7702 antara 11 dan 10, sitotoksisitas 10 pada tiga sel tumor lebih
signifikan daripada 11. Oleh karena itu, sitotoksisitas 10 lebih selektif dibandingkan
dengan 11 di neoplastik sel normal vs. Hal ini sejalan dengan hasil tersebut bahwa
potensi sitotoksik glikosida ini menuju sel-sel tumor bisa menurun dengan
meningkatnya jumlah monosakarida dari sebagian gula. Selain itu, 1 dan 2 juga
memiliki sitotoksisitas selektif lebih baik pada sel tumor dibandingkan dengan tujuh
lainnya glikosida dengan aglycone yang sama. Senyawa 1 dan 2 tidak memiliki
kelompok yang mengandung oksigen, sementara tujuh lainnya glikosida
mengandung karbonil, hidroksil atau gugus epoksi di sisi rantai aglycone tersebut.
Hasil ini menunjukkan bahwa kehadiran kelompok-kelompok yang mengandung
oksigen ini juga memiliki pengaruh pada sitotoksisitas selektif glikosida ini terhadap
sel tumor.

2.3. Apoptosis-Mendorong Pengaruh 1 di Sel HepG2

Senyawa 1 memiliki aktivitas antitumor kuat dan efek sitotoksik yang lebih rendah
pada sel normal di antara tiga belas glikosida. Telah menunjukkan bahwa 1 adalah
Top2 non-intercalative baru inhibitor menargetkan Top2a oleh interferensi unik
dalam DNA mengikat dan penurunan pembelahan DNA Top2-dimediasi dan
degradasi [36]. Senyawa 1 juga telah terbukti menunjukkan aktivitas antikanker
yang ditandai dalam sel HepG2 dengan menghalangi perkembangan sel-siklus dan
menginduksi apoptosis melalui intrinsik (mitokondria) jalur [34]. Namun, kontribusi
ekstrinsik (reseptor kematian) jalur dalam efek apoptosis-inducing dari 1 belum
dibuat jelas. Oleh karena itu, kami diteliti lebih lanjut pertumbuhan-penghambat
dan aktivitas apoptosis-inducing dari 1 dan mekanisme dengan menggunakan sel
HepG2.

Untuk menentukan dampak dari 1 pada viabilitas sel HepG2, sel-sel dikultur dengan
1 pada konsentrasi yang berbeda selama 6 jam dan 12 jam, dan viabilitas sel diukur
dengan menggunakan uji MTT. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, 1 secara
signifikan menghambat kelangsungan hidup sel HepG2 secara waktu dan
tergantung konsentrasi dalam sempit efektif rentang konsentrasi 2.253 ug / mL.
Senyawa 1 tidak dipengaruhi viabilitas sel pada konsentrasi 2,25 ug / mL. Namun,
sel-sel HepG2 benar-benar dihambat oleh 1 pada konsentrasi 3 mg / mL. Hasil ini
menunjukkan bahwa sel HepG2 cukup sensitif terhadap 1.

Induksi apoptosis pada sel kanker telah muncul sebagai kemungkinan yang menarik
untuk pengembangan terapi kanker selektif [37]. Apoptosis ditandai dengan ciri-ciri
morfologi yang berbeda seperti penyusutan sel, kehilangan kontak dengan sel
tetangga, pembentukan vakuola cytoplastic, kromatin kondensasi, blebbing nuklir
membran, fragmentasi DNA oligonucleosomal, dan akhirnya pemecahan sel dalam
unit yang lebih kecil (badan apoptosis). Untuk lebih mencirikan aktivitas antikanker
dari 1, disorganisasi inti dengan perubahan kromatin dalam sel HepG2 diobati
dengan 1 pada konsentrasi 2,5 dan 2,75 ug / mL selama 8 jam ditandai
menggunakan akridin oranye (OA) dan Hoechst 33342 pewarnaan di bawah
mikroskop fluoresensi . Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, setelah
pewarnaan dengan AO, DNA dalam inti sel kontrol memiliki homogen Kelly
fluoresensi, sedangkan sel 1-diperlakukan menunjukkan fitur apoptosis khas
ditandai dengan penurunan volume, kondensasi kromatin, dan fragmentasi nuklir
dengan padat Kelly noda fluoresensi, dan penampilan tubuh apoptosis. Hoechst
33342 pewarnaan uji menunjukkan bahwa sel-sel juga menunjukkan fitur apoptosis
seperti penyusutan nuklir, kondensasi kromatin, dan fragmentasi dalam cara yang
tergantung konsentrasi setelah pengobatan dengan 1 selama 8 jam (Gambar 3b).
Hasil ini menunjukkan bahwa

1 dapat menginduksi apoptosis pada sel HepG2.

Gambar 2. Pengaruh 1 pada viabilitas sel sel HepG2. Sel HepG2 diperlakukan
dengan berbagai konsentrasi 1 untuk 6 dan 12 jam, dan viabilitas sel diukur dengan
menggunakan MTT yang

pengujian kadar logam. Nilai-nilai disajikan sebagai berarti SD (n = 5).

Gambar 3. Perubahan morfologi sel HepG2 setelah pengobatan dengan 1 selama 8

jam. (A) perubahan morfologi divisualisasikan di bawah mikroskop fluoresensi
setelah akridin oranye (OA) pewarnaan; (B) perubahan morfologi divisualisasikan di
bawah mikroskop fluoresensi setelah Hoechst 33342 pewarnaan. Angka-angka yang
ditampilkan adalah perwakilan dari tiga percobaan independen.

Transmembran potensi mitokondria (m) runtuhnya telah terbukti memainkan

peran penting dalam mediasi apoptosis. JC-1 adalah probe neon yang ideal untuk
mendeteksi perubahan m, yang menunjukkan fluoresensi merah sebagai JC-1
agregat dalam matriks mitokondria di bawah potensi tapi hijau fluoresensi
mitokondria setinggi bentuk monomer bawah potensi rendah. Oleh karena itu, kami
mengukur m di

1-diperlakukan sel HepG2 dan sel kontrol menggunakan JC-1 pewarnaan, dan
hasilnya ditunjukkan pada Gambar 4.

Agregat JC-1 dalam mitokondria normal pada sel HepG2 itu tersebar ke bentuk
monomer (fluoresensi hijau) setelah pengobatan dengan 1 selama 6 jam. Selain itu,
kehebatan dari fluoresensi hijau di sel HepG2 signifikan ditingkatkan dengan
peningkatan konsentrasi 1. Setelah pengobatan dengan 1 di

3 mg / mL, fluoresensi merah menghilang dan fluoresensi hijau murni hanya terjadi
pada sel HepG2. Hasil ini menunjukkan bahwa 1 secara signifikan menurunkan m
dalam sel HepG2 dan selanjutnya dikonfirmasi partisipasi mekanisme terkait
mitokondria dalam apoptosis pada sel HepG2 1-diobati.

Gambar 4. mitokondria transmembran perubahan potensial sel HepG2 1-

diperlakukan diwarnai dengan JC-1 pada konsentrasi 0 mg / mL (a); 2,5 mg / mL (b);
2,75 mg / mL (c) dan

3,0 mg / mL (d). Angka-angka yang ditampilkan adalah perwakilan dari tiga

percobaan independen.

Bcl-2 anggota keluarga dapat mengubah permeabilitas membran mitokondria, dan

melepaskan sitokrom c atau mengaktifkan caspase kaskade. Ada dua kelas protein
regulasi di Bcl-2 keluarga yang memiliki efek berlawanan pada apoptosis: Para
anggota anti-apoptosis (Bcl-2 dan Bcl-XL) melindungi sel terhadap beberapa bentuk
apoptosis, sedangkan anggota pro-apoptosis (Bax dan Bcl-xS) mempromosikan
kematian sel terprogram. Sebagai penurunan rasio antara anti-apoptosis gen Bcl-2
dan gen pro-apoptosis Bax mRNA ekspresi secara luas dianggap sebagai ciri khas
apoptosis, tingkat ekspresi Bcl-2 dan Bax mRNA dalam sel HepG2 pertama kali
terdeteksi. Senyawa 1 secara signifikan menurunkan rasio ekspresi Bcl-2 / Bax
mRNA dalam sel HepG2 dalam waktu dan tergantung konsentrasi cara (Gambar 5),
menunjukkan bahwa 1 dapat menginduksi kematian sel apoptosis dengan
mengubah tingkat ekspresi gen dari dua Bcl- ini 2 anggota keluarga.

Gambar 5. Pengaruh 1 pada rasio tingkat ekspresi antara Bcl-2 dan Bax mRNA
dalam sel HepG2. sel HepG2 diinkubasi dengan 1 di berbagai konsentrasi untuk
waktu yang berbeda. Tingkat ekspresi mRNA dari -aktin, Bcl-2, dan Bax terdeteksi
oleh RT-PCR menggunakan primer spesifik. Nilai-nilai disajikan sebagai berarti SD
(n = 3). Perbedaan signifikan dengan kelompok kontrol yang tidak diobati
ditetapkan sebagai * p <0,05,

** P <0,01 dan *** p <0,001.

Caspases memainkan peran penting dalam apoptosis sel. Aktivasi caspase

tampaknya langsung bertanggung jawab untuk banyak perubahan molekuler dan
struktural dalam apoptosis. Proses caspase-dependent dikaitkan dengan dua jalur
antikanker obat-induced apoptosis, yang ekstrinsik (reseptor kematian) jalur dan
intrinsik (mitokondria) jalur [38]. Jalur ekstrinsik dimulai oleh ligan kematian, seperti
FasL, menyebabkan pembelahan pro-Caspase-8 menjadi bentuk aktifnya, yang
kemudian mengaktifkan efektor hilir seperti Caspase-3. Jalur intrinsik ditandai
dengan disfungsi mitokondria, mengakibatkan pengurangan potensi transmembran
mitokondria, translokasi mitokondria dari protein Bax pro-apoptosis, sitokrom c rilis
dan aktivasi caspases efektor hilir seperti Caspase-9 [39,40]. Caspase-3 adalah
salah satu efektor hilir keluarga caspase, dan dianggap melibatkan kedua jalur
apoptosis mitokondria dan jalur reseptor kematian. Untuk menunjukkan peran dua
jalur ini di apoptosis sel HepG2 disebabkan oleh 1, kita lanjut mengukui tingkat
ekspresi Caspase-3, Caspase-8 dan Caspase-9 mRNA. Seperti ditunjukkan dalam
Gambar 6a, dibandingkan dengan mengontrol sel, tingkat ekspresi Caspase-3 mRNA
dalam sel HepG2 adalah nyata up-diatur oleh 1 dalam sopan santun waktu dan
tergantung dosis. Senyawa 1 juga secara signifikan up-diatur tingkat ekspresi
Caspase-8 dan Caspase-9 mRNA dalam sel HepG2. Namun, tidak ada perbedaan
yang signifikan dalam tingkat ekspresi Caspase-8 dan Caspase-9 mRNA antara sel
HepG2 diobati dengan 1 pada konsentrasi yang berbeda selama 2 jam (Gambar 6b),
yang mirip dengan efek yang cepat yang diamati antara 2,5-3 mg / mL dalam assay
MTT. hasil ini menyarankan bahwa 1 mengakibatkan kematian sel apoptosis pada
sel HepG2 melalui aktivasi ekstrinsik dan jalur apoptosis intrinsik.
Gambar 6. Pengaruh 1 pada tingkat ekspresi mRNA dari Caspase-3, Caspase-8 dan
Caspase-9 dalam sel HepG2. sel HepG2 diinkubasi dengan 1 di berbagai konsentrasi
untuk waktu yang berbeda. Tingkat ekspresi mRNA dari -aktin, Caspase-3,
Caspase-8 dan Caspase-9 yang terdeteksi oleh RT-PCR menggunakan primer
spesifik. (A) mRNA ekspresi Caspase-3 dalam sel HepG2; (B) mRNA ekspresi
Caspase-8 dan Caspase-9 dalam sel HepG2. Nilai-nilai disajikan sebagai berarti
SD (n = 3). perbedaan yang signifikan dengan

kelompok kontrol yang tidak diobati ditetapkan sebagai * p <0,05, ** p <0,01 dan
*** p <0,001.

3. Bagian Eksperimental

3.1. Detail umum

3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), akridin oranye

(AO), cis-diamminedichloroplatinum (CDDP, obat positif) dan Hoechst 33342 dibeli
dari Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO, USA; Medium RPMI-1640 dan serum janin
anak sapi (FCS) berasal dari Gibco, Grand Island, NY, USA; JC-1 sensor potensi
mitokondria (JC-1) dan Trizol reagen diperoleh dari Invitrogen Co, Carlsbad, CA, USA;
revertAid M-MuLV reverse transcriptase, diethylpyrocarbonate (DEPC),
ribonuklease inhibitor, Oligo (dT) 18 dan standar penanda DNA berasal dari Sangon,
Shanghai, Cina.

Tiga belas murni triterpen glikosida (1-13, Gambar 1) diisolasi dari H. scabra Jaeger
(1-9) dan Cucumaria frondosa Gunnerus (10-13) (Holothuriidae) seperti yang
dijelaskan sebelumnya [22-26]. Masing-masing isolat menjadi sasaran analisis
spektroskopi rinci (IR, EI-MS, ESI-MS, HRESI-MS, 1H-NMR,

13C-NMR, 1H-1H COSY, DQCOSY, TOCSY, HMQC, HMBC dan NOESY) untuk
mengidentifikasi kimianya

struktur. Kemurnian setiap glikosida triterpen bertekad untuk menjadi> 98%

menggunakan kolom Symmetry C18 (250 mm 4,6 mm nomor pembayar,
ukuran partikel 5 m) dan Waters 2996 detektor PDA pada instrumen Air 600E HPLC.
Sebuah solusi senyawa saham dengan konsentrasi 1 mg / mL dibuat dengan
melarutkan dalam larutan buffer fosfat (PBS). Larutan disterilkan dengan
melewatkan melalui 0,22 pm Millipore filter, dan kemudian diencerkan dengan
medium RPMI-1640 dengan konsentrasi yang diinginkan sebelum digunakan.

3.2. Garis sel

hepatoma manusia (HepG2), kanker serviks manusia (HeLa), leukemia manusia

(K562) dan hati manusia (HL-7702) sel diperoleh dengan Shanghai Institute of
Biochemistry and Cell Biology, dan dipelihara dalam fase logaritmik pertumbuhan
RPMI-1640 menengah lengkap ditambah dengan

2 mM L-glutamine (Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO, USA), 100 IU / ml penisilin,
100 ug / mL

streptomycin dan 10% FCS pada 37 C di bawah udara dilembabkan dengan 5%

CO2.

3.3. Sel Viabilitas Assay

Pengaruh senyawa 1-13 pada kelangsungan hidup HepG2, HeLa, K562 dan sel HL-
7702 ditentukan dengan uji MIT seperti yang dijelaskan sebelumnya [41]. Secara
singkat, tumor dan sel normal yang diunggulkan pada 1 104 sel / sumur dalam
96-baik piring mikrotiter dan diinkubasi pada 37 C dalam suasana lembab dengan
5% CO2. Setelah 24 jam, senyawa 1-13, yang CDDP obat positif atau medium RPMI-
1640 yang ditambahkan ke dalam setiap sumur, dan piring diinkubasi pada 37 C
untuk waktu yang ditunjukkan. Setiap konsentrasi diulang empat sumur. 50 uL
larutan MTT (2 mg / mL) ditambahkan ke setiap sumur 4 jam sebelum inkubasi
akhir, dan diinkubasi lebih lanjut selama 4 jam. Lempeng disentrifugasi (1400 g, 5
menit) dan MTT untransformed telah dihapus dengan hati-hati oleh pipetting. Untuk
masing-masing dengan baik, 150 uL DMSO adalah

ditambahkan dan absorbansi dievaluasi dalam pembaca ELISA pada 570 nm setelah
15 menit. Tingkat penghambatan dan konsentrasi penghambatan (IC50) nilai 50%
terhadap viabilitas sel dihitung oleh perangkat lunak NDST [42]. Setiap pengujian
dilakukan dalam rangkap tiga.

3.4. Fluoresensi Mikroskop Observasi

sel HepG2 yang diunggulkan pada 1 105 sel / mL ke dalam piring 24-baik dan
kemudian diinkubasi pada suhu 37 C dalam suasana lembab dengan 5% CO2.
Setelah 24 jam, sel-sel diperlakukan dengan 1 pada konsentrasi akhir dari 0, 2,5
dan 2,75 ug / mL selama 8 jam. Setelah dicuci dua kali dengan PBS, sel diwarnai
dengan

100 uL akridin oranye (AO) solusi (10 ug / mL) atau Hoechst 33342 solusi (5 mg /
mL) selama 30 menit,

dan kemudian divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi (Olympus, Tokyo,

Jepang) dengan stimulasi 488 nm dan

emisi 500-520 nm atau stimulasi 350 nm dan emisi 460 nm, masing-masing.

3.5. Pengukuran Mitokondria transmembran Potensi (m)

Setelah pengobatan dengan 1 pada konsentrasi 0, 2,5, 2,75 dan 3 mg / mL selama

6 jam, sel-sel dipanen, dicuci dua kali dengan PBS, dan kemudian diinkubasi dengan
500 uL JC-1 solusi pewarnaan (5 mg / mL) pada 37 C selama 30 menit [43]. Sel-sel
yang bernoda dibilas dua kali dengan PBS dan diresuspensi dalam medium. The
m dipantau dengan menentukan jumlah relatif emisi ganda dari mitokondria JC-1
monomer (fluoresensi hijau) untuk agregat (fluoresensi merah) dengan
menggunakan mikroskop fluorescent Olympus bawah Argon-ion 488 nm eksitasi
laser.

3.6. Analisis RT-PCR

RNA total diekstraksi dengan Trizol reagen (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)
sesuai dengan petunjuk pabrik, dan reverse transkripsi dilakukan seperti
sebelumnya [44]. PCR dilakukan untuk beberapa siklus menggunakan PTC-200
pengendara sepeda termal (Bio-Rad Laboratories, Inc., Berkeley, California, USA)
dengan program berikut denaturasi pada 94 C selama 1 menit, anil selama 50 s,
dan perpanjangan saat 72 C selama 0,5 menit. Primer spesifik, siklus diperkuat
dan anil suhu setiap gen yang tercantum dalam Tabel 3. Semi-kuantitatif RT-PCR
dilakukan dengan menggunakan -aktin sebagai kontrol internal untuk
menormalkan ekspresi gen untuk template PCR. Produk PCR dianalisis dengan
elektroforesis pada 1,5% gel agarose yang mengandung goldview (5 uL / 100 mL),
dan band diperkuat divisualisasikan dan difoto menggunakan Dokumentasi JS-680B
Gel dan Analisis Sistem (Shanghai Peiqing Sains dan Teknologi Co, Ltd ., Shanghai,
Cina). Ukuran fragmen diamplifikasi ditentukan oleh perbandingan dengan penanda
DNA standar.

Tabel 3. urutan Primer dan amplifikasi untuk produk PCR diharapkan.

Tabel 3.

Hitungan

3.7. Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai mean SD dan diperiksa untuk signifikansi statistik

mereka perbedaan dengan t-test pelajar. p-nilai kurang dari 0,05 dianggap
signifikan secara statistik.

4. Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami melaporkan hubungan aktivitas struktur-sitotoksik untuk

glikosida triterpen teripang menggunakan tiga belas analog dimurnikan dan
struktural berturut-turut dari H. scabra dan C. frondosa. Jumlah residu glikosil dalam
rantai gula dan rantai samping di aglycone dapat mempengaruhi tidak hanya
sitotoksisitas terhadap sel tumor, tetapi juga sitotoksisitas selektif dalam neoplastik
dibandingkan sel normal dari glikosida ini. Informasi tentang hubungan struktur-
fungsi ini mungkin berguna untuk modifikasi lebih lanjut dan optimasi dalam
mengembangkan obat antikanker baru. Sementara itu, penelitian kami
menunjukkan bahwa 1 diinduksi apoptosis pada sel HepG2 melalui kedua jalur
intrinsik dan ekstrinsik dan bisa bertindak sebagai obat antitumor novel dengan
sitotoksisitas selektif yang lebih baik.

Ucapan Terima Kasih

Karya ini didukung oleh Grant-in-Aid dari Scientific Key dan Teknologi Tim Inovasi
Provinsi Zhejiang (2010R50031-13), Universitas Cina Dana Ilmiah (No.
2010KLEP007), dan Dana Penelitian Fundamental untuk Universitas Central
(2012FZA6017).

penulis Kontribusi

Hongxiang Sun merancang penelitian; Juanjuan Wang, Hua Han, Xiangfeng Chen,
dan Yanghua Yi dilakukan penelitian; Juanjuan Wang dan Hongxiang Sun
menganalisis data dan terdiri naskah.

Konflik kepentingan

Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.