LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI FITOKIMIA III

Isolasi Senyawa dari Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum

(L.) Griff)

Dosen Pengampu:
Ismiarni Komala, M.Sc., PhD., Apt.
Puteri Amelia, M.Farm., Apt.
Fitriyanti, M.Sc.
Via, M.Si., Apt.

Disusun Oleh:
Kelompok 2D
Farmasi B 2014
Laela Wulandari 11141020000070
Syifa Munika 11141020000072
Sri Sumartini 11141020000079

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLA JAKARTA
DESEMBER/2016
 KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT. Yang Maha Kuasa atas segala limpahan
Rahmat, Taufik dan Hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan laporan
akhir praktikum farmakognosi-fitokimia III yang berjudul Isolasi Senyawa dari
Ekstrak Metanol Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum (L.) Griff).
Tak lupa pula kami menyampaikan ucapan terima kasih kepada dosen
pengampu mata kuliah Praktikum farmakognosi-fitokimia III Ismiarni Komala,
M,Sc., Ph.D., Apt., Puteri Amelia, M.Farm., Apt., Fitriyanti, M.Sc., Via, M.Si.,
Apt. yang telah memberikan bimbingan dan arahan kepada kami.
Harapan kami semoga laporan akhir ini membantu menambah
pengetahuan dan pengalaman bagi para pembaca, sehingga kami dapat
memperbaiki bentuk maupun isi laporan akhir ini sehingga kedepannya dapat
lebih baik.
Laporan akhir ini kami akui masih banyak kekurangan karena
pengetahuan yang kami miliki masih sangat kurang. Oleh kerena itu kami
harapkan kepada para pembaca untuk memberikan masukan-masukan yang
bersifat membangun untuk kesempurnaan laporan akhir ini.

Tangerang Selatan, Desember 2016

Kelompok 2 D

i
 DAFTAR ISI
Cover
Kata Pengantar ........................................................................................................... i
Daftar isi ...................................................................................................................... ii
Bab I Pendahuluan
I.1 Latar Belakang ................................................................................................. 1
I.2 Rumusan Masalah ............................................................................................ 3
I.3 Tujuan .............................................................................................................. 3
Bab II Tinjauan Pustaka
II.1 Pembuatan Ekstrak Daun Handeleum ............................................................ 4
II.1.1 Pendekatan Pemilihan Sampel ......................................................... 4
II.1.2 Penyiapan Ekstrak Kental ..................................................................... 5
II.1.3 Daun Handeleum (Graptophyllum pictum) ........................................ 11
II.2 Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeleum .............................................. 13
II.2.1 Uji Skrining Fitokimia Daun Handeleum ........................................... 14
II.3 Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum secara Partisi (Pemisahan Cair-
Cair) ..................................................................................................................... 17
II.3.1 Fraksinasi ............................................................................................ 17
II.3.2 Pelarut ................................................................................................. 17
II.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik Ekstrak Daun Handeuleum........ 19
II.4.1 Definisi ............................................................................................... 19
II.4.2 Prinsip Kerja ....................................................................................... 19
II.4.3 Keuntungan ......................................................................................... 20
II.4.4 Kondisi Baku ...................................................................................... 20
II.5 Kromatografi Kolom Adsorpsi ..................................................................... 24
II.5.1 Definisi ............................................................................................... 24
II.5.2 Prinsip Kerja ....................................................................................... 24
II.5.3 Elusi .................................................................................................... 25
II.6 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Daun Handeleum ..... 27
II.6.1 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif................................................... 27
II.6.2 Fase Diam dan Fase Gerak ................................................................. 28
II.6.3 Deteksi Daerah Noda .......................................................................... 32

ii
 II.6.4 Identifikasi Senyawa........................................................................... 33
II.6.5 Keuntungan dan Kekurangan KLT Preparatif .................................... 34
BAB III Metodologi
III.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan .................................................................... 35
III.2 Alat dan Bahan .............................................................................................. 35
III.3 Prosedur Kerja ............................................................................................... 38
A.Pembuatan Ekstrak Daun Handeleum ........................................................ 38
B.Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeleum ............................................. 38
C. Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum secara Partisi (Pemisahan Cair-
Cair)..................................................................................................................... 41
D. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik Ekstrak Daun Handeuleum .... 42
E. Kromatografi Kolom Adsorpsi .................................................................. 43
F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Daun
Handeleum .......................................................................................................... 43
BAB IV Hasil Pengamatan
IV.1 Pembuatan Ekstrak Daun Handeleum ........................................................... 45
IV.2 Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeleum ............................................... 45
IV.3 Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum secara Partisi (Pemisahan Cair-
Cair)..................................................................................................................... 48
IV.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik Ekstrak Daun Handeuleum ........ 49
IV.5 Kromatografi Kolom Adsorpsi ...................................................................... 52
IV.6 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Daun Handeleum ..... 53
BAB V Pembahasan
V.1 Pembuatan Ekstrak Daun Handeleum ............................................................ 56
V.2 Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeleum................................................. 57
V.3 Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum secara Partisi (Pemisahan Cair-
Cair)..................................................................................................................... 60
V.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik Ekstrak Daun Handeuleum .......... 62
V.5 Kromatografi Kolom Adsorpsi ....................................................................... 64
V.6 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Daun Handeleum ....... 65
BAB VI Kesimpulan .............................................................................................. 71
Daftar Pustaka ........................................................................................................ 74

iii
Lampiran ................................................................................................................. 78

iv
 BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Tanaman obat telah mengalami peningkatan yang cukup signifikan dalam
bentuk pengembangan kerja sama beberapa tahun terakhir. Pada pemanfaatannya
tidak hanya melibatkan aspek kesehatan saja, tetapi juga aspek lainnya seperti
pelestarian alam, keanekaragaman hayati, ekonomi, perdagangan maupun hukum.
Sampai dengan saat ini, mayoritas penduduk dunia masih bergantung pada obat-
obatan tradisional baik dalam bentuk mentah maupun dalam bentuk ekstraknya
(Abdel-Azim et al., 2011).
Tanaman handeuleum berasal dari Irian dan Polynesia, dapat ditemukan
dari dataran rendah sampai pegunungan dengan ketinggian 1.250m dpl. Tanaman
ini merupakan tanaman yang tegak, tingginya mencapai 2 meter atau lebih dan
yang pasti daunnya berdaun ungu. Tanaman ini sering ditemukan tumbuh liar di
pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias dan tanaman pagar. Tumbuh baik
pada tempat-tempat terbuka yang terkena sinar matahari, dengan iklim kering atau
lembap.
Berdasarkan penelitian sebelumnya, daun handeuleum mengandung
alkaloid, glikosida, steroid, saponin, klorofil dan lendir (Dali martha, 1999).
Penelitian yang dilakukan oleh Ros sumarni, dkk (2013) menyatakan bahwa daun
ini juga mengandung tanin, alkaloid dan sitosterol. Penelitian lain yang
mendukung bahwa daun ini mengandung alkaloid, glikosida, pektin, asam format,
steroid, saponin, tannin, flavonoid dan alkohol (Keng SB, Lim M., 1996;
Wahyuningtyas E, 2005). Daun handeuleum digunakan untuk obat wasir, laksatif
lemah diuretik ringan, dan untuk anti inflamasi (Ros Sumarny, dkk 2013).
Alkaloid merupakan senyawa organik bahan alam yang terbesar
jumlahnya baik dari segi jumlah maupun sebarannya. Harborne dan Turner
(1984, dalam Trengginas, F. (2012) menyatakan bahwa alkaloid adalah senyawa
metabolid sekunder yang bersifat basa, yang mengandung satu atau lebih atom
nitrogen dengan sepasang elektron bebasnya, dalam bentuk cincin heterosiklik
dan bersifat aktif biologis menonjol. Efek biologisnya yang menyegarkan tubuh
sampai toksik. Satu contoh yang sederhana adalah nikotina yang dapat

1
menyebabkan penyakit jantung, kanker paru-paru, kanker mulut, tekanan darah
tinggi, dan gangguan terhadap kehamilan dan janin. Oleh karena itu, penulis
tertarik mengisolasi senyawa alkaloid dari daun handeuleum.
Abdel-Azim et al. (2011) menyatakan bahwa proses ekstraksi merupakan
langkah utama dalam penelitian tanaman obat, karena proses ini adalah langkah
awal dari proses isolasi dan purifikasi konstituen pada tanaman tersebut.
Pourhossein et al. (2009) berpendapat bahwa ekstraksi ultrasonik termasuk salah
satu alternatif dari preparasi sampel padat, karena dapat mepermudah dan
mempercepat beberapa langkah preparasi, seperti pelarutan, fusi dan leaching. Hal
ini dikarenakan efek dari gelombang ultrasonik yang membentuk local high
temperature dan gerakan mekanik antarmuka zat padat dan zat cair, sehingga akan
mempercepat laju perpindahan massa-nya. Beberapa kinetika proses juga dapat
dipercepat dengan efek gelombang ultrasonik (De la Fuente et al., 2004).
Ekstrak tanaman dapat dijadikan sebagai obat tradisional karena
mengandung senyawa yang memperlihatkan aktifitas biologis tertentu.
Kandungan dalam ekstrak daun handeuleum yaitu alkaloida yang tidak beracun,
glikosida, steroida, saponin, klorofil, lendir, flvonoid, tanin, pektin asam format,
dan alkohol.
Maka dari itu, diperlukan suatu identifikasi senyawa dalam ekstrak
tersebut untuk pengembangan obat herbal. Profil kromatografi dapat digunakan
untuk mengidentifikasi senyawa dalam ekstrak dan dalam beberapa tahun terakhir
profil kromatografi digunakan sebagai salah satu metode kontrol kualitas ekstrak
(Liang et al., 2004). Pada penelitian ini digunakan ekstrak metanol, n-heksan, dan
etil asteat daun handeuleum.
Ekstrak yang telah didapatkan dipisahkan agar senyawa-senyawa yang
telah teridentifikasi pada ekstrak metanol daun handeuleum dapat terpisah
berdasarkan kepolaran dan berat jenisnya. Pada ekstraksi cair-cair, bahan yang
menjadi analit berbentuk cair dengan pemisahannya menggunakan dua pelarut
yang tidak saling bercampur sehingga terjadi distribusi sampel di antara kedua
pelarut tersebut.
Kromatografi kolom ditujukan untuk memisahkan senyawa-senyawa pada
ekstrak daun handeuleum secara lebih spesifik dari hasil KLT karena

2
menggunakan grdien pelarut yang lebih banyak. Prinsip kromatografi kolom
adsorpsi yaitu pemisahan suatu zat dalam eluen yang bergerak melalui fase diam
sebagai adsorben dikarenakan adanya perbedaan daya adsorpsi pada komponen-
komponen tersebut. Pada penelitian ini digunakan ekstrak N-heksan daun
handeuleum.
KLT Preparatif (KLTP) ditujukan untuk menghasilkan senyawa yang bisa
digunakan untuk proses kromatografi selanjutnya ataupun untuk dianalisa secara
spektrometri. Kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi
murni campuran (Gritter et al., 1991). Prinsip KLTP yakni isolasi berdasarkan
perbedaan daya serap dengan kecepatan yang berbeda sehingga terjadi pemisahan.
I.2 Rumusan Masalah
Bagaimana metode isolasi senyawa pada Daun Handeuleum
(Grapthophyllum pictum).
I.3 Tujuan
Laporan akhir praktikum ini bertujuan untuk mengetahui metode isolasi
senyawa pada Daun Handeuleum (Grapthophyllum pictum).

3
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Pembuatan Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum)

II.1.1 Pendekatan pemilihan sampel
Ada beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menemukan
induk obat baru dari alam, dan semuanya pernah digunakan oleh
perusahaan farmasi dalam upaya memanfaatkan potensi hayati bahan alam
yaitu :
a) Pendekatan etnobotani
Pengetahuan tentang penggunaan tumbuhan tertentu oleh
penduduk asli dimanfaatkan untuk mengarahakan pencarian induk obat
baru, biasanya dilakukan oleh ahli botani dan kemudian menguji aktivitas
biologisnya.
b) Pendekatan kemotaksonomik
Pengetahuan bahwa suatu kelompok tumbuhan khusus
mengandung golongan bahan alam tertentu yang dimanfaatkan untuk
memperkirakan bahwa tumbuhan sejenis secara taksonomi mungkin
mengandung senyawa yang secara struktural mirip. Pendekatan ini sangat
bermanfaat jika aktivitas kimia dan biologi senyawa diketahui dengan baik
serta senyawa berstruktur kimia yang sama perlu diuji biologis lebih
lanjut.
c) Pendekatan acak
Tanaman dikumpulkan tanpa memperhatikan aktivitas kimia atau
biologis yang telah ada sebelumnya. Pendekatan ini tergatung pada
ketersediaan tanaman yang melimpah di wilayah tertentu. Pendekatan ini
murni coba-coba karena seleksi tanaman secara acak akan mengarah pada
penemuan ekstrak yang memiliki aktivitas biologis (bioaktivitas).
d) Pendekatan berbasis-informasi
Memanfaatkan kombinasi pendekatan etnobotani, kemotaksonomi
dan acak bersama dengan mengumpulkan data yang memiliki semua
informasi yang relevan mengenai spesies tumbuhan tertentu. Kumpulan

4
data ini digunakan untuk memprioritaskan tanaman yang harus diekstrasi
dan diskrining untuk mencari bioaktivitasnya.
e) Pendekatan fitokimia
Pemilihan sampel berdasarkan kandungan kimianya.
f) Pendekatan farmakologis
Pemilihan sampel berdasarkan bioaktivitasnya.
II.1.2 Penyiapan Ekstrak Kental
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan
mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani
menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua
pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan
sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Ekstraksi
merupakan serangkaian proses untuk menghasilkan ekstrak.
a) Ekstraksi secara maserasi
Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut
organik yang digunakan pada suhu ruangan. Proses ini sangat
menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena dengan
perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan
membran sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel, sehingga
metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut
organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur lama
perendaman yang digunakan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi
akan memberikan efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan
senyawa bahan alam pelarut tersebut (Darwis,2000).
Keuntungan dari metode ini adalah peralatannya mudah ditemukan
dan pengerjaannya sederhana. Kerugian dari metode maserasi antara lain
waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi sampel cukup lama, cairan
penyari yang digunakan lebih banyak, tidak dapat digunakan untuk bahan-
bahan yang mempunyai tekstur keras seperti benzoin dan lilin (Sudjadi,
1986). Pembuatan ekstrak dengan metode maserasi mengikuti syarat yaitu
bahan dihaluskan dengan cara dipotong-potong atau dibuat serbuk,
kemudian disatukan dengan bahan pengekstraksi (Voight, 1994). Waktu

5
lamanya maserasi berbeda-beda, masing-masing farmakope
mencantumkan 4-10 hari, menurut pengataman 5 hari sudah memadai
(Voight, 1994). Metode ini tidak menggunakan pemanasan, sehingga zat
aktif yang terkandung dalam bahan tidak rusak.
b) Ekstraksi secara sonikasi
Ekstraksi sonikasi merupakan metode non thermal yang digunakan
dalam proses peningkatan rendemen ekstraksi dan pengurangan waktu
ekstraksi senyawa - senyawa polifenol, antosianin, aromatik, polisakarida,
dan senyawa fungsional lainnya (Vilkhu et al., 2006). Metode ini
menggunakan gelombang ultrasonik yaitu gelombang akustik dengan
frekuensi lebih besar dari 20 kHz (Suslick et al.,1986). Gelombang
tersebut akan meningkatkan permeabilitas sel dinding dan menghasilkan
kavitasi. Teknik ini dikenal dengan sonokimia yaitu pemanfaatan efek
gelombang ultrasonik untuk mempengaruhi perubahan-perubahan yang
terjadi pada proses. Alat yang digunakan pada metode ini disebut dengan
sonikator.

Gambar 2.1 Ultrasonic bath

(Sumber : http://www.progensci.co.uk/)
1) Definisi ultrasonik
Ultrasonik adalah salah satu bentuk dari energi yang dihasilkan
gelombang suara dengan frekuensi di atas deteksi telinga manusia,
yaitu antara 20 kHz 500 MHz (Thompson and Doraiswamy, 1999).
Literatur lain menyatakan bahwa prosedur yang menggunakan
gelombang ultrasonik melibatkan penggunaan USG dengan frekuensi
mulai dari 20 kHz sampai 2000 kHz (www.unido.org). Hal tersebut
menyebabkan ultrasonik dapat diaplikasikan pada rentang disiplin

6
yang cukup luas. Tabel 1 disusun berdasarkan pada frekuensi dan
intensitas suara (Maria van Iersel, 2008).

Tabel 1. Aplikasi Ultrasonik

(Sumber : Maria van Iersel, 2008)
Manfaat iradiasi ultrasonik dalam proses kimia berasal dari dua
proses utama, yaitu acoustic streaming dan acoustic cavitation (Maria
van Iersel 2008).
Acoustic streaming adalah gelombang suara yang dipindahkan
ke dalam cairan, sehingga terbentuk gerakan cairan searah dengan
propagasi gelombang (longitudinal) (Dolatowski et al., 2007). Pemicu
dari acoustic streaming adalah viscous friction saat gelombang suara
melewati cairan, gesekan cairan dan partikel padat serta gelombang
kejut yang berpotensi membentuk turbulensi mikroskopis pada
permukaan film partikel padat (Thompson and Doraiswamy, 1999).
Acoustic streaming menyebabkan semakin tipisnya lapisan batas
antara cairan dan partikel, sehingga dapat meningkatkan kemampuan
penetrasi pelarut seiring meningkatnya difusibilitas dan solvensi
senyawa aktif dalam sel. Pada akhirnya meningkatkan laju
perpindahan panas, massa dan efisiensi ekstraksi (Li et al., 2010).
Acoustic cavitation dimulai dari kelarutan gas ke dalam cairan
sama seperti vaporasi parsial cairan, sehingga fase ini disebut fase
pembentukan gelembung, kemudian fase pertumbuhan gelembung
sampai pecahnya gelembung tersebut. Pada siklus ekspansi (tekanan
negatif) akan dihasilkan energi ultrasonik yang cukup kuat, sehingga
terjadi pembentukan gelembung dan kavitasi dalam cairan (zcan,
2006). Gelembung yang terbentuk memiliki permukaan area lebih

7
besar sehingga akan meningkatan difusi gas yang berakibat pada
pertumbuhan ukuran gelembung. Sampai titik tertentu, dimana energi
ultrasonik tidak cukup lagi untuk mempertahankan fase uap dalam
gelembung udara, sehingga terjadi kondensasi secara cepat, dimana
molekul-molekul bertabrakan dengan keras dan membentuk
gelombang kejut pada daerah dengan temperatur dan tekanan tinggi,
mencapai 5500 C dan 50 MPa (Dolatowski et al., 2007). Daerah itu
dikenal dengan hot spot. Pada kondisi tersebut, kavitasi dikategorikan
sebagai gerakan non-linier karena keruntuhan kavitasi terjadi dalam
waktu relatif sangat pendek dibanding fase ekspansi (Maria van Iersel,
2008). Perubahaan temperatur dan tekanan yang disebabkan oleh
kavitasi (pecahnya gelembung gas) dapat merusak dinding maupun
membran sel partikel (Usaqun-Castro et al., 2006).
Kemampuan ultrasonik menghasilkan kavitasi bergantung pada
karakteristik ultrasonik (frekuensi, intensitas), sifat produk (viskositas,
tegangan permukaan) serta kondisi lingkungan (temperatur, tekanan)
(Dolatowski et al., 2007).
2) Prinsip kerja ultrasonik
Prinsip ekstraksi ultrasonik adalah dengan meningkatkan
transfer massa yang disebabkan oleh naiknya penetrasi pelarut ke
dalam jaringan tumbuhan lewat efek kapiler. Gelembung kavitasi akan
terbentuk pada dinding sel tanaman akibat adanya gelombang
ultrasonik. Efek dari pecahnya gelembung kavitasi ini dapat
mengakibatkan peningkatan pori-pori dinding sel. Gelembung kavitasi
akan terpecah disebabkan oleh tipisnya bagian kelenjar sel tumbuhan
yang dapat mudah rusak oleh sonikasi (Melecchi dkk., 2006).
Medium yang dilewati akan mengalami getaran yang
disebabkan oleh gelombang elektronik. Getaran yang diberikan
gelombang ultrasonik akan memberikan pengadukan yang intensif
terhadap proses ekstraksi. Pengadukan akan meningkatkan osmosis
antara bahan dengan pelarut sehingga akan mempercepat proses
ekstraksi.

8
 Menurut Santos et. al (2009), ada beberapa faktor yang
mempengaruhi proses ekstrasi dengan metode sonikasi yaitu :
1. Frekuensi
Frekuensi merupakan jumlah getaran yang terjadi dalam satu
detik. Pada frekuensi yang tinggi yaitu pada tingkat gelombang MHz,
proses pembentukan kavitasi menjadi lebih sulit dari pada pada
frekuensi rendah (kHz). Dengan tingginya frekuensi, gelombang yang
dihasilkan terlalu rapat sehingga proses pembengkakan dan penyusutan
gelembung mikro terjadi sangat singkat dan pada akhirnya kekuatan
ledakan untuk memecah dinding sel yang dihasilkan oleh gelembung
tersebut sangat rendah.
2. Intensitas
Intensitas sonikasi harus sebanding dengan amplitudo getaran.
Untuk mencapai kavitasi maksimum, diperlukan intensitas yang rendah.
Hal ini menegaskan bahwa tidak diperlukan intensitas yang tinggi untuk
mendapatkan hasil ekstraksi yang baik. Selain itu dengan menggunakan
intensitas yang tinggi, yang terjadi bukanlah proses kavitasi, melainkan
proses agitasi.
3. Pelarut
Pada umumnya aplikasi sonikasi dalam proses ekstraksi
menggunakan pelarut air. Namun, beberapa pelarut lain seperti pelarut
organik dapat digunakan tergantung pada tujuan yang diinginkan.
Semakin tinggi viskositas dan tegangan permukaan, maka pembentukan
kavitasi akan semakin sulit.
4. Suhu
Suhu memberikan dua peranan dalam proses sonikasi. Yang
pertama, penggunaan suhu tinggi dapat membantu mengganggu
interaksi matriks molekul pelarut yang kuat yang melibatkan gaya Van
der Waals, ikatan hidrogen dan interaksi dipol antar molekul. Selain itu
dengan suhu yang tinggi dapat mempercepat proses difusi sehingga
perpindahan massa dari bahan ke pelarut lebih cepat. Yang kedua yaitu
proses pembentukan kavitasi sebaliknya akan lebih cepat terjadi pada

9
suhu yang lebih rendah karena jika menggunakan suhu yang tinggi,
pelarut akan menghasilkan tekanan uap yang kemudian mengisi
gelembung kavitasi yang telah terbentuk. Akibat dari interaksi tersebut,
pecahnya gelembung kavitasi cenderung kurang keras yang
menyebabkan proses sonikasi tidak intens seperti yang diharapkan.
Selain menurunnya intensitas sonikasi, suhu yang lebih tinggi juga
dapat mendekomposisi komponen yang sensitif terhadap panas seperti
antosianin.
3) Kelebihan dan kekurangan alat ultrasonik
Kelebihan :
1. Mempercepat proses ekstraksi.
2. Prosesnya tidak memerlukan biaya tinggi (skala laboratorium)
3. Tidak mengakibatkan perubahan yang nyata pada struktur
kimia, partikel, dan komponen komponen yang terkandung
pada bahan.
4. Efisiensinya lebih besar dibandingkan dengan ekstraksi
konvensional menggukana soxhlet. Selain itu ekstraksi
konvensional menggunakan soxhlet biasanya memberikan laju
perpindahan yang rendah
5. Dapat mengekstrak lebih banyak komponen dibandingkan
dengan soxhlet (Anwar, 2012)
Kekurangan :
1. Dalam aplikasi skala besar terbatas karena dengan biaya yang
lebih tinggi
2. Kadang-kadang, efek merusak energi ultrasound (lebih dari 20
kHz) pada konstituen aktif tanaman obat melalui pembentukan
radikal bebas dan akibatnya terjadi perubahan yang tidak
diinginkan dalam molekul obat.
3. Dapat merusak permukaan bahan. Hal ini dibuktikan dengan
hasil SEM pengirisan jahe (Anwar, 2012). Kerusakan
permukaan tersebut dikarenakan gelombang ultrasonik
menyebabkan kerusakan dinding sel biologis bahan.

10
II.1.3 Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum)

Gambar 2.2 Tanaman Handeuleum

(Sumber: http://www.plantamor.com/index.php?plant=642)
a) Klasifikasi
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Kelas : Dicotyledonae
Famili : Acanthaceae
Genus : Graptophyllum
Spesies : Graptophyllum pictum
Nama umum : Wungu
Nama daerah : Sumatra (pudin), Jawa Tengah (Daun ungu), Jawa
Barat (Handeleum)
( Hutapea dalam Fajriyah 2011 ).
b) Deskripsi Tanaman
Habitus : Perdu, tinggi 2 m
Batang : Berkayu, beruas , permukaan licin, ungu kehijauan
Daun : Tunggal, berhadapan, bulat telur, ujung runcing,
pangkal meruncing, tepi rata, pertulangan menyirip,
permukaan atas mengkilat, panjang 15 25 cm,
lebar 5-11 cm, ungu , ungu tua.
Bunga : Majemuk, diujung batang, pangkal kelopak,
berlekatan, bagian ujung berbagi lima, ungu, benang
seri empat, melekat pada mahkota bunga, tangkai
sari ungu, kepalasa sari ungu kehitaman, putik
bentuk tabung, ujung bertajuk lima, ungu.

11
 Akar : Tunggang dan berwarna coklat muda. (Hutapea
dalam fajriyah, 2013).
c) Khasiat
Daunnya berkhasiat sebagai obat wasir. Untuk obat wasir dipakai
20 gram daun segar handeleum kemudian direbus dengan 2 gelas air
selama 25menit, setelah dingin disaring. Hasil saringan diminum sehari
dua kali sama banyak pagi dan sore (Hutapea dalam fajriyah, 2013). Daun
ungu digunakan untuk obat wasir, laksatif lemah, diuretik ringan, dan
untuk anti inflamasi (Ros Sumarny, dkk 2013 ).
d) Kandungan kimia
Daun handeleum mengandung saponin, flavonoid, dan tannin
(Hutapea dalam fajriyah, 2013). Menurut Sumarny., et al. Daun wungu
mengandung tanin, alkaloid sitosterol dan glikosida.
Adapun macam-macam kandungan dan sifat dari kandungan daun
handeuleum adalah sebagai berikut:

Kandungan kimia Sifat Sumber

pada ekstrak

Saponin Saponin memiliki gugus fungsi glikosil Sangi,dkk., 2008

yang berfungsi sebagai gugus polar.

Tanin Bersifat polar. Ani Isnawati, 2003

Flavonoid Flavonoid memilik gugus hidroksi yang Akbar, 2010

tidak tersubstitusi sehingga bersifat
polar.

Fenolik Bersifat polar. Ani Isnawati, 2003

Alkaloid Alkaloid memiliki basa nitrogen pada Purba, 2001

12
 rantai sikliknya dan mengandung
beragam substituen sehingga alkaloid
bersifat semipolar.

Steroid Steroid tersusun dari isopren-isopren Taufik, dkk.

dari rantai panjang hidrokarbon sehingga
bersifat sangat nonpolar

Glikosida Glikosida merupakan senyawa yang Suryati, 2002

terdiri dari bagian gula dan bukan gula,
serta memiliki sifat sangat polar.

Asam format Mudah larut dalam air dan beberapa Fesenden &
pelarut organic dan berifat polar. Fesenden, 1986

e) Data Standarisasi (Materia Medika Indonesia. 1995)

1. Kadar abu. Tidak lebih dari 12%
2. Kadar abu yang tidak larut dalam asam. Tidak lebih dari 2%
3. Kadar sari yang larut dalam air. Tidak kurang dari 29%
4. Kadar sari yang larut dalam etanol. Tidak kurang dari 6%
5. Bahan organik asing. Tidak lebih dari 2%

II.2 Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeuleum (Graptophyllum

pictum)
Tujuan utama skrining fitokimia adalah menganalisis tumbuhan untuk
mengetahui kandungan bioaktif yang berguna untuk pengobatan (Pedrosa et al..
1978; Farnsworth 1966; Harborne 1966; dalam Mustarichie 2011). Pemeriksaan
dilakukan pada senyawa metabolit sekunder yang memiliki khasiat bagi kesehatan
seperti alkaloid, glikosida, flavonoid, terpenoid, tanin, dan saponin (Harborne,
1987).

13
 Metabolik sekunder adalah hasil metabolisme yang disintesis oleh
beberapa organisme tertentu yang tidak merupakan kebutuhan pokok untuk hidup
dan tumbuh. Meskipun demikian, metabolik sekunder dapat berfungsi sebagai
nutrien darurat untuk pertahanan hidup. Selain itu senyawa-senyawa metabolik
sekunder juga merupakan proses-proses kimia jenis lain yang terjadi hanya pada
spesies tertentu sehingga memberikan produk yang berlainan, sesuai dengan
spesiesnya yang berperan dalam kelangsungan hidup dan perjuangan menghadapi
spesies-spesies lain berupa zat kimia untuk pertahanan, penarik seks, dan feromen
(Manitto, 1981 dalam Martini, 2014). Hasil uji golongan senyawa metabolik
sekunder ini ditandai dengan terjadinya perubahan warna dari serbuk daun
handeuleum setelah ditambahkan pereaksi sesuai dengan uji senyawa yang
dilakukan.
II.2.1 Uji Skrining Fitokimia daun handeuleum (Graptophyllum pictum
(L.) Griff)
a) Identifikasi minyak atsiri
Komponen aroma dari minyak atsiri cepat berinteraksi saat dihirup,
senyawa tersebut secara cepat berinteraksi sistem syaraf pusat dan
langsung merangsang pada sistem olfactory, kemudian sistem ini akan
menstimulasi syaraf-syaraf pada otak di bawah kesetimbangan korteks
serebral (Buckle, 1999). Senyawa-senyawa berbau harum atau fragrance
dari minyak atsiri suatu bahan tumbuhan telah terbukti pula dapat
mempengaruhi aktivitas lokomotor (Buchbauer, 1991).
Menurut literature ada beberapa cara identifikasi minyak atsiri, yakni
:
a. Larutan uji sebanyak 1 mL dipipet lalu diuapkan di atas cawan
porselin hingga diperoleh residu. Hasil positif minyak atsiri
ditandai dengan bau khas yang dihasilkan oleh residu tersebut
(Ciulei, 1984).
b. Larutan uji diteteskan sebanyak 1 tetes pada kertas saring lalu
didiamkan pada temperatur ruangan. Pengamatan dilakukan
terhadap ada atau tidaknya noda yang transparan pada kertas
saring. Hasil positif minyak atsiri ditunjukkan dengan tidak

14
 adanya noda yang transparan pada kertas saring (Gunawan dan
Mulyani, 2004).
c. 1 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi
kemudian ditambahkan 10 ml petroleum eter dan pasang corong
yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi pada mulut tabung.
Lalu dipanaskan selama 10 menit dan disaring sehingga
didapatkan filtrate. Filtrat diuapkan, setelah diuapkan didapatkan
residu. Residu dilarutkan dengan 5 ml alcohol dan disaring.
Setelah itu dididihkan hingga menguap dan residu akan
menghasilkan bau aromatik atau menyenangkan.
b) Identifikasi alkaloid
Larutan uji sebanyak 2 mL diuapkan di atas cawan porselin.
Residu yang dihasilkan kemudian dilarutkan dengan 5 mL HCl 2N.
Larutan yang diperoleh dibagi ke dalam 5 tabung reaksi. Tabung pertama
ditambahkan dengan 3 tetes HCl 2N yang berfungsi sebagai blanko.
Tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorff, tabung ketiga
ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer, tabung keempat ditambahkan 3 tetes
pereaksi Hager, dan tabung kelima ditambahkan 3 tetes pereaksi Wagner.
Terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua, endapan putih pada
tabung ketiga, endapan kuning pada tabung keempat, dan endapan merah
kecoklatan pada tabung kelima menunjukkan adanya alkaloid. Larutan uji
mengandung alkaloid jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan dengan
menggunakan dua golongan laruan percobaan yang digunakan (Depkes
RI, 1995).
c) Identifikasi Flavonoid
Larutan uji sebanyak 1 mL diuapkan hingga kering, dibasahkan
residu dengan aseton P, ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P
dan serbuk halus asam oksalat P, dipanaskan di atas penangas air dan
dihindari pemanasan berlebihan. Ditambahkan dengan 10 mL eter P.
Diamati di bawah sinar UV 366 nm, larutan berfluoresensi kuning intensif
menunjukkan adanya flavonoid (Depkes RI, 1995).
d) Identifikasi Saponin

15
 Larutan uji sebanyak 10 mL dikocok vertikal di dalam tabung
reaksi selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 detik. Saponin
ditunjukkan dengan terbentuknya busa setinggi 1-10 cm yang stabil
selama tidak kurang dari 10 menit. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N busa
tidak hilang (Depkes RI, 1995).
e) Identifikasi Tanin
Larutan uji sebanyak 1 mL direaksikan dengan larutan besi (III)
klorida 10%, jika terjadi warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan
adanya tanin (Robinson, 1991).
f) Identifikasi Kuinon
Sebanyak 500 mg sampel ditambahkan ke dalam 10 ml air panas
dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtratnya ditambahi 3 tetes
NaOH. Uji positif ditandai dengan munculnya endapan merah (Harborne,
1987).
g) Identifikasi Steroid dan Triterpenoid
Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard. Pada
pengujian ini, sebanyak 500 mg sampel dimaserasi dengan 25 ml etanol
panas selama 1 jam, disaring dan residunya ditambah dengan eter. Filtrat
ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara
berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji
positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu untuk
triterpenoid dan warna hijau atau biru untuk steroid (Harborne, 1987).
h) Identifikasi Kumarin
Kumarin merupakan golongan senyawa fenilpropanoid yang
memiliki cincin lakton lingkar enam dan memiliki inti 2H-1-benzopiran-2-
on dengan rumus molekul C9H502. Kumarin dan turunannya memiliki
banyak aktifitas biologis diantaranya dapat menstimulasi pembentukan
pigmen kulit, mempengaruhi kerja enzim, anti koagulan darah,
antimikroba dan menunjukkan aktifitas menghambat efek karsinogenik.
Disisi lain senyawa turunan kumarin polisiklik aktif sebagai hidrokarbon
aromatik polisiklik karsinogenik seperti 6-metil (alfa) piran (Ani. 2008)

16
 Kumarin memiliki berat molekul 146.145 g/mol. Dalam beberapa
jurnal menjelaskan cara mengidentifikasi senyawa golongan kumarin
dalam suatu simplisia dimana simplisia diekstraksi dengan 10 ml
kloroform dengan pemanasan selama 20 menit. Lalu pada mulut tabung
reaksi dipasangkan corong yang berisi kapas. Larutan kemudian disaring
untuk mendapatkan filtrat sampel, filtrat sampel kemudian diuapkan dalam
cawan penguap sampai kering. Residu dalam cawan penguap kemudian
ditambahkan 10 ml air panas dan 0.5 ml larutan amoniak 10%. Kemudian
diamati fluorosensi yang terjadi dengan lampu UV. Hasil positif
mengandung kumarin akan menunjukan fluorosensi hijau atau biru pada
panjang gelombang 366nm (Ratna, 2009).

II.3 Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum (Graptophyllum pictum) secara

Partisi (Pemisahan Cair-Cair)

II.3.1 Fraksinasi
Fraksinasi merupakan proses pemisahan antara zat cair dengan zat
cair. Fraksinasi dilakukan secara bertingkat berdasarkan tingkat
kepolarannya yaitu dari non polar, semi polar, dan polar. Senyawa yang
memiliki sifat non polar akan larut dalam pelarut non polar, yang semi
polar akan larut dalam pelarut semi polar, dan yang bersifat polar akan
larut kedalam pelarut polar (Harborne 1987).
Ekstrak yang telah dilarutkan dalam aquades, nantinya akan
dimasukkan ke dalam corong pisah dan dicampur dengan pelarut
berdasarkan tingkat kepolarannya. Setelah itu corong pisah dikocok.
Setelah dikocok, akan terbentuk dua lapisan. Pelarut yang memiliki massa
jenis lebih tinggi akan berada di lapisan bawah, dan yang memiliki massa
jenis lebih kecil akan berada di lapisan atas. Senyawa yang terkandung
dalam ekstrak nantinya akan terpisah sesuai dengan tingkat kepolaran
pelarut yang digunakan. Senyawa akan tertarik oleh pelarut yang tingkat
kepolarannya sama dengan dengan senyawa tersebut.
II.3.2 Pelarut

17
 Pemilihan pelarut yang digunakan dalam partisi harus berdasarkan
kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimal dari zat aktif
yang terkandung dalam ekstrak. Pelarut organik berdasarkan konstanta
dielektrikum dapat dibedakan menajdi dua, yaitu pelarut polar dan pelarut
non-polar. Semakin tinggi konstanta dielektrikumnya maka pelarut
semakin bersifat polar (Sudarmadji dkk., 1989). Besaran konstanta
dielektrikum suatu pelarut ditunjukkan pada tabel dibawah ini.

Tabel 2. Konstanta Dielektrik Pelarut

(Sumber : Sumaradji dkk., 1989)
1) Etil asetat
Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH3COOC2H5.
Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam asetat. Senyawa ini
berwujud cairan tak berwarna, memiliki aroma khas, memiliki berat jenis
0,8945 g/ml (25C).
2) Metanol
Metanol adalah senyawa Alkohol dengan 1 rantai karbon. Rumus
Kimia CH3OH, dengan berat molekul 32. Titik didih 640 -650 C (tergantung
kemurnian), dan berat jenis 0,7920-0,7930 (juga tergantung kemurnian).
Secara fisik metanol merupakan cairan bening, berbau seperti alkohol, dapat
bercampur dengan air, etanol, chloroform dalam perbandingan berapapun,
hygroskopis, mudah menguap dan mudah terbakar dengan api yang
berwarna biru (Spencer, 1988).
3) N-heksan

18
 N-Heksana adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus
kimia C6H14. Heksana merupakan jenis pelarut non-polar (Maulida dan
Zulkarnaen, 2010) dan memiliki berat jenis 655 kg/m.
4) Air
Air adalah zat cair yang tidak mempunyai rasa, warna dan bau, yang
terdiri dari hidrogen dan oksigen dengan rumus kimiawi H2O karena air
merupakan suatu larutan yang hampir bersifat universal, maka zat-zat yang
paling alamiah maupun buatan manusia hingga tingkat tertentu terlarut di
dalamnya. Massa Molar : 18,0153 g/mol ; Densitas dan Fase : 0,998 g/cm
(cair pada 20 C) ; 0,92 g/cm (padat) Titik Lebur : 0 o C; Titik Didih : 100 o
C Kalor Jenis : 4184 J/kg.K (cair pada 20 0 C).

II.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik Ekstrak Daun Handeuleum

(Graptophyllum pictum)

II.4.1 Definisi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan tertentu dengan
menggunakan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan
tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa ini.
(Sastrohamidjojo,H.,1996). Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya
berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik (Rohman,
2007). Prosedur uji dengan KLT dilakukan untuk lebih menegaskan hasil
yang didapat dari skrining fitokimia.
II.4.2 Prinsip Kerja
Prinsip KLT yaitu pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip
adsorbsi dan partisi, yang ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase
gerak (eluen), komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena
daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama
sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda
berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang menyebabkan terjadinya
pemisahan.

19
 Prinsip KLT yaitu perpindahan analit pada fase diam karena
pengaruh fase gerak. Proses ini biasa disebut elusi. Semakin kecil ukuran
rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam,
maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya
(Gritter, 1991). Fase gerak akan bergerak sepanjang fase diam karena
pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau
karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending) (Rohman,2007).
II.4.3 Keuntungan
1. Dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah
dibandingkan dengan kromatografi kolom
2. Peralatan yang digunakan lebih sederhana.
3. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis
4. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan
pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan
sinar ultra violet.
5. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen
yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

II.4.4 Kondisi Baku

1) Fase diam
Menurut Rohman (2007), fasa diam yang digunakan KLT tidak sama
dengan yang digunakan untu kromatografi kolom, terutama karena ukuran
dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu,
yaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya.
Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran yaitu :
a. Silika gel dengan pengikat
Pada umumnya digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%).
Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan
pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati
sebagai pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai
pereaksi penentuan bercak.
b. Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi

20
 Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan
tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV.
Sebagai indicator digunakan timah kadmium sulfida atau
mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika
gel GF254 (berflouresensi pada ,254nm).
c. Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau
Silika gel N.
d. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi.
e. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif

2) Fase Gerak
Menurut Rohman (2007), fase gerak pada KLT dapat dipilih dari
pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang
diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana adalah campuran
2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat
mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara
optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan
mengoptimasi fase gerak:
a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi
karena KLT merupakan teknik yang sensitif, di mana kepolaran
fase gerak dapat mempengaruhi pola kromatogram.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga nilai
Rf terletak antara 0,2 - 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti
silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan
migrasi larutan yang berarti juga menentukan nilai Rf.
Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter
ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan
meningkatkan nilai Rf secara signifikan.
d. Larutan ionik dan larutan polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol
dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat

21
 atau amonia masing-masing akan meningkatkan larutan yang
bersifat basa dan asam

Tabel 3. Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase

gerak (deret eluotropik)
(sumber : elisa.ugm.ac.id)
3) Aplikasi (Penotolan Sampel)
Larutan sampel yang akan diaplikasikan hendaknya berisi antara 0,1
- 10 mg kation per cm3 dan dapat bersifat netral dan asam encer sekitar 1 l
larutan ditotolkan dengan sebuah spuit mikro atau mikropipet didekat salah
satu ujung lempeng kromatografi dan kemudian dibiarkan kering diudara
(Pudjaatmaka, 1994).
4) Pengembangan
Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat
pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan
normal, yaitu jarak antara garis awal dan garis depan, ialah 100 mm
disamping pengembangan sederhana, yaitu perambatan satu kali sepanjang
10 cm ke atas, pengembangan ganda dapat juga digunakan untuk
memprbaiki efek pemisahan yaitu dua kali merambat 10 cm ke atas
beturutturut pada pengembangan dua kali. Lapisan KLT harus dalam
keadaan kering diantara kedua pengembangan tersebut, ini dilakukan
dengan membiarkan pelat diudara selama 5-10 menit (Stahl, 1985).

22
5) Deteksi Bercak
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang
tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika,
maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan
mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan
sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan
fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk
senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak akan terlihat jelas.
Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penjerapnya akan
diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan
kelihatan hitam sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresensi
(Rohman, 2007).
a. Fluorosensi pada UV 254 nm
Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel
akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 nm
adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator
fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak
merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut
ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi
yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil
melepaskan energi.
b. Fluoresensi pada UV 366 nm
Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan
berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah
karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor
yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi
cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi
dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan
semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada

23
 lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak
berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.
c. Pada pereaksi godyn
Pada pereaksi godyn reagen A (1% vanilin dilarutkan dalam etanol)
dengan reagen B (3% HClO3 dalam aquadest dan 10% H2SO4).
6) Identifikasi dan Nilai Rf
Definisi nilai Rf adalah jarak yang digerakkan oleh senyawa dari
titik asal dibagi dengan jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal.
Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai senyawa
standar. Senyawa standar biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip
dengan senyawa yang dipisahkan pada kromatogram. Nilai Rf sangat
ditentukan oleh kelancaran pergerakan bercak dalam KLT, adapun faktor
yang mempengaruhi pergerakan bercak adalah:
a. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan,
b. Sifat dari penjerap dan derajat aktivitasnya,
c. Tebal dan kerataan dari lapisan penjerap,
d. Pelarut dan derajat kemurniannya,
e. Derajat kejenuhan dari uap pelarut dalam bejana elusi,
f. Teknik percobaan,
g. Jumlah sampel yang digunakan,
h. Suhu,
i. Kesetimbangan (Sastrohamidjojo, 1985)

II.5 Kromatografi Kolom Adsorpsi

II.5.1 Definisi
Kromatografi kolom yaitu kromatografi yang menggunakan matrik
yang dimasukkan ke dalam tabung sehingga membentuk kolom yang
digunakan sebagai media untuk memisahkan campuran komponen dalam
pelarut.
II.5.2 Prinsip Kerja
Kromatografi kolom digunakan untuk pemisahan campuran
beberapa senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi. Terjadinya pemisahan

24
komponen-komponen suatu zat dalam eluen yang bergerak melalui fase
diam sebagai adsorben, karena adanya perbedaan daya adsorpsi pada
komponen-komponen tersebut.
Terdapat dua sifat senyawa yang dimanfaatkan dalam metode
pemisahan ini, yaitu sifat penjerap yang cenderung menempel pada
permukaan fase diam dan sifat kelarutannya dalam fase gerak (Gritter et
al., 1991).
Pada kromatografi adsorpsi yang menjadi fase diam adalah berupa
padatan yang sekaligus juga berperan sebagai penyangga. Permukaan
partikel-partikel penyangga mempunyai sifat aktif yang dapat mengikat
komponen-komponen tertentuyang dapat disebabkan karena interaksi
ionik (elektrostatik), gaya Van der Wals, dan tenaga lainnya.
Selama kromatografi berlangsung akan terjadi penyerapan
molekul-molekul yang dipisahkan (solut) yang terdapat dalam larutan pada
permukaan penyangga. Kekuatan penyerapan dipengaruhi oleh sifat
penyangga dan solut. Pada umumnya penyangga merupakan komponen
yang mempunyai polaritas tinggi, sehingga penyerapan solut pada
permukaan penyangga sangat tergantung pada polaritas solut. Komponen-
komponen yang mempunyai polaritas tinggi akan terikat kuat pada
permukaan penyangga, sedangkan yang polaritasnya rendah kurang kuat
atau tidak terikat pada permukaan penyangga. Sebagai bahan penyangga
harus dipilih sesuai dengan komponen-komponen yang akan dipisahkan.
Dalam praktek pada umumnya sering digunakan alumina dan silika. Sifat
eluen atau pelarut juga berpengaruh pada kromatografi adsorpsi.
Umumnya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah.
II.5.3 Elusi
Elusi ialah pekerjaan atau usaha untuk menjalankan komponen-
komponen dalam pelarut untuk bergerak sepanjang kolom dalam sistem
kromatografi dengan cara mengalirkan eluen.
Metode elusi dapat dilakukan dengan elusi isokratik atau elusi
landaian. Elusi isokratik adalah adanya penggunaan eluen yang tidak
berubah selama proses pemisahan berlangsung. Elusi landaian adalah

25
kebalikan dari isokratik, dimana terjadi pergantian eluen yang dipakai saat
proses pemisahan berlangsung (Johnson and Stevenson, 1991).
Ada beberapa cara mengeluasi sampel, yaitu sebagai berikut :
a. Cara bertahap (batch elution atau stepwise elution), yaitu
mengelusi kolom dengan suatu jenis pelarut (dapat merupakan
campuran dua macam atau lebih pelarut) sampai sejumlah
volume eluat tertentu dikumpulkan, kemudian elusi dilanjutkan
dengan jenis pelarut lain dengan cara yang sama, demikian
seterusnya dengan jenis pelarut yang lain lagi sampai selesai.
Keuntungan dengan menggunakan cara ini adalah mudah
dilakukan penyeimbangan (conditioning) kolom. Dengan
demikian fraksi fraksi yang ingin dipisahkan dapat dielusi
dengan sesedikit mungkin eluen.
b. Cara mengalirkan eluen secara berterusan (continuous elution).
Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan pompa
peristaltik atau secara sederhana dengan meletakkan tangki
penyedia freservoir) pelarut tepat di atas kolom.
c. Cara mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih pelarut
sekaligus dengan rasio yang berubah selama elusi. Cara ini
lazim disebut sebagai pengelusian bertingkat (gradient elution).
Dengan cara ini konsentrasi suatu pelarut dapat dinaikkan atau
diturunkan secara bertahap selama proses elusi berlangsung.
Jadi seandainya eluen yang digunakan terdiri atas dua macam
pelarut, A dan B, maka konsentrasi A dapat dibuat naik secara
bertahap sedangkan konsentrasi B secara otomatis akan
menurun, atau dibuat sebaliknya. Yang dapat dibuat bertingkat
bukan hanya rasio antara pelarut-pelarut yang digunakan tetapi
juga misainya dapat konsentrasi garam, nilai pH, polaritas, dan
sebagainya. Pelaksanaan elusi bertingkat dapat dikerjakan
dengan dua tanghki yang dihubungkan menjadi satu. Tangki
kedua dilengkapi dengan keran untuk mengeluarkan isinya,
yang terhubungkan dengan kolom. Tipe kenaikkan

26
 bertingkatnya dapat berbeda jika ukuran tangki pertama dan
kedua berbeda. Jika ukuran kedua tangki sama besarnya, maka
perubahan gradien akan tetap (konstan) atau mengikuti garis
linear. Jika ukuran tangki pertama lebih besar atau lebih kecil
daripada ukuran tangki kedua, maka perubahan gradien
masing-masing pelarut akan berlangsung makin menurun atau
menaik, tidak mengikuti garis linear.

II.6 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Daun

Handeleum (Graptophyllum pictum)
II.6.1 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
KLT Preparatif adalah cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan
kecil (50 mg 1 g) dari senyawa yang kurang atsiri. Cara ini berguna
untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni
untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan
campurannya rumit. Cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa
garis pada salah satu sisi plat lapisan besar ( lapisan tebal sampai 1 mm)
dimana lempeng yang digunakan pada KLT Preparatif adalah lempeng
kaca yang berukuran besar yaitu 20 x 20 cm atau 40 x 40 cm dan
dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran
akan terpisah menjadi beberapa pita yang dilihat dibawah sinar UV.
Penjerap yang mengandung pita dikerok dari plat kaca (Gritter,et al.,
1991). Kemudian dikumpulkan dalam bentuk fraksi-fraksi.
Prinsip dari KLT Preparatif ini adalah terjadi berdasarkan
perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-
komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh
karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka
komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah
yang menyebabkan pemisahan (Nasution, 2010). Adsorpsi adalah senyawa
kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap
tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan
tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama

27
sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-
beda yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Penotolan cuplikan
dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut.Cuplikan
ditotolkan berupa pita dengan jarak sesempit mungkin karena pemisahan
tergantung pada lebar pita.Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi
lebih baik dengan penotol otomatis.Pelarut yang baik untuk melarutkan
cuplikan adalah pelarut yang atsiri. Pengembangan plat KLT preparatif
dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat.
Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan
kertas saring yang diletakkan berdiri disekeliling permukaan bagian dalam
bejana (Hostettmann, et al, 1995).Kebanyakan Penjerap KLT preparatif
mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita
yang terpisah pada senyawa yang menyerap sinar ultraviolet. Untuk
mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar ultraviolet yaitu dengan
cara menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot kedua sisi
dengan penyemprot (Hostettmann, et al, 1995). Setelah pita ditampakkan
dengan cara yang tidak merusak maka senyawa yang tidak berwarna
dengan penjerap dikerok dari plat kaca. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran beberapa senyawa sehingga diperoleh senyawa
murni (Gritter, et al, 1991).
II.6.2 Fase Diam dan Fase Gerak
a. Fase Diam
Menurut Rohman (2007), adsorben yang umum digunakan
adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida),
kieselguhr (tanah diatome), dan selulosa. Silika gel relatif asam
sehingga sering digunakan untuk senyawa asam, dan umumnya
digunakan untuk kromatografi adsorpsi maupun partisi. Sedangkan
alumina relatif basa sehingga sering digunakan untuk pemisahan basa
dan umumnya digunakan untuk kromatografi adsorpsi. Kieselguhr dan
selulosa merupakan bahan penyangga lapisan zat cair pada sistem
partisi, sehingga sering digunakan untuk pemisahan senyawa polar

28
seperti asam amino, karbohidrat, nukleotida, dan senyawa hidrofil
alam.
Silika gel yang digunakan umumnya ditambah dengan binding
agent / binder / perekat untuk memberikan kekuatan pada lapisan,
menambah adhesi terhadap penyangga, dan membuat lapisan menjadi
lebih kohesi. Binding agent yang banyak digunakan yaitu kalsium
sulfat, CaSO4. H2O 10 15 %, yang lebih dikenal sebagai gipsum
sehingga silika gel ini diberi kode G. Pengikat lain yang dapat dipakai
yaitu pati 3% dan polimer organik, seperti polivinil alkohol. Lapisan
yang tidak mengandung pengikat dapat melekat dengan dukungan
keseragaman ukuran partikel.
Selain itu silika gel juga sering ditambah dengan indikator
luminescence (fosforescence pada 254 nm ; fluorescence pada 366
nm) untuk membantu penampakan bercak tak berwarna. Silika gel
yang telah ditambah indikator luminescence kemudian diberi kode F
atau UV. Indikator luminescence merupakan senyawa yang apabila
dikenai radiasi elektromagnetik ultraviolet (UV) pada 254 nm atau
366 nm, maka akan menyerap energi radiasi tersebut untuk
mengeksitasikan elektron-elektronnya ke tingkat energi yang lebih
tinggi (exited state). Saat elektron-elektron yang tereksitasi tersebut
kembali ke tingkat energi dasar (ground state), maka akan
mengemisikan cahaya. Emisi cahaya dari senyawa yang menyerap
energi radiasi dengan 254 nm berupa peristiwa fosforescence,
sedangkan emisi cahaya dari senyawa yang menyerap energi dengan
366 nm berupa peristiwa fluorescence. Oleh karena itu silika gel yang
telah ditambah indikator luminescence akan berpendar dengan
penampakan warna tertentu.
Fase diam yang digunakan pada KLT Preparatif merupakan
silika gel 60 GF254 yang menunjukkan bahwa :
Ukuran pori : 60
G : CaSO4. H2O sebagai binder

29
 F : bahan indikator fluorescence / fosforescence yg
ditambahkan
254 : dituliskan sesudah F atau UV untuk menandakan
eksitasi bahan indikator fosforescence yang ditambahkan.

Tebal optimum untuk lapisan KLT preparatif 1 1,5 mm.

Lapisan tebal sulit untuk dibuat dan menghasilkan pemisahan yang
relatif buruk. Pada umumnya bubur adsorben yang digunakan untuk
mencetak lapisan KLT preparatif agak lebih kental daripada untuk
KLT biasa.Pada lapisan yang mengandung perekat kalsium sulfat,
pengentalan dapat terjadi dengan membiarkan bubur lebih lama
sebelum lapisan dicetak. Cara lain harus digunakan adsorben lebih
banyak dalam pembuatan bubur. Salah satu kesulitan dalam
penggunaan lapisan yang tebal yaitu tendensi mengelupas bila telah
kering. Oleh karena itu lapisan harus dibiarkan mengering selama
beberapa jam sebelum diaktifkan, sehingga dapat mencegah peretakan
dan pengerasan bagian luar.
b. Fase Gerak
Menurut Rohman (2007), Fase gerak pada KLT dapat dipilih
dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu
yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana adalah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut
ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat
terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam
memilih dan mengoptimasi fase gerak:
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi
karena KLT merupakan teknik yang sensitif, di mana kepolaran
fase gerak dapat mempengaruhi pola kromatogram.
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga
nilai Rf terletak antara 0,2 - 0,8 untuk memaksimalkan
pemisahan.

30
 3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti
silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan
migrasi larutan yang berarti juga menentukan nilai Rf.
Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil
eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan
meningkatkan nilai Rf secara signifikan.
4. Larutan ionik dan larutan polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan
metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit
asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan
larutan yang bersifat basa dan asam

Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun

campuran. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan
menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah
yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut.
Sebagai pegangan dalam pemilihan adsorben dan eluen untuk
suatu sampel dalam KLT, dapat menggunakan diagram tringular
berikut:

Gambar 2.3 Diagram tringular fase diam dan fase gerak

(sumber : elisa.ugm.ac.id)
Dengan memutar segitiga pada diagram di atas, maka fase diam dan
eluen yang sesuai untuk berlangsungnya suatu pemisahan ditunjukkan
oleh masing-masing sudut segitiga tersebut. Misalnya, apabila
senyawa yang hendak dipisahkan relatif non polar maka digunakan
fase diam yang aktif dan eluen yang nonpolar, dan sebaliknya.

31
 Pemilihan pelarut pada KLT Preparatif umumnya dilakukan
dengan melakukan orientasi terlebih dahulu dengan menggunakan
KLT Analitik. Pelarut yang telah terpilih kemudian dimasukkan ke
dalam chamber dan dijenuhkan. Setelah jenuh, plat KLT yang telah
ditotolkan sampel kemudian dimasukkan kedalam chamber dan
selanjutnya proses pemisahan dapat berlangsung.
II.6.3 Deteksi Daerah Noda
Deteksi daerah noda dapat dilakukan seperti halnya pada KK.
Kebanyakan reagen lokasi yang digunakan untuk senyawa atau gugus
tertentu pada KK dapat digunakan pada KLT dengan cara yang sama.
Selain itu, reagen lokasi yang sering digunakan pada KLT antara lain:
1. Uap iodium. Lempeng diletakkan dalam bejana atau gelas piala
tertutup yang berisi kristal iodium sehingga uap iodium akan terjerap
oleh bercak pada lapisan yang mengandung senyawa organik. Warna
bejana akan menjadi ungu. Senyawa tak jenuh akan memberikan noda
tak berwarna, sedangkan senyawa organik yang jenuh akan
memberikan noda berwarna coklat dengan latar belakang putih. Iodium
akan menyublim bila lempeng dikeluarkan dari bejana dan bercak
memudar perlahan, namun kedudukan noda dapat diberi tanda dan
dibuat permanen dengan disemprot menggunakan larutan 0,5%
benzidina dalam alkohol absolut.

2. Asam sulfat pekat. Senyawa organik dapat dideteksi dengan asam

o
sulfat pekat, kemudian dipanaskan pada suhu 100 C. Pada
pemanasan, senyawa organik pada lapisan terbakar hangus menjadi
karbon (arang) dan tampak sebagai bercak hitam pada latar belakang
putih. Dalam hal ini dapat digunakan larutan asam sulfat 10% dalam
etanol atau 50 80% dalam air. Kekorosifan asam sulfat dapat
dihindari dengan menggunakan amonium sulfat. Panas menguraikan
amonium menjadi amonia yang menguap dan asam sulfat yang
menghanguskan senyawa organik.

3. Campuran asam sulfat dan kalium bikromat atau dengan asam nitrat.

32
4. Reagen semprot yang akan menimbulkan warna jika bereaksi dengan
bercak cuplikan. Pada cara ini maka dapat diperoleh informasi gugus
fungsi penyusun senyawa, contoh dugaan adanya aldehid atau keton
dapat dipastikan dnegan 2,4-dinitrofenilhidrazin, atau fenol dapat
dipastikan denga reagen besi (III) klorida. Macam-macam reagen dan
penggunaannya dapat dilihat sebagai berikut:

Deteksi bercak pada KLT preparatif tidak boleh merusak senyawa

yang dipisahkan, sehingga cara yang paling sesuai dalam hal ini adalah
deteksi di bawah sinar UV. Metode alternatif yaitu dengan menempelkan
selotif pada lapisan sedemikian hingga tegak lurus bercak pita. Saat
diangkat, selotif akan membawa sedikit adsorben yang mengandung pita
senyawa yang selanjutnya dapat dideteksi dengan reagen warna. Alternatif
lain yaitu dengan menyemprot lapisan silika gel dengan air sehingga
menjadi tembus cahaya (bening) dan bercak pita terlihat sebagai daerah
buram pada latar belakang tembus cahaya.
II.6.4 Identifikasi Senyawa
Identifikasi bercak dilakukan seperti halnya pada KK, dengan
parameter harga Rf atau Rr. Faktor yang memperngaruhi gerakan noda
dalam KLT, antara lain:
1. Struktur kimia senyawa yang akan dipisahkan.

2. Sifat adsorben dan derajat aktifitasnya.

3. Homogenitas dan tebal lapisan adsorben, karena akan mempengaruhi

aliran eluen.

4. Derajat kemurnian eluen dan perbandingan eluen dalam campuran.

5. Derajat kejenuhan uap eluen dalam bejana.

6. Teknik elusi berdasarkan arah aliran eluen.

7. Cara penotolan dan jumlah sampel yang ditotolkan.

8. Suhu.

33
9. Kesetimbangan distribusi komponen sampel di antara dua fase.

Jika sampel terdiri dari komponen yang sangat kompleks dan baku
pembanding adalah senyawa murni, maka komponen-komponen senyawa
lain dalam sampel akan mempengaruhi Rf senyawa yang sedang
dianalisis. Salah satu cara mengatasinya adalah dengan metode yang
disebut dengan spiking. Spiking dilakukan dengan menambahkan
sejumlah tertentu senyawa baku ke dalam sampel, dan ketiga cuplikan
dielusi bersama, yaitu baku murni, sampel, dan sampel yang telah
dispiking. Hasilnya dapat dilihat pada gambar berikut:

Gambar 2.4 Metode Spiking

(sumber : elisa.ugm.ac.id)
Apabila sampel memang mengandung senyawa yang sama dengan
senyawa baku, maka noda senyawa tersebut akan menjadi lebih besar
(positif).
II.6.5 Keuntungan dan Kekurangan KLT Preparatif
Adapun keuntungannya adalah pembiayaan paling murah dan
memakai peralatan yang sederhana. Sementara keruguiannya adalah
ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan menjadi
lebih lama dibadingkan dengan KLT pada umumnya.

34
 BAB III
METODOLOGI

III.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

A. Waktu : Selasa, 18 Oktober - 6 Desember 2016
B. Tempat : Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia III lantai 3 FKIK
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
III.2 Alat dan Bahan
A. Pembuatan Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum)

Alat : Bahan :
1. Ultrasonik / Sonikasi 1. Daun handeuleum basah 5
kg dan daun handeleum
2. Alat- alat gelas
kering kg
3. Spatula 2. Metanol

4. Timbangan analitik

5. Gunting

6. Tampah

7. Label

B. Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum

pictum)

Alat : Bahan :
1. Gelas beaker 1. Simplisia kering
2. Pipet tetes 2. NaOH
3. Cawan penguap 3. NH4OH pekat
4. Tabung reaksi 4. NH4OH 30%
5. Gelas ukur 5. Natrium asetat
6. Penjepit kayu 6. Kloroform
7. Water bath 7. HCl encer

35
 8. Kertas saring 8. Asetat anhidrat
9. H2SO4 pekat
10. Etanol
11. Lempeng Mg
12. Pereaksi meyer
13. Pereaksi drangendorff
14. Pereaksi stiasny
15. HCl pekat
16. Amil alcohol
17. FeCl3 1%
18. Eter

C. Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum (Graptophyllum pictum)

secara Partisi (Pemisahan Cair-Cair)

Alat : Bahan :
1. Tabung reaksi 1. Ekstrak methanol daun
Handeleum
2. Corong pisah
2. N-heksana
3. Pipet tetes
3. Etil asetat
4. Gelas ukur
4. Metanol
5. Timbangan analitik
5. Aquadest
6. Spatula

D. KLT Analitik Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum)

Alat : Bahan :
1. Plat KLT 1. Ekstrak sampel
2. Pipa kapiler 2. Heksana, etil asetat dan
3. Chamber metanol

36
 4. Kertas saring 3. Reagen godin.
5. Lampu UV

E. Kromatografi Kolom Adsorpsi Ekstrak Daun Handeuleum

(Graptophyllum pictum)

Alat : Bahan :
1. Kolom kromatografi 1. Ekstrak daun handeuleum
2. Alat alat gelas 2. Silika gel
3. Cawan porselen 3. N-heksana
4. Alat pembantu untuk 4. Etil asetat
memampatkan kolom 5. Kapas
kromatografi 6. Kertas saring
5. Vial 7. Alumunium foil
6. Lempeng KLT
7. Chamber
8. Lampu UV
9. Pipa kapiler

F. KLT Preparatif Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum

pictum)
Alat : Bahan :
1. Botol Vial 1. Ekstrak N heksana dari
2. Gelas Beaker hasil kromatografi kolom
3. Spatula perbandingan 4:1 dan 3:2
4. Pipet 2. N-heksana
5. Lampu UV 3. Etil Asetat
6. Chamber
7. Pipa kapiler
8. Plat KLT
9. Gelas Ukur

37
III.3 Prosedur Kerja
A. Pembuatan Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum)
1. Penyiapan sampel :
a) Sebanyak 5 kg daun handeulum dilakukan sortasi basah yaitu
dengan memilih daun yang segar, agak tua dan tidak berjamur.
b) Daun yang telah disortasi kemudian dipotong kecil-kecil
dengan ukuran 2-3 cm, kemudian daun dikeringkan dengan
sinar matahari selama 6 jam. Proses pengeringan berlangsung
selama 3 hari.
c) Selanjutnya, daun yang telah dikeringkan dihaluskan
menggunakan blender. Serbuk yang dihasilkan dari proses
penghalusan yaitu 500 gram.
2. Proses ekstraksi
a) Serbuk diekstraksi dengan metode sonikasi
b) Serbuk sebanyak 80 gram dimasukan ke dalam gelas beaker
yang telah berisi metanol sebanyak 240 ml kemudian
dimasukan ke dalam alat sonikasi selama 1 jam dan dibagi
kedalam dua sesi 30 menit dengan suhu 45C.
c) Lalu, setelah 1 jam sampel disaring dengan kertas saring dan
diambil filtratnya.
d) Filtrat hasil sonikasi kemudian di uapkan dengan alat Rotatory
Evaporator sampai diperoleh ekstrak kental.
e) Sisa maserat serbuk kemudian dimaserasi dengan metanol
didalam botol berwarna gelap.
f) Proses remaserasi dilakukan sebanyak 2 kali. Hasil filtrat dari
proses penyaringan kemudian evap dengan rotary evaporatory
sampai terbentuk masa kental.

B. Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeuleum (Graptophyllum

pictum)
1) Identfikasi golongan alkaloid

38
2) Identifikasi golongan flavonoid

3) Identifikasi golongan saponin

4) Identifikasi golongan tanin

39
5) Identifikasi golongan kuinon

6) Identifikasi golongan steroid dan terpenoid

7) Identifikasi golongan minyak atsiri

40
 8) Identifikasi golongan kumarin

C. Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum (Graptophyllum pictum)

secara Partisi (Pemisahan Cair-Cair)
1) Partisi dengan heksana

41
 2) Partisi dengan etil asetat

D. KLT Analitik Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum)

42
E. Kromatografi Kolom Adsorpsi Ekstrak Daun Handeuleum
(Graptophyllum pictum)

F. KLT Preparatif Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum

pictum)
1) Uji KLT Preparatif
Prosedur 1: Pembuatan Lapisan Silika Gel

43
 Prosedur 2 : Aplikasi pada Plat KLT Preparatif

44
 BAB IV
HASIL PENGAMATAN

IV. 1 Pembuatan Ekstrak Daun Handeleum (Grapthophyllum pictum)

Total serbuk daun 500 mg
handeulum
Total ekstrak kental 18.67 gram
yang didapat
Perhitungan = Berat ekstrak kental X 100%
rendemen Berat simplisia
= 18.67 gram X 100%
500 gram
= 3.734%
Dokumentasi

Serbuk daun handeuleum Proses sonikasi

Proses sonikasi Proses maserasi dengan metanol

Hasil ekstrak kental

IV. 2 Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeleum (Grapthophyllum pictum)

Uji Hasil gambar Hasil praktikum Berdasarkan literature Kesimpulan

45
 pada Praktikum
Larutan A : Larutan A :
(+) Alkaloid
Terbentuk warna Terbentuk warna
pada larutan
jingga pada kertas jingga pada kertas
A1
saring saring
(-) Alkaloid
Larutan B1: Larutan B1:
Alkaloid pada larutan
Terbentuk warna Terbentuk endapan
B1
merah merah
(-) Alkaloid
Larutan B2 : Larutan B2 :
pada larutan
Terbentuk warna Terbentuk endapan
B2
kuning keruh putih

Larutan A(tanin) :
Larutan A(tanin) :
Terbentuk warna bitu
Terbentuk warna
tua atau hijau
hijau kehitaman
kehitaman
Larutan (+)senyawa
Larutan B1(tanin
B(taninkatekuat) : Tanin
katekuat):
Tanin Tidak berubah (-)Tanin
Terbentuk endapan
warna katekuat
endapan warna merah
Larutan C( tanin (-) Tanin galat
muda
galat) : Tidak
Larutan B2(tanin
berubah warna
galat) :Terbentuk
warna biru tinta

46
 Terbentuk warna
Terbentuk warna kuning kecoklatan
Flavonoid (+) Flavonoid
kuning kecoklatan dalam larutan
amilalkohol

Terbentuk busa Terbentuk busa yang

Saponin (+) Saponin
yang stabil stabil

47
 Tidak berubah Terbentuk warna
Kuinon (-) Kuinon
warna merah

Gol. Steroid:
terbentuk warna hijau
Steroid dan Terbentuk warna (+) Steroid
Gol. Triterpenoid :
triterpenoid kehijauan (-)Triterpenoid
terbentuk warna
merah
Minyak Tidak berbau Berbau aromatic atau (-) Minyak
atsiri aromatic menyenangkan atsiri
Tidak berubah Terjadi fluoresensi
Kumarin (-) Kumarin
warna warna biru atau hijau

IV. 3 Hasil Pemisahan secara Partisi ( Pemisahan Cair-Cair) Ekstrak Daun

Handeleum ( Grapthophyllum pictum )
Nama Fraksi Berat yang diperoleh
Fraksi Etil asetat
Wekstrak = Wtotal-Wwadah

Wekstrak = 13.4022 gr 9.6894

Wekstrak = 3.7128 gram
Rendemen = x 100%
= 3,7128 / 18,67 x 100%
=19,886 %

48
 Fraksi Heksana
Wekstrak = W total-Wwadah

Wekstrak = 28.8210gr 26.2414gr

Wekstrak = 2.5796 gram
Rendemen = x 100%
= 2,5796 / 18,67 x 100 %
= 13,817 %
Fraksi Metanol
Wekstrak = Wtotal-Wwadah

Wesktrak = 12.6194gr 10.5928gr

Wekstrak = 2.0266 gram
Rendemen = x 100%
= 2,0266 / 18,67 x 100 %
= 10,855 %

IV. 4 Uji Kromatografi Lapis Tipis Analitik Ekstrak Daun Handeleum

(Grapthophyllum pictum)
a. Ekstrak N-heksana dengan perbandingan pelarut N-heksana :
Etil asetat 4 : 1

Dibawah sinar UV 254 Pereaksi Godin

49
 Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak yang
yang ditempuh ditempuh senyawa
senyawa terlarut / terlarut / Jarak yang
Jarak yang ditempuh pelarut )
ditempuh pelarut )

0,7 0,175 2,9 0,725

1,2 0,4 3,2 0,8
1,7 0,425 3,6 0,9
2,1 0,525
2,5 0,625
b. Ekstrak Etil Asetat dengan perbandingan pelarut N-heksana : Etil
asetat 4 : 1

Dibawah sinar UV 254 Pereaksi Godin

Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak yang ditempuh
yang ditempuh senyawa terlarut / Jarak yang
senyawa terlarut / ditempuh pelarut )
Jarak yang
ditempuh pelarut )
- - 2,2 0,55
c. Ekstrak metanol dengan perbandingan pelarut N-heksana : Etil
asetat 4 :1

Dibawah sinar UV 254 Pereaksi Godin

Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak
yang ditempuh yang ditempuh
senyawa terlarut / senyawa terlarut /
Jarak yang Jarak yang
ditempuh pelarut ) ditempuh pelarut
)
- - 1,2 0,3

50
- - 2,5 0,625
d. Ekstrak etil asetat dengan perbandingan pelarut N-heksana : Etil
asetat 3:2

Dibawah sinar UV 254 Pereaksi Godin

Jarak Spot Nilai Rf (Jarak Jarak Spot Nilai Rf (Jarak
yang ditempuh yang ditempuh
senyawa terlarut / senyawa terlarut /
Jarak yang Jarak yang
ditempuh pelarut) ditempuh pelarut)
0,45 0,112 2,2 0,55
0,8 0,2 1.2 0,3
1,1 0,275 2,2 0,55
1,4 0,35 2,9 0,725
1,9 0.425 3,3 0,82
2,5 0,625
e. Ekstrak Metanol dengan perbandingan pelarut N-heksana : Etil
asetat 3:2

Dibawah sinar UV 254 Pereaksi Godin

Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak Jarak Spot Nilai Rf ( Jarak
yang ditempuh yang ditempuh
senyawa terlarut / senyawa terlarut
Jarak yang / Jarak yang
ditempuh pelarut ) ditempuh pelarut
)
0,5 0,125 0,3 0,75
1 0,25 1,1 0,275
1,3 0,325 1,8 0,45
1,9 0,472 2,2 0,55
2,5 0,625 2,9 0,275
3,2 0,8

51
 Perbandingan pelarut N-heksana Perbandingan pelarut N-heksana :
: Etil asetat 4 : 1 Etil asetat 3 :2

IV. 5 Uji Kromatografi Kolom Adsorpsi Ekstrak Daun Handeleum (

Grapthophyllum pictum )

Parameter / Hasil Kesimpulan

perlakuan
Panjang dan (p x l) = 30,2 x 2,3 cm
Lebar kolom
kromatografi

52
Tinggi bubur 17,1 cm
silika

Pengamatan nilai Rf pada noda 1, 4,

lempeng 7, 10, 13, 16, 19,
KLT pada 22 dan 25 berturut-
254 nm turut adalah 0,625 ;
0,7 ; 0,65 ; 0,675 ;
0,375 ; 0,375;
0,225; 0,175 dan
0,225.

Pengamatan
lempeng
KLT pada
365 nm

IV. 6 Hasil uji KLT Preparatif Ekstrak Daun Handeleum ( Grapthophyllum

pictum )
No. Perlakuan Dokumentasi
1. Proses pembuatan
KLT Preparatif

53
 (Penjenuhan fasa gerak) (Proses elusi fraksi)
2. Hasil UV KLT
Preparatif

(Hasil elusi pertama pada 365 nm) (Hasil elusi pertama pada
254 nm)

(Hasil elusi kedua pada 365 nm)

54
3. Hasil UV KLT
(setelah
dilakukan
pengkoloman)

(Pada 365 nm) (Pada 254 nm)

55
 BAB V
PEMBAHASAN

V. 1 Pembuatan Ekstrak Daun Handeleum (Graptophyllum pictum)

Pada praktikum ini dilakukan pembuatan ekstrak yang bertujuan untuk
mendapatkan ekstrak dari bahan alam. Langkah pertama yang kami lakukan
adalah dengan cara pembuatan simplisia yang berasal dari tumbuhan (simplisia
nabati). Pemilihan tanaman yang akan diekstrak yakni berdasarkan referensi
jurnal tentang pengujian bioaktivitas suatu tumbuhan tersebut dan berdasarkan
informasi dari masyarakat sekitar (etnobotani). Tanaman yang kami pilih adalah
daun Handeleum (Graptophyllum pictum). Pemilihan ini berdasarkan penelitian
sebelumnya, bahwa daun handeuleum mengandung alkaloid, glikosida, steroid,
saponin, klorofil dan lendir (Dali martha, 1999). Penelitian yang dilakukan oleh
Ros sumarni, dkk (2013) menyatakan bahwa daun ini juga mengandung tanin,
alkaloid dan sitosterol. Penelitian lain yang mendukung bahwa daun ini
mengandung alkaloid, glikosida, pektin, asam format, steroid, saponin, tannin,
flavonoid dan alkohol (Keng SB, Lim M., 1996; Wahyuningtyas E, 2005). Daun
handeuleum digunakan untuk obat wasir, laksatif lemah diuretik ringan, dan untuk
anti inflamasi (Ros Sumarny, dkk 2013).
Penentuan metode isolasi senyawa dari daun handeuleum (Graptophillum
pictum Griff) dilakukan dengan merancang beberapa hal, yaitu perancangan
teknik ekstraksi, perancangan cara fraksinasi, dan perancangan teknik isolasi.
Pada praktikum ini dilakukan perancangan teknik ekstraksi terlebih dahulu.
Teknik ekstraksi yang dipilih untuk mengekstraksi daun handeuleum yaitu
teknik sonikasi. Tujuan dari teknik ini yaitu untuk membuktikan apakah teknik ini
memiliki efisiensi yang lebih baik dalam hal waktu operasi (ekstraksi), jumlah
rendemen, dan jumlah komponen dibandingkan dengan teknik konvensional
seperti maserasi.
Menurut Balachandran, penggunaan ultrasonik akan menaikkan harga
diffusifitas efektif pada proses perpindahan massa dimana efek ini akan
maksimum pada waktu yang singkat. Gelombang ultrasonik mampu
meningkatkan difusi pelarut dalam suatu zat, dimana pengaruh gelombang

56
kavitasi yang dihasilkan tidak hanya disekitar partikel tetapi juga langsung ke titik
pusat zat tersebut.
Teknik ekstraksi dengan sonikasi dilakukan dengan memasukkan sampel
berupa serbuk daun handeuleum ke dalam gelas beker dan ditambahkan pelarut
metanol kemudian dimasukkan ke dalam alat ultrasonic bath yang disetel waktu
dan suhunya. Waktu yang disetel yaitu 1 jam (2 kali running) pada suhu 45oC.
Kemudian sampel yang sudah disonikasi selanjutya dimaserasi.
Metode maserasi dipilih karena biayanya yang murah, sederhana dan dapat
diatur durasi waktu perendamannya sehingga proses ekstraksi akan berjalan
sempurna serta tidak membutuhkan pemanasan yang akan merusak senyawa yang
terkandung didalamnya. Dalam proses maserasi digunakan pelarut metanol karena
merupakan pelarut universal yang bersifar inert, memiliki titik didih yang rendah,
tidak larut dalam air dan memiliki biaya yang murah. Remaserasi dilakukan
selama 3 hari dengan tujuan untuk memaksimalkan proses pelarutan metabolit
sekunder. Hasil maserasi kemudian disaring dengan kertas saring untuk
mendapatkan filtrat yang akan dievaporasi.
Filtrat hasil penyaringan kemudian diuapkan dengan alat rotary
evaporatory, alat ini digunakan untuk memekatkan konsentrasi ekstrak denan cara
menguapkan pelarut yang digunakan. Alat ini menggunakan prinsip penurunan
tekanan sehingga metanol akan menguap pada suhu di bawah titik didihnya.
Nilai rendemen ekstrak daun handeuleum yang diperoleh yaitu 3,74%.
Besar kecilnya nilai persen rendemen menunjukkan keefektifan proses ekstraksi.
Efektivitas ekstraksi dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan sebagai
penyari, ukuran partikel simplisia, metode dan lamanya proses ekstraksi.

V.2 Skrining Fitokimia Serbuk Daun Handeleum (Graptophyllum pictum)

a. Identifikasi Minyak Atsiri
Berdasarkan hasil yang didapatkan menunjukkan tidak terciumnya
bau aromatic dari residu sampel serbuk Daun Handeleum, sehingga dapat
disimpulkan bahwa Daun Handeleum tidak mengandung minyak atsiri.
Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam daun handeuleum yang
mana tidak mengandung minyak atsiri.

57
b. Identifikasi Kuinon
Uji positif senyawa yang mengandung kuinon adalah terbentuknya
endapan merah, namun berdasarkan hasil pengamatan tidak menunjukkan
terbentuknya endapan merah (tidak terjadi perubahan apapun), sehingga
dapat disimpulkan bahwa Daun Handeleum tidak mengandung kuinon.
Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam daun handeuleum yang
mana tidak mengandung senyawa kuinon.
c. Identifikasi Steroid dan Triterpenoid
Uji positif senyawa yang mengandung steroid adalah terbentuknya
warna biru atau hijau, berdasarkan hasil pengamatan yaitu terbentuk warna
hijau, yang mengindikasikan bahwa daun handeuleum mengandung
steroid. Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam daun handeuleum
yang mana mengandung senyawa steroid.
Kemudian uji positif senyawa yang mengandung triterpenoid
adalah terjadinya perubahan warna kemerahan, namun berdasarkan hasil
pengamatan tidak terbentuknya warna kemerahan melainkan terbentuknya
warna hijau, sehingga dapat disimpulkan bahwa Daun Handeleum tidak
mengandung triterpenoid. Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam
daun handeuleum yang mana tidak mengandung senyawa triterpenoid.
d. Identifikasi Kumarin
Uji positif senyawa yang mengandung kumarin adalah
menghasilkan fluorosensi kuning kehijauan atau kebiruan, namun
berdasarkan hasil yang diperoleh tidak terjadi perubahan warna atau tidak
berfluorosensi, sehingga dapat disimpulkan bahwa Daun Handeleum tidak
mengandung kumarin. Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam
daun handeuleum yang mana tidak mengandung senyawa kumarin.
e. Identifikasi Alkaloid
Uji alkaloid pada praktikum dilakukan dengan tiga cara yakni
dengan pereaksi dragendorf, pereaksi mayer, dan uji bercak pada kertas
saring. Uji positif senyawa yang mengandung alkaloid dengan pereaksi
dragendorf adalah terbentuknya endapan merah, berdasarkan hasil
praktikum terbentuk warna merah. Kemudian uji positif senyawa yang

58
mengandung alkaloid dengan pereaksi mayer adalah terbentukya endapan
putih dan warna yang keruh, berdasarkan hasil praktikum terbentuknya
warna kuning keruh. Uji positif senyawa yang mengandung alkaloid
dengan penotolan pada kertas saring adalah terbentuknya warna jingga
pada kertas saring, berdasarkan hasil praktikum terbentuk warna jingga
pada kertas saring. Pada uji alkaloid dengan pereaksi mayer dan kertas
saring dapat disimpukan bahwa Daun Handeleum mengandung alkaloid,
namun pada uji alkaloid dengan dragendorf hanya terbentuk warna merah
(tidak terbentuk endapan merah) yang menunjukkan hasil negatif palsu.
Hal ini disebabkan karena adanya beberapa golongan alkaloid yang tidak
bereaksi dengan pereaksi dragendorf. Dapat disimpulkan bahwa Daun
Handeleum mengandung senyawa alkaloid. Hal ini sesuai dengan
kandungan kimia di dalam daun handeuleum yang mana mengandung
senyawa alkaloid.
f. Identifikasi Flavonoid
Uji positif senyawa yang mengandung flavonoid adalah
terbentuknya warna kuning kecoklatan pada lapisan amilalkohol,
berdasarkan hasil praktikum diperoleh warna kuning kecoklatan pada
lapisan amilalkohol sehingga dapat disimpulkan bahwa Daun Handeleum
mengandung senyawa flavonoid. Hal ini sesuai dengan kandungan kimia
di dalam daun handeuleum yang mana mengandung senyawa flavonoid.
g. Identifikasi Saponin
Uji positif senyawa yang mengandung saponin adalah
terbentuknya buih yang stabil selama 10 menit, berdasarkan hasil
praktikum terbentuk buih yang stabil sehingga dapat disimpulkan bahwa
Daun Handeleum mengandung senyawa saponin. Hal ini sesuai dengan
kandungan kimia di dalam daun handeuleum yang mana mengandung
senyawa saponin.
h. Identifikasi tanin
Uji positif senyawa yang mengandung tanin adalah terbentuk
warna biru tua atau hijau kehitaman, berdasarkan hasil yang diperoleh
terbentuk warna hijau kehitaman sehingga dapat disimpulkan bahwa Daun

59
 Handeleum mengandung senyawa tanin. Kemudian uji positif senyawa
yang mengandung tanin katekuat adalah terbentuk endapan warna merah
muda, namun berdasarkan hasil yang diperoleh tidak menunjukkan
perubahan warna apapun (tetap warna kecoklatan) sehingga dapat
disimpulkan bahwa Daun Handeleum tidak mengandung senyawa tanin
katekuat. Lalu uji positif senyawa yang mengandung tanin galat adalah
terbentuk warna biru tinta, berdasarkan hasil yang diperoleh tidak
menunjukkan perubahan warna apapun (tetap warna kecoklatan) sehingga
dapat disimpulkan bahwa Daun Handeleum tidak mengandung senyawa
tanin galat. Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam daun
handeuleum yang mana mengandung senyawa tanin dan tidak
mengandung senyawa tanin katekuat dan tanin galat.

V.3 Pemisahan Ekstrak Daun Handeleum (Graptophyllum pictum) secara

Partisi (Pemisahan Cair-Cair)
Partisi cair-cair dilakukan dengan tujuan memisahkan senyawa-senyawa
yang telah teridentifikasi pada ekstrak metanol daun handeuleum. Prinsip partisi
ini yaitu pemisahan komponen kimia diantara dua fase pelarut yang tidak dapat
saling bercampur dimana sebagian komponen larut pada fase pertama dan
sebagiannya lagi larut pada fase kedua. Kedua fase yang mengandung zat
terdispersi dikocok, lalu didiamkan sampai terjadi pemisahan sempurna dan
terbentuk dua lapisan fase zat cair. Komponen kimia akan terpisah ke dalam dua
fasa tersebut sesuai dengan tingkat kepolarannya dengan perbandingan
konsentrasi yang tetap (Sudjadi, 1988).
Partisi ini dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat
yang mana bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat polar,
semipolar dan nonpolar. Pada pengerjaan awal, partisi dilakukan dengan
menggunakan pelarut non polar (n-Heksan), hal ini disebabkan karena jika pada
pengerjaan awal digunakan pelarut polar, maka dikhawatirkan adanya senyawa
nonpolar yang ikut terlarut, sebagaimana kita ketahui bahwa pelarut polar, selain
mampu melarutkan senyawa yang bersifat polar juga mampu melarutkan senyawa
yang bersifat nonpolar.

60
 Ekstrak metanol dilarutkan dengan metanol sampai dapat dituang ke
dalam corong pisah. Selanjutnya dipartisi dengan menggunakan pelarut n-heksan,
kemudian dikocok selama kurang lebih 1 menit sambil sesekali dibuka katup
corong pisah agar mengeluarkan gas yang terkumpul di dalamnya. Kemudian
didiamkan sampai terlihat bidang batas antara pelarut n-heksana dengan metanol.
Namun, tidak terlihat pemisahan tersebut, sehingga ditambahkan sedikit air, lalu
dikocok kembali, dan didiamkan sehingga diperoleh bidang batas. Air digunakan
untuk memisahkan bidang batas n-heksan dengan metanol karena air merupakan
senyawa yang sangat polar dan tidak bercampur dengan pelarut organik. Adapun
banyaknya air yang digunakan menurut literatur adalah metanol-air (2:1).
Kemudian pada saat partisi dengan pelarut n-heksan, terbentuk dua lapisan
yaitu lapisan atas pelarut n-heksan dan lapisan bawah adalah metanol. Hal ini
karena massa jenis n-heksan (0,4 g/ml) lebih kecil dibandingkan dengan massa
jenis air (1 g/ml). Perbandingan berat jenis yang dipakai yaitu antara BJ n-heksan
dengan air, dikarenakan air terlibat dalam proses partisi. Selain itu, air merupakan
senyawa yang sangat polar sehingga ia lebih cenderung menyatu dengan metanol
yang bersifat polar, bukan dengan n-heksan yang bersifat non polar, selain itu
porsi air yang digunakan cukup signifikan (20 ml) sehingga BJ air dibandingkan
dengan BJ n-heksan, bukan dengan metanol. Lalu dua pelarut yang telah terpisah
tersebut dipisahkan dengan cara membuka kran pada corong pisah. Partisi ini
dilakukan berkali-kali sampai pelarut n-heksana yang dihasilkan jernih.
Hal yang sama dilakukan pada pelarut selanjutnya yaitu etil asetat. Bagian
atas merupakan pelarut etil asetat sedangkan bagian bawahnya merupakan pelarut
metanol. Hal ini dikarenakan pelarut etil asetat memiliki massa jenis (0,66 g/ml)
lebih kecil dibandingkan dengan massa jenis air (1 gr/ml).
Hasil dari partisi masing-masing pelarut kemudian dievaporasi pada suhu
30-40oC dengan bantuan alat pompa vakum sehingga menghasilkan fraksi-fraksi
ekstrak kental n-heksan, etil asetat dan metanol.
Fraksi-fraksi tersebut akan mengandung senyawa yang memiliki tingkat
kepolaran yang sama. Pada praktikum ini digunakan pelarut etil asetat yang
bersifat semi polar, pelarut N heksana yang bersifat non polar, dan pelarut
metanol + air yang bersifat polar. Daun handeleum mengandung senyawa

61
alkaloid, tanin, saponin, steroid, flavonoid, glikosida, dan senyawa fenolik
(alkohol). Partisi etil asetat sebagai pelarut semi polar tidak mampu menarik
senyawa yang terlalu polar maupun terlalu nonpolar, tetapi dapat menarik
senyawa yang polar dan non polar. Kandungan senyawa yang tertarik dalam
pelarut etil asetat adalah tanin yang bersifat polar, alkaloid yang bersifat
semipolar, saponin yang bersifat polar, flavonoid yang bersifat polar, asam format
yang bersifat polar dan alcohol yang bersifat polar.
Partisi N heksana sebagai pelarut non polar dapat menarik senyawa-
senyawa non polar juga. Kandungan senyawa yang tertarik dalam pelarut N
heksana adalah steroid yang bersifat sangat non polar. Kemudian sisa dari partisi
(ekstrak + metanol + air) yang menggunakan pelarut polar dapat menarik
senyawa-senyawa yang bersifat polar. Kandungan senyawa yang tertarik dalam
pelarut metanol adalah glikosida yang bersifat sangat polar, tanin yang bersifat
polar, alkaloid yang bersifat semipolar, saponin yang bersifat polar, flavonoid
yang bersifat polar,asam format yang bersifat polar dan alcohol yang bersifat
polar. Ekstrak yang dipilih setelah partisi yaitu ekstrak n-heksan, dikarenakan
fraksi ini mempunyai rendemen yang cukup tinggi yaitu 13,817 % dan sebagai
pembanding pada kelompok 1.

V.4 Kromatografi Lapis Tipis Analitik Ekstrak Daun Handeleum

(Graptophyllum pictum)
Pemeriksaan dengan metode KLT ini bertujuan untuk memisahkan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolarannya yang telah didapatkan dari hasil
partisi sehingga didapatkan pola kromatogramnya. KLT juga dapat menegaskan
hasil yang didapat dari skrining fitokimia.
Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF254 karena dapat
berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar uv panjang gelombang pendek.
Larutan cuplikan sampel masing-masing pelarut (heksana, etil asetat dan metanol)
ditotolkan pada garis bawah plat menggunakan pipa kapiler dan dibiarkan
mengering. Fase gerak (larutan n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 4:1
dan 3:2) dan kertas saring dimasukkan ke dalam chamber hingga jenuh yang
ditandai dengan naiknya fase gerak sampai batas atas kertas saring. Tujuan

62
dijenuhkannya chamber ini adalah untuk menghomogenkan kondisi ruangan
chamber dan mencegah penguapan pelarut agar proses pemisahan dengan KLT
dapat berlangsung dengan baik.
Plat KLT yang sudah ditotolkan larutan cuplikan dimasukkan kedalam
chamber. Setelah elusi selesai, plat KLT kemudian divisualisasi dengan lampu
UV (254 dan 365 nm) untuk melihat spot-spot yang terbentuk.
Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi
dengan jarak tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa. Rf juga
menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam karena itu Rf juga
disebut factor referensi.
Pada lampu UV 254 nm lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel
akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah
karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang
terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya
yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari
tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke
keadaan semula sambil melepaskan energi.
Pada uji KLT ini dilakukan dua kali percobaan dengan menggunakan data
perbandingan pelarut yang berbeda-beda yakni perbandingan pelarut N heksana:
etil asetat (4:1) dan perbandingan pelarut N heksana: etil asetat (3:2). Hal ini
dilakukan untuk memilih pelarut yang menghasilkan puncak kromatogram
terbaik. Kriteria kromatogram yang baik adalah yang memiliki Rf sedang, bentuk
meruncing, dan diperoleh persen recovery yang tinggi. Rf yang terlalu tinggi dan
terlalu rendah menunjukkan pemisahan komponen yang belum efektif, bentuk
puncak juga akan mempengaruhi efektivitas pemisahan.
Pada pemisahan KLT dengan menggunakan perbandingan pelarut N
heksana : etil asetat (4 : 1) pada ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat tidak
terlihat spot dengan disinari dibawah sinar UV, tetapi dengan pereaksi godin
didapatkan spot warna. Hal ini mungkin disebabkan karena mungkin terlalu pekat
ekstrak yang ditotolkan. Maka dari itu dibuat pengujian KLT lagi dengan
menggunakan pelarut dengan perbandingan 3 : 2 dan ekstrak yang ditotolkan

63
hanyalah ekstrak metanol dan etil asetat. Pada perbandingan pelarut N-heksana :
etil asetat 3:2 ekstrak metanol menunjukkan spot di bawah sinar UV.

V.5 Kromatografi Kolom Adsorbsi Ekstrak Daun Handeleum

(Graptophyllum pictum)
Kromatografi kolom dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa pada
ekstrak daun handeuleum secara lebih spesifik dari hasil KLT karena
menggunakan gradien pelarut yang lebih banyak. Prinsip dari kromatografi ini
yaitu pemisahan suatu zat dalam eluen yang bergerak melalui fase diam sebagai
adsorben dikarenakan adanya perbedaan daya adsorpsi pada komponen-komponen
tersebut. Atau dapat dikatakan prinsip pemisahan ini didasarkan atas penyerapan
senyawa linarut (sampel) pada adsorben polar kemudian dielusi dengan pelarut
berupa cairan.
Fase diam (adsorben) yang digunakan yaitu silika gel (SiO3) yang bersifat
polar. Silika dipilih karena merupakan adsorben yang paling serbaguna dalam
kromatografi adsorpsi, mudah diperoleh, dan memberikan hasil yang unggul.
Pada dasarnya, teknik isolasi senyawa murni dengan kromatografi
adsorpsi dilakukan melalui 3 tahap, yaitu penyiapan kolom kromatografi,
pembuatan pelarut, dan isolasi. Sementara analisisnya menggunakan KLT.
Pada tahap penyiapan kolom kromatografi, dibuat bubur silika gel sebagai
fasa diam (adsorben) sekaligus berfungsi sebagai penyangga (matrik), yang mana
permukaan partikel-partikel penyangga mempunyai sifat aktif yang dapat
mengikat komponen-komponen atau molekul-molekul tertentu. Bubur silika
dibuat dengan mencampur silika gel dengan n-heksan sampai konsistensinya
menyerupai bubur atau slurry. N-heksan dipilih karena bersifat non polar,
sehingga tidak akan melarutkan silika yang bersifat polar, tetapi akan membuat
suatu konsistensi seperti bubur atau slurry. Bubur ini dimasukkan ke kolom yang
telah terdapat kapas yang berfungsi untuk menahan agar bubur silika tidak keluar
dari kolom. Lalu bubur ini dimasukkan dan dimampatkan. Ekstrak daun
handeuleum digerus dengan silika gel di cawan porselen sampai menjadi pasta
dan dimasukkan ke kolom.

64
 Dilakukannya metode elusi bertingkat (gradien) dari pelarut yang bersifat
non-polar, semi polar dan polar bertujuan agar yang keluar dulu adalah senyawa
yang non polar hingga senyawa yang paling polar, karena senyawa non polar
dapat larut dalam pelarut polar tetapi senyawa polar tak dapat larut dalam pelarut
non polar. Pemisahan diawali dengan pelarut N-heksan 100% yang besifat
nonpolar, diikuti dengan heksan: etil asetat(4:1); heksan: etil asetat(3:2); heksan:
etil asetat (2:3). Interaksi antara ekstrak dengan fase gerak heksan 100%
menyebabkan senyawa yang lebih polar tertahan dalam bubur silika sehingga
hanya senyawa yang benar-benar larut dalam fase gerak yang akan turun melewati
kolom dan proses yang sama pula dengan fase gerak perbandingan lain.
Vial nomor 1-9 dan 10-16 memiliki sifat nonpolar karena fase gerak yang
bersifat nonpolar maka senyawa-senyawa polar akan tertahan dalam bubur silika
dan senyawa nonpolar akan ikut keluar kolom bersama fase gerak. Nomor vial 17-
23 bersifat agak semi polar karena fase gerak heksan dan etil asetat dengan
perbandingan 3:2. Begitu seterusnya hingga fase gerak heksan: etil asetat (2:3).
Kemudian hasil dari kromatografi kolom yakni botol vial nomor 1 ( h:e
4:1); 4 (h:e 4:1); 7 (h:e 4:1); 10 ( h:e 3:2); 13 ( h:e 3:2) ; 16 ( h:e 3:2); 19 ( h:e
2:3); 22( h:e 2:3) dan 25( h:e 2:3) diuji dengan KLT untuk menegaskan pola
kromatogramnya. Fase gerak yang dipakai adalah perbandingan N heksana : Etil
asetat (3:2) dimana memiliki sifat kepolaran non polar dan semi polar.
Pada hasil pengamatan dengan dilihat dilampu UV pada panjang
gelombang 365 nm didapatkan pada urutan nomor vial 1 berpendar warna merah
dan ungu ; 4 berpendar warna merah kecoklatan dan ungu ; 7 berpendar warna
merah dan ungu ; 10 berpendar warna orange kemerahan dan ungu ; 13 berpendar
warna kuning kemerahan dan ungu; 16 berpendar warna kuning ; 19 berpendar
warna kuning kehijauan dan ungu ; 22 berpendar warna kuning kehijauan dan
ungu dan 25 berpendar warna kuning dan ungu. Selanjutnya adalah uji plat klt
dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm yang menghasilkan nilai Rf.

V.6 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Daun

Handeleum (Graptophyllum pictum)

65
V.6.1 Hasil penggabungan dari kromatografi kolom dengan KLT
Pada uji ini dilakukan penggabungan fraksi dari nomor urut vial
1,4, dan 7 kemudian nomor urut vial 11 dan 12. Perlakuan penggabungan
ini dilakukan karna hasil sebelumnya didapatkan pola kromatogram atau
pemisahan yang baik. Penggabungan dilakukan didalam botol vial yang
dilarutkan dengan sedikit etil asetat agar mudah ditotol pada plat KLT.
Pada totolan penggabungan 1,4,7 ( A1) yang dilihat dibawah lampu UV
365 nm menghasilkan warna yang berpendar yakni ungu dan merah. Pada
totolan penggabungan 11 dan 12 ( B1) yang dilihat dibawah lampu UV
365 nm menghasilkan warna yang berpendar yakni ungu dan merah
keorangean.

V.6.2 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

KLT Preparatif ditujukan untuk memisahkan campuran sehingga
diperoleh senyawa murni (5 mg-1g), untuk analisis lebih lanjut, untuk
meneliti bahan alam yang umumnya berjumlah kecil dan campurannya
kompleks pada ekstrak daun handeleum. Prinsip KLT Preparatif yakni
berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran
eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak
sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga
hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Nasution, 2010). Adsorpsi
adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap
adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan
partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi
(eluen) tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan
kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan terjadinya pemisahan.
Fase diam yang digunakan adalah silica gel 60 GF 254 yakni
ukuran pori 60 ; G: yang berarti CaSO4. H2O atau Gypsum sebagai
binder untuk memberikan kekuatan pada lapisan; F yang berarti bahan
indikator fluorescence / fosforescence yg ditambahkan; dan 254 adalah
indikator fosforescence yang ditambahkan untuk membantu penampakan

66
bercak tak berwarna. Indikator luminescence merupakan senyawa yang
apabila dikenai radiasi elektromagnetik ultraviolet (UV) pada 254 nm
atau 366 nm, maka akan menyerap energi radiasi tersebut untuk
mengeksitasikan elektron-elektronnya ke tingkat energi yang lebih tinggi
(exited state). Oleh karena itu, silika gel yang telah ditambah indikator
luminescence akan berpendar dengan penampakan warna tertentu.
Digunakan jenis silica ini karena dalam pembuatan bubur silica digunakan
air dimana bahan silica yakni gypsum dapat mengikat air dan akan
menempel pada plat kaca. Sifat silica gel ini bersifat polar. Silika gel dan
dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran
senyawa hdrofil (Hostettmann, 2006).
Plat KLTP dibuat dengan penuangan bubur silika ke atas plat kaca
dengan ketebalan tertentu. Pada praktikum ini dilakukan metode
pembentangan secara manual, yakni dengan membuat adsorben (silika gel
60 GF 254) menjadi bubur/slurry dengan mengocoknya bersama air (1:2)
secara kuat selama 90 detik lalu membentangkannya di atas plat kaca.
Perbandingan 1:2 merupakan nilai yang sesuai dengan rujukan untuk silika
gel tipe G. Ketebalan adsorben yang paling sering dipakai pada KLTP
adalah sekitar 0,5-2 mm. Ukuran plat kromatografi yang digunakan yaitu
20 x 20 cm.
Kekurangan metode manual yaitu tidak diketahuinya ketebalan
adsorben. Lapisan yang tebal memiliki kecenderungan mengelupas bila
telah kering. Oleh karena itu lapisan harus dibiarkan mengering selama
beberapa jam sebelum diaktifkan, sehingga dapat mencegah peretakan dan
pengerasan bagian luar.
Karena lapisan dibuat dari bubur adsorben dalam air, maka apabila
mekanisme pemisahan yang diharapkan adalah adsorpsi, plat KLTP harus
diaktifkan dahulu yaitu dengan pemanasan di dalam oven pada suhu 110
o
C selama 1 jam. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan molekul-
molekul air yang menempati pusat-pusat serapan pada adsorben, yang
selanjutnya akan membuka pori-pori adsorben sehingga luas permukaan
spesifiknya meningkat. Adsorben yang aktif dapat memiliki permukaan

67
spesifik ratusan meter2, sehingga akan meningkatkan aktivitas penyerapan
adsorben. Adanya air pada pusat-pusat serapan akan mengurangi
kemampuan adsorpsi sehingga menghambat tertambatnya komponen
sampel ke dalam adsorben. Jika suhu pengaktifan jauh di atas 110 oC dapat
menyebabkan terjadinya dehidrasi yang ireversibel sehingga pemisahan
justru menjadi tidak efektif. Lempeng yang telah diaktifkan harus
disimpan dalam lingkungan kering, yaitu desikator.
Aplikasi sampel pada KLTP dilakukan dengan melarutkan sampel
dalam sedikit etil asetat. Pelarut ini dipilih karena bersifat volatil, karena
jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan
harus sekitar 5% - 10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus
sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita.
Eluen yang digunakan yaitu n-heksan : etil asetat (3:2) yang telah
diorientasi pada praktikum KLT sebelumnya. Eluen ini bersifat non polar,
sehingga dapat mengurangi serapan dari setiap komponen dalam campuran
eluen. Jika komponen campuran eluen memiliki polaritas yang tinggi,
terutama akuades, akan dapat mengubah mekanisme pemisahan menjadi
partisi dan tidak lagi adsorpsi. Pada banyak kasus, eluen tunggal akan
menggerakkan bercak terlalu jauh atau bahkan tidak dapat menggerakkan.
Campuran yang baik akan menghasilkan eluen yang memiliki kekuatan
bergerak sedang, namun sebaiknya tidak mencampur lebih dari 2 eluen,
karena campuran yang kompleks akan cepat mengalami perubahan dengan
adanya perubahan suhu.
Kemudian plat KLTP dielusi secara tegak lurus terhadap garis
cuplikan sehingga campuran memisah menjadi beberapa pita. Elusi
dilakukan pada suhu tetap untuk mencegah perubahan komposisi
campuran eluen yang disebabkan oleh penguapan ataupun perubahan fase.
Kejenuhan atmosfer dalam bejana oleh uap eluen harus senantiasa
dipertahankan selama elusi karena akan mempengaruhi kesetimbangan
distribusi. Suatu gejala apabila atmosfer dalam bejana tidak dengan uap
eluen yaitu terjadinya pengembangan dengan permukaan eluen yang

68
berbentuk cekung dimana eluen bagian tepi lebih cepat bergerak daripada
bagian tengah.
Proses isolasi dilanjutkan dengan melalukan pemisahan dengan
metode KLT preparatif. Kedua fraksi ditotolkan ke atas permukaan KLT
preparatif. Kemudian dielusi dengan pelarut heksan dan etil dengan
perbandingan 3:2. Pada proses elusi sampel tidak terelusi dengan
sempurna, kedua fraksi tidak terpisah sebagaimana mestinya. Menurut
Elisa (2010), faktor-faktor yang mempengaruhi proses pemisahan spot
antara lain: struktur kimia senyawa yang akan dipisahkan; sifat adsorben
dan derajat aktifitasny; homogenitas dan tebal lapisan adsorben, karena
akan mempengaruhi aliran eluen;derajat kemurnian eluen dan
perbandingan eluen dalam campuran; derajat kejenuhan uap eluen dalam
bejana; teknik elusi berdasarkan arah aliran eluen; cara penotolan dan
jumlah sampel yang ditotolkan; suhu dan kesetimbangan distribusi
komponen sampel di antara dua fase. Silika hasil pemisahan tersebut tetap
dikikis dan dilanjutkan pada proses pengkoloman. Maka untuk
mendapatkan hasil yang maksimal,dilakukan kembali pengulangan pada
proses elusi. Setelah proses elusi berjalan sempurna selanjutnya dilakukan
visualisasi dengan lampu UV 254 nm dan 365 nm. Hasil visualisasi
menunjukan flouresensi pada 3 area-pada lampu UV 365yang diduga
senyawa murni dengan warna fluoresensi biru keunguan pada area 1dan 2
serta warna fluoresensi keorenan pada area 3. Silika pada ketiga area
tersebut kemudian disisihkan untuk selanjutnya dilakukan pengkoloman.
Pengkoloman dilakukan dengan metode absorpsi kolom dimana area silika
yang telah dikikis kemudian dikolom dengan pelarut etil asetat. Kemudian
didapatkan 4 fraksi kolom yang diberi nama A1; B1; B2 dan B3. Keempat
fraksi tersebut selanjutnya dilihat kemurniannya melalui KLT analitik
dengan pelarut heksan : etil (3:2). Selanjutnya dilakukan visualisasi
dengan lampu UV 254 nm dan 365 nm, didapatkan 2 spot berwarna ungu
dan jingga kekuningan pada area A1. Menurut Wagner (1996), lampu UV
365 nm, alkaloid akan berfluoresens biru, biru-hijau atau ungu dan saponin
triterpenoid yang ditunjukkan dengan bercak berwarna orange kemerahan.

69
Pada area B1 dan B3 tidak tampak adanya warna hal tersebut disebabkan
karena konsentrasi fraksi yang terlalu kecil sehingga pada saat pemisahan
senyawa tidak akan terlihat jelas. Pada area B2 didapatkan 3 spot berwarna
ungu kebiruan dan orange, pada area ini warna spot tidak terlalu tajam
sebabnya karena konsentrasi fraksi yang terlalu kecil (encer). Seperti yang
telah dijelaskan bahwa warna biru keunguan mengindikasikan bahwa
senyawa tersebut adalah alkaloid dan warna orange mengindikasikan
bahwa senyawa tersebut adalah saponin terpenoid. Maka dari proses
isolasi ektrak heksan daun Handeleum dipastikan terdapat senyawa
alkaloid dan saponin terpenoid dimana sesuai dengan literatur jurnal
Pharmacognostical evaluation of aerial parts of Graptophyllum
pictum (L.) Griff. (Syn: Justicia picta Linn.): A well-known folklore
medicinal plant, bahwa daun Handeleum mengandung saponin terpenoid
dan alkaloid. Namun proses isolasi belum berjalan dengan baik sehingga
tidak didapatkan senyawa murni alkaloid ataupun senyawa murni saponin
terpenoid.

70
 BAB VI
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil dan pembahasan yang sudah dijabarkan, maka dapat
ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1) Isolasi senyawa dalam Daun Handeleum meliputi proses ekstraksi,
skrining fitokimia, partisi (pemisahan cair-cair), kromatografi lapis
tipis, kromatografi kolom dan KLT preparatif.
2) Pembuatan ekstrak Daun handeleum menggunakan metode ekstraksi
sonikasi dan maserasi yang menghasilkan ekstrak kental sebesar 18,67
gram dengan rendemen 3,74 %.
3) Pada uji skrining fitokimia didapatkan hasil bahwa Daun Handeleum
positif mengandung alkaloid, tanin, flavonoid, steroid dan negative
mengandung kumarin,kuinon,tanin katekuat,tanin galat, dan minyak
atsiri. Hal ini sesuai dengan kandungan kimia di dalam daun
handeuleum.
4) Prinsip partisi yaitu pemisahan campuran komponen kimia yang
terdapat dalam ekstrak dengan menggunakan dua pelarut yang tidak
saling bercampur, sehingga komponen kimia akan larut ke dalam
pelarut yang sesuai dengan tingkat kepolarannya. Fraksi yang dipilih
yaitu fraksi n-heksana.
5) Pelarut etil asetat yang bersifat semipolar dapat menarik senyawa polar
dan nonpolar, yakni tanin, alkaloid, saponin, flavonoid, asam format
dan alkohol ; Pelarut N-heksana yang bersifat nonpolar dapat menarik
senyawa non polar, yakni steroid.
6) Pemeriksaan dengan metode KLT bertujuan untuk memisahkan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolarannya yang telah didapatkan
dari hasil partisi sehingga didapatkan pola kromatogramnya. KLT juga
dapat menegaskan hasil yang didapat dari skrining fitokimia.
Pemisahan KLT menggunakan perbandingan pelarut N heksana : etil
asetat (4:1) dan N-heksana: etil asetat 3:2.
7) Prinsip kromatografi kolom adsorpsi yaitu pemisahan suatu zat dalam
eluen yang bergerak melalui fase diam sebagai adsorben dikarenakan

71
 adanya perbedaan daya adsorpsi pada komponen-komponen tersebut.
Teknik isolasi senyawa murni dengan kromatografi adsorpsi dilakukan
melalui 3 tahap, yaitu penyiapan kolom kromatografi, pembuatan
pelarut, dan isolasi. Sementara analisisnya menggunakan KLT.
8) Hasil kromatogrami kolom yang kemudian diuji dengan klt dengan
sinar uv pada panjang gelombang 365 nm didapatkan pada noda 1,4,7 (
h:e 4:1) berpendar warna ungu dan merah; pada noda 10 (h:e 3:2)
berpendar warna ungu dan orange kemerahan; pada noda 13 (h:e 3:2)
berpendar warna kuning kemerahan dan ungu; pada noda 16 ( h:e 3:2)
berpendar warna kuning; pada noda 19,22,25 (h:e 2:3) berpendar
warna kuning kehijauan dan ungu.
9) Pada hasil penggabungan senyawa ekstrak N heksana 1,4 dan 7 dari
hasil kromatografi kolom didapatkan warna yang berpendar adalah
ungu dan merah.
10) Pada hasil penggabungan senyawa ekstrak N heksana 11 dan 12 dari
hasil kromatografi kolom didapatkan warna yang berpendar adalah
ungu dan orange kemerahan.
11) Prinsip dari KLT Preparatif adalah terjadi berdasarkan perbedaan daya
serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia
yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap
adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen
bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang
menyebabkan pemisahan.
12) Pembuatan plat KLTP dengan metode pembentangan menggunakan
bubur silika gel 60 GF 254, yang mana dibuat dengan rasio silika:air
adalah 1:2. Plat KLTP sebelum digunakan harus diaktifkan dengan
pengeringan pada 110oC yang bertujuan menghilangkan molekul-
molekul air yang menempati pusat-pusat serapan pada adsorben
sehingga kemampuan penyerapannya meningkat.
13) KLTP yang kemudian diuni secara KLT analitik didapatkan 2 spot
berwarna ungu dan jingga kekuningan pada area A1; pada area B1 dan
B3 tidak tampak adanya warna; pada area B2 didapatkan 3 spot

72
berwarna ungu kebiruan dan orange yang tidak terlalu tajam. Dari
proses isolasi ektrak heksan daun Handeleum diduga terdapat senyawa
alkaloid dan saponin terpenoid dimana sesuai dengan literatur acuan.
Tetapi hal ini harus dibuktikan dengan pengujian lebih lanjut yang
mana menghasilkan spot tunggal pada KLT serta dikonfirmasi dengan
instrument.

73
 DAFTAR PUSTAKA

Akbar S, Kurnia B, dan Istiqmah. (2001). Kandungan Rumput Laut di Dalam

Teknologi Budidaya Rumput Laut (Kappaphipus alvarezii). Bandar
Lampung: Balai Budidaya Laut.
Anonim. 1995. Materia Medika Indonesia. Departemen Kesehatan Republik
Indonesia: Jakarta.
Anonim. Diakses melalui
elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/24048/a877915a150aeace10a
pada Minggu, 6 November 2016.
Anwar, S. 2012. Pola Tanam Tumpangsari. Agroekoteknologi. Litbang :
Deptan.
Ardiarti, Retno. 2013. "Aktivitas Bakteri Endofit Batang Mangrove Avicennia
marina Sebagai Penghasil Antibiotik". Skripsi. Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan. Universitas Padjajaran. Jatinangor.
Ashokkumar M, Sunartio D, Kentish S, Mawson R, Simons L, Vilkhu K,
Versteeg C. 2008. Modification of food ingredients by ultrasound to
improve functionality: A preliminary study on a model system. Innov
Food Sci Emergi Technol. 9(2):155160. doi:
10.1016/j.ifset.2007.05.005.
Buchbauer, G., Jager, W., Dietrich, H., Plank, Ch., and Karamat, E. 1991.
Aromatherapy: Evidence for Sedative Effects of Essential Oil
of Lavender after Inhalation. Journal of Biosciences; 46c,
1067- 1072.
Buckle, J. 1999. Use of Aromatherapy as Complementary Treatment for
Chronic Pain. J. Alternative Therapies; 5, 42-51.
Ciulei, J. 1984. Metodology for Analysis of Vegetables and Drugs.
Bucharest Rumania: Faculty ofmacy. Pp. 11- 26.
Darwis D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium Dalam Penelitian Senyawa Bahan
Alam Hayati, Workshop Pengembangan Sumber Daya Manusia
Dalam Bidang Kimia Organik Bahan Alam Hayati, FMIPA
Universitas Andalas Padang.

74
Djamil, Ratna , Tria Anelia. 2009. Penapisan Fitokimia, Uji BSLT, dan Uji
Antioksidan Ekstrak Metanol beberapa Spesia Papilionaceae. Jurnal
Ilmu Kefarmasian Indonesia. Vol.7, No. 2. Hal. 65-71. September
2009.
Fajriyah. 2011. TEKNOLOGI EKSTRAKSI DAUN UNGU (Graptophyllum
pictum) DALAM ETHANOL 70% DENGAN METODE PERKOLASI.
Diakses melalui digilib.uns.ac.id pada Minggu, 09 Oktober 2016.
Fessenden, R.J dan Fessenden, J.S 1986. Kimia Organik, Jilid 2. Edisi
Ketiga Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D. Jakarta :
Erlangga.
Gritter, R.J., Bobbit, J.M., dan Swharting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi.
Edisi Kedua. Penerbit ITB. Bandung
Gunawan, D., dan S. Mulyani. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid I.
Jakarta: Penerbit Penebar Swadaya.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Diterjemahkan oleh Padmawinata
K, Soediro I. ITB, Bandung.
Isnawati, Ani. Et all. 2008. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Kumarin dari
Tanaman Artemisia Annua(L). Media Litbang Kesehatan Volume
XVIII No 3. Tahun 2008.
Johnson, E.L., dan Stevenson, R., 1991. Dasar Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi. Penerbit ITB Bandung.
Keng SB, Lim M. Denture plaque distribution and the effectiveness of a
perborate-containing denture cleaner. Quintessence Int 1996.
Maria van Iersel, M. Sensible Sonochemistry. Doctor of Philosophy
Dissertation, Eindhoven: Eindhoven University of Technology, 2008.
Martini Wali, et al. 2014. Identifikasi Kandungan Kimia Bermanfaat pada
Daun Jabon Merah dan Putih (Anthocephalus spp.). Jurnal
Silvikultur Tropika Vol. 05 No. 2.
Mason, J., L. Paniwynyk dan P. Lorimer. 1996. The Use Of Ultrasound In
Food Technology. Ultrasonics Sonochemistry. 3. Hlm
Melecchi, M.I.S., Pres, V.F., Dariva, C., Zini, C.A. Abad, F.C., Martinez,
M.M., Caram, E. B. (2006) Optimization of the sonication extraction

75
 method of Hibiscus tiliaceus L. flowers, Ultrasonics Sonochemistry, 13,
242-250.
Pudjaatmaka, A. Hadyana. (1994). Buku Ajar Vogel: Kimia Analisis
Kuantitatif Anorganik. Jakarta : Buku Kedokteran EGC.
Purba, R.D 2001. Analisis Komposisi Alkaloid Daun Handeuleum
(Graptophyllum pictum (Linn), Griff) yang Dibudidayakan dengan
Taraf Nitrogen yang Berbeda (Skripsi). Bogor: Institut Pertanian
Bogor.
Rinastiti, M, zcan, M, Siswomihardjo, W, Busscher, H.J, 2010, Effect of
Surface Conditioning on Repair Bond Strenghts of Non-Aged and Aged
Microhybrid, Nanohybrid, and Nanofilled Composite Resins, Clin Oral
Invest: 25 May 2010
Robinson, T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi.
Bandung: Penerbit ITB, pp. 152-196.
Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar
Ros Sumarny, dkk. 2013. Efek anti inflamasi dan anti diare ekstrak etanol
herba meniran dan daun ungu. Jakarta : Fakultas Farmasi Universitas
Pancasila
Santos, E. L. ; Ludke, M. do C. M. M. ; Barbosa, J. M. ; Rabello, C. B. V. ;
Ludke, J. V. ; Winterle, W. de M. C. ; Silva, E. G. da, 2009. Coconut
meal levels in ration for fingerling Nile tilapia. Rev. Bras. Saude Prod.
Anim., 10 (2): 390-397.
Sangi., M. dkk. (2008). Analisis Fitokimia Tumbuhan Obat di Kabupaten
Minahasa Utara. Chemistry Progress.
Sastrohamidjojo, H. 1985. Kromatografi. Edisi I. Cetakan I. Yogyakarta :
Liberty.
Sastrohamidjojo. 1996. Sintesis Bahan Alam. Cetakan Pertama, Yogyakarta :
Gadjah Mada University Press.
Spencer, N. D. 1988. Direct Oxidation Of Methane. Journal Of Catalysis.
Sthahl Egon, (1969). Thin Layer Chrmatography, Heidelberg, New York.
Sudarmadji, S.dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta :
Penerbit Liberty.

76
Sudjadi. 1986. Metode Pemisahan, Kanisius. Yogyakarta
Suryati, E dan Y. Hala. 2002. Isolasi Bioaktif Hydrozoan Lytocarpus
phillipinus Sebagai Bakterisida pada Udang. Marina Chimica Acta
Vol.1(1): 4-8.
Suslick, K.S. 1999. Application Of Ultrasound To Materials Chemistry.
29:295326. University of Illinois: Urbana-Illinois.
Taofik, dkk. 2010. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Ekstrak Air
Daun Paitan (Thitonia Diversifolia) Sebagai Bahan Insektisida
Botani Untuk Pengendalian Hama Tungau Eriophydae. Alchemy
Vol. 2(1): 104-157.
Thompson, L.H dan Doraiswamy, L.K. 1999. Sonochemistry : Science and
Engineering. Industrial and Engineering Chemistry Research 38 : 1215
1249.
Voight, R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Terjemahan : S. Noerono.
Gadjah Mada University Press. Indonesia.
Wahyuningtyas E. The Graptophylum pictum effect on acrylic resin complete
denture plaque growth. Maj Ked Gigi (Dent J) 2005.

77
Lampiran 1. Skema Kerja Isolasi Senyawa dari Ekstrak Metanol Daun Wungu
(Graptophyllum pictum L.)

Dilakukan preparasi sampel: disortasi

5 kg daun Wungu basah, dicuci, diperkecil ukuran,
(Graptophyllum dikering anginkan, disortasi kering,
pictum L.) dihaluskan. didapat serbuk
simplisia
Disonikasi lalu dilanjutkan dengan
1 kg simplisia kering daun maserasi menggunakan
Wungu (Graptophyllum - methanol, disaring, dan
pictum L.) dievaporasi Ekstrak

Skrinning Fitokimia
(Alkaloid,saponin,flavonoid,tan
Ekstrak metanol daun Wungu in,kumarin,kuinon,minyak
18,67 gram dengan rendemen atsiri, streroid&triterpenoid)
3,743 %
Partisi Cair-Cair, dengan pelarut n-
Fraksi Etil Fraksi N-heksan
heksan, etil asetat, dan metanol
Fraksi
Asetat Metano
3,71 gram
l Di evaporasi dan di
2,03 gram analisis dengan KLT

Kromatografi kolom,
2,58 gram ekstrak fraksi N- pelarut n-heksan
heksan (Graptophyllum
pictum L.)

Di analisis dengan KLT

Vial 1,4,7,10,13,16,19,22,
dan 25

Penggabungan ekstrak pada

vial 1,4,7 dan vial 11,12

Isolat Senyawa (Graptophyllum

pictum L.)

KLT
Pre
par
atif

78