Abstract

In an attempt to explain the shortcomings of the routine thick-film examination in the diagnosis of
scanty malaria parasitaemias, a direct comparison, in terms of positivity and parasite counts, was made
between the results of routine thick-film study and long-term examination of thin films taken at the same
time from the same individuals.

Calculation of the average thickness of the thick and thin films prepared allowed these comparative
results to be corrected according to the actual volume of blood examined. From these corrected figures it
was observed that both parasite counts and positivity were significantly higher in the thin-film series, and it
has been deduced that heavy losses in parasites, varying from 60 % to 90 %, occurred during the
dehaemoglobinization and staining of thick films. The epidemiological implications of this finding in
malaria practice are discussed. Emphasis is laid on the importance of further research in order to improve
the sensitivity of the routine thick film in the diagnosis of the scanty parasitaemias met with in the later
stages of malaria-eradication programmes.

Keywords: routine thick film, thin film, malaria

Abstrak

Dalam upaya untuk menjelaskan kekurangan dari pemeriksaan sediaan darah tebal untuk
diagnosis parasit malaria dalam jumlah kecil, dengan perbandingan langsung, dari segi positif dan jumlah
parasit, telah dibuat perbandingan hasil penelitian antara sediaan darah tebal dan jangka panjang
pemeriksaan sediaan darah tipis dalam jangka panjang yang diambil pada waktu yang sama dari orang
yang sama.

Perhitungan dari rata-rata ketebalan sediaan darah tebal maupun sediaan darah tipis yang sudah
dipersiapkan, membuat hasil perbandingan tersebut menjadi lebih baik sesuai dengan volume darah
sesungguhnya yang sudah diperiksa. Dari hasil yang sudah dibenarkan tersebut, dapat dilihat bahwa
perhitungan jumlah parasit dan yang positif secara signifikan lebih tinggi dalam sedian darah tipis dan
penurunan parasit yang ada dalam jumlah besar, berkisar dari 60% sampai 90%, terjadi selama
dehemoglobinisasi dan pewarnaan sediaan darah tebal. Implikasi epidemiologi dari temuan ini kemudian
dibahas dalam penelitian tentang malaria. Penekanan diletakkan pada pentingnya penelitian lebih lanjut
dalam rangka meningkatkan sensitivitas dari sediaan darah tebal dalam mendiagnosis jumlah parasit
malaria dalam jumlah kecil yang kemudian akan dilanjutkan dengan program pemberantasan malaria.

Kata kunci: sediaan darah tebal, sediaan darah tipis, malaria

-1-
PEMBAHASAN

A. Sediaan Apus Darah Tepi

Sediaan apus darah tepi adalah suatu cara yang sampai saat ini masih digunakan pada
pemeriksaan di laboratorium. Prinsip pemeriksaan sediaan apus ini adalah dengan meneteskan
darah lalu dipaparkan di atas objek glass, kemudian dilakukan pengecatan dan diperiksa dibawah
mikroskop.1

Guna pemeriksaan apusan darah:

Evaluasi morfologi dari sel darah tepi (eritrosit, trombosit, dan leukosit)
Memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit
Identifikasi parasit (misal : malaria. Microfilaria, dan Trypanosoma).

Sediaan apus darah tepi dapat diwarnai dengan berbagai macam metode termasuk larutan-
larutan yang sederhana antara lain: pewarnaan Giemsa, pewarnaan acid fast, pewarnaan garam,
pewarnaan wright, dan lain-lain. Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode
pewarnaan ini banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel
sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal Tripanosoma, Plasmodia dan
lain-lain dari golongan protozoa.1

Pewarnaan Giemsa (Giemsa Stain) adalah teknik pewarnaan untuk pemeriksaan

mikroskopis yang namanya diambil dari seorang peneliti malaria yaitu Gustav Giemsa. Pewarnaan
ini digunakan untuk pemeriksaan sitogenetik dan untuk diagnosis histopatologis parasit malaria
dan juga parasit jenis lainnya.1

Dasar dari pewarnaan Giemsa adalah presipitasi hitam yang terbentuk dari penambahan
larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan di dalam metanol. Yaitu dua zat warna yang
berbeda yaitu Azur B (Trimetiltionin) yang bersifat basa dan eosin Y (tetrabromoflurescin) yang
bersifat asam seperti kromatin, DNA dan RNA. Sedangkan eosin Y akan mewarnai komponen sel
yang bersifat basa seperti granula, eosinofili dan hemoglobin. Ikatan eosin Y pada azur B yang
beragregasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai efek Romanowsky
giemsa. Efek ini terjadi sangat nyata pada DNA tetapi tidak terjadi pada RNA sehingga akan
menimbulkan kontras antara inti yang berwarna dengan sitoplasma yang berwarna biru.1

Pewarnaan giemsa adalah teknik pewarnaan yang paling bagus dan sering digunakan untuk
mengidentifikasi parasit yang ada di dalam darah ( blood-borne parasite ).1

-2-
 Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau vena,
yang dihapuskan pada kaca obyek. Pada keadaan tertentu dapat pula digunakan EDTA1

Jenis apusan darah2 :

1. Sediaan darah tipis

Ciri- ciri apusan sediaan darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk
pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal, morfologinya lebih jelas. bentuk
parasit plasmodium berada dalam eritrosit sehingga didapatkan bentuk parasit yang utuh dan
morfologinya sempurna. Serta lebih mudah untuk menentukan spesies dan stadium parasit dan
perubahan pada eritrosit yang dihinggapi parasit dapat dilihat jelas. Sediaan darah tepi hanya
mempunyai satu lapisan sel darah.

2. Sediaan darah tebal

Ciri- ciri apusan sediaan darah tebal yaitu membutuhkan darah lebih banyak untuk
pemeriksaan dibanding dengan apusan darah tipis, sehingga jumlah parasit yang ditemukan lebih
banyak dalam satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sediaan
ini mempunyai bentuk parasit yang kurang utuh dan kurang begitu lengkap morfologinya. Ia
memerlukan beberapa lapisan sel darah.

B. Giemsa

Pewarna Giemsa 10% sebagai pewarna yang umum digunakan agar sediaan terlihat lebih
jelas. Pewarnaan ini sering disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak
dipakai untuk mempelajari morfologi darah, sel-sel sumsum dan juga untuk identifikasi parasit-
parasit darah misalnya dari jenis protozoa. Zat ini tersedia dalam bentuk serbuk atau larutan yang
disimpan di dalam botol yang gelap.2 (Kurniawan, 2010).

Zat warna yang digunakan dalam metode Romanovsky adalah Giemsa yang sebelumnya
telah diencerkan dengan aquades. Semakin lama pewarnaan yang dilakukan maka intensitasnya
menjadi semakin tua. Preparat apus yang yang telah selesai dibuat kemudian diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran 100x. Gambar yang didapat dalam hasil menunjukan sel-sel butir
darah baik eritrosit, leukosit, trombosit, atau jenis parasit yang lain2 (Maskoeri, 2008).

-3-
 Sediaan apus darah secara rutin diwarnai dengan campuran zat warna khusus. Pewarnaan
ini disebabkan karena oksidasi methylen blue dan pembentukan senyawa baru dalam campuran
yang dinamakan azure. Setelah pemberiaan campuran jenis Romanosky, diferensiasi sel-sel dapat
dilakukan Berdasarkan 4 sifat pewarnaan yang menyatakan afinitas struktur sel oleh masing-
masing zat warna dari campuran2, yaitu:

1. Afinitas untuk methylen blue

2. Afinitas untuk azure dikenal sebagai azurefilik ( ungu).
3. Afinitas untuk eosin (suatu zat warna asam ) dikenal sebagai asidofilik atau
eosinofilia.(merah muda kekuningan ).
4. Afinitas untuk komplek zat warna yang terdapat dalam campuran, secara tidak tepat
dianggap netral, dikenal sebagai neutrofilia (salmon-pink smplilac ). ( Safar, 2009 ).

Giemsa adalah zat warna yang terdiri dari eosin dan metilen azur memberi warna
merah muda pada sitoplasma dan metilen biru memberi warna pada inti leukosit . Ketiga jenis
pewarna ini dilarutkan dengan metil alcohol dan gliserin. Larutan ini dikemas dalam botol coklat (
100 500 1000 cc ) dan dikenal sebagai giemsa stock dengan pH 7 .2 ( Depkes RI, 2010 ).

Pewarnaan Sediaan Darah

Sediaan darah tebal biasanya di hemolisis terlebih dulu sebelum pewarnaan, sehingga
parasit tidak lagi tampak dalam eritrosit. Kelebihan dari sediaan ini yaitu dapat menemukan parasit
lebih cepat karena volume darah yang digunakan lebih banyak. Jumlah parasit lebih banyak dalam
satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sedangkan kelemahan
dari sediaan darah tebal bentuk parasit yang kurang lengkap morfologinya.3

a. Ciri-ciri sediaan yang baik3 :

Sediaan yang dibuat harus bersih yaitu sediaan tanpa endapan zat pewarnaan. Sediaan juga
tidak terlalu tebal, ukuran ketebalan dapat dinilai dengan meletakkan sediaan darah tebal di atas
arloji. Bila jarum arloji masih dapat dilihat samar-samar menunjukkan ketebalan yang tepat. Selain
menggunakan arloji dapat juga dengan cara meletakkan sediaan darah tebal di atas koran, kalau
tulisan di bawah koran sediaan masih terbaca, berarti tetesan tadi cukup baik. (Sandjaja, 2007).

b. Hasil sediaan darah tebal yang baik3 :

-4-
 Inti sel darah putih biru lembayung tua, granula biasanya tidak tampak, hanya granula
eosinofil. Trombosit berwarna lembayung muda dan sering berkelompok. Parasit tampak kecil,
batas sitoplasma sering tidak nyata. Titik Maurer dan titik Ziemen (P. malariae) biasanya hilang.
Titik Scuffner sering masih terlihat sebagai zona merah. Bentuk cincin sering tampak sebagai
koma, tanda seru, atau burung terbang, terutama pada P. falciparum. Tropozoit yang sudah
agak besar tampak pigmen. Sitoplasma P. Vivax dapat terlihat jelas seperti amuboid. Sitoplasma
pada P. malariae mulai mengumpul disekitar inti, dan bentuk schizon tampak jelas. (Irianto,
2009).

c. Parasit yang ada dalam sediaan darah tebal3

1. Plasmodium Vivax

Ciri khas dari Plasmodium vivax yaitu eritrosit yang dihinggapi membesar, bila tropozoid
tumbuh maka bentuknya tidak teratur, berpigmen halus. Tropozoid yang sedang berkembang biak
dari Plasmodium vivax berbeda-beda dan tidak beratur bentuknya. Eritrosit yang terinfeksi oleh
parasit ini mengalami pembesaran dan pucat karena kekurangan hemoglobin.Tropozoit muda
tampak sebagai cincin dengan inti pada satu sisi.Tropozoit tua tampak sebagai cincin amuboid
akibat penebalan sitoplasma yang tidak merata. Dalam waktu 36 jam parasit akan mengisi lebih
dari setengah sel eritrosit yang membesar. Proses selanjutnya inti sel parasit akan mengalami
pembelahan dan menjadi bentuk schizont yang berisi merozoit berjumlah antara 16 18 buah.
Gametosit mengisi hampir seluruh eritrosit. Mikrogametosit berinti besar dalam pewarnaan
Giemsa akan berwarna merah muda sedangkan sitoplasma berwarna biru. Makrogametosit berinti
padat berwarna merah letaknya biasanya di pinggir.Terdapat bintik-bintik merah yang disebut titik
Schuffner pada eritrosit yang terinfeksi parasit ini.

-5-
 Gambar 1. Plasmodium Vivax

2. Plasmodium Malariae

Plasmodium malariae ukurannya lebih kecil, berbentuk cincin apabila dicat dengan giemsa
mirip cincin Plasmodium vivax hanya sitoplasma lebih biru dan parasit lebih kecil, teratur serta
padat. Parasit ini juga dapat berbentuk pita yang melintang pada sel darah merah bentuk kromatin
seperti benang ( Sungkar S, 1994 )

Gambar 2. Plasmodium malariae

3. Plasmodium Falciparum

Pasmodium falciparum, dapat menyebabkan penyakit tertian maligna ( malaria tropica

), infeksi oleh spesies ini menyebabkan parasitemia yang meningkat jauh lebih cepat
dibandingkan spesies lain dan merozoitnya menginfesi sel darah merah dari segala umur ( baik
muda maupun tua ). Hanya ditemukan bentuk tropozoit dan gametosit pada darah tepi, kecuali
pada kasus infeksi yang berat. Schizogoni terjadi di dalam kapiler organ dalam termasuk

-6-
jantung. Sedikit schizont di darah tepi, terkait berat ringannya infeksi. Schizont berisi merozoit
berjumlah 16 20 buah. Eritrosit yang terinfeksi tidak mengalami pembesaran. Bisa terjadi
multiple infeksi dalam eritrosit (ada lebih dari satu parasit dalam eritrosit), bentuk acolle (inti
menempel dinding eritrosit) dan spliting (inti parasit terpecah dua). Gametosit berbentuk
pisang, makrogametosit inti kompak (mengumpul) biasanya di tengah sedangkan
makrogametosit intinya menyebar. Sitoplasma eritrosit terdapat terdapat bercak-bercak merah
yang tidak teratur disebut titik Maurer.

Gambar 3. Plasmodium Falciparum

4. Plasmodium Ovale

Plasmodium ovale merupakan parasit yang jarang terdapat pada manusia bentuknya
mirip dengan plasmodium vivax sel darah merah yang dihinggapi akan sedikit membesar,
bentuknya lonjong dan bergerigi pada satu ujungnya adalah khas plasmodium ovale.
Plasmodium ovale menyerupai plasmodium malariae pada bentuk skizon dan tropozoid yang
sedang tumbuh. ( Sungkar S, 1994 )

-7-
 Gambar 4. Plasmodium Ovale

d. Faktor yang harus diperhatikan untuk mencapai pewarnaan yang baik

1. Kualitas dari stock giemsa yang digunakan standar mutu

a) Stock giemsa yang belum tercemar air

b) Zat warna giemsa masih aktif

2. Kualitas dari air pengencer giemsa

a) Air pengencer harus jernih dan tidak berbau

b) Derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8 - 7,2 perubahan pH pada
larutan giemsa berpengaruh pada sel-sel darah

3. Kualitas pembuatan sediaan darah

Dalam pembuatan sediaan darah tebal yang perlu diperhatikan adalah tebalnya
sediaan. Ketebalan dikatakan memenuhi syarat apabila di setiap lapang pandang
terdapat 10 20 sel darah putih.

4. Kebersihan sediaan darah

Zat warna yang mengendap dipermukaan pada akhir pewarnaan tertinggal pada sel
darah dan akan mengotorinya. Oleh karna itu pada akhir pewarnaan larutan giemsa
harus dibilas dengan air yang mengalir.

-8-
 5. Syarat sediaan Kaca

Kaca sediaan dipakai untuk menempelkan darah yang sering kali diambil dari
tempat yang jauh, sediaan darah ini kemudian diproses, diperiksa dan kemudiaan
disimpan atau dicuci kembali, maka penting sekali penggunaan kaca sediaan yang
baik dan bermutu. Syarat untuk kaca sediaan yang baik adalah :

a. Bening atau jernih

b. Permukaan licin, tidak tergores-gores
c. Bersih ( bebas dari lemak, debu, asam, atau alkalis )
d. Tebal antara 1,1 dan 1,3 mm
e. Ukurannya sama ( Depkes RI, 1993)

e. Prosedur pewarnaan darah tebal :

1) Teteskan darah pada sebuah slide bersih.

2) Tetesan darah dilebarkan sambil dengan kaca secara berputar, sampai menjadi
sediaan darah dengan diameter 1 - 2 cm.
3) Biarkan mengering di udara .
4) Pengecatan sediaan darah tebal :
Rendam apusan darah dalam air untuk melisiskan sel darah merah.
Setelah darah lisis rendam atau genangi dengan giemsa selama 15-20 menit.
Biarkan sampai kering, periksa sediaan darah dibawah mikroskop.
5) Pemeriksaan darah tebal dilakukan dengan cara :
Siapkan mikroskup yang sudah dibersihkan dengan xylol.
Pasang sediaan dengan perbesaran 100x dengan diberi anisol.
Catat hasil pengamatan.

f. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada pewarnaan giemsa :

Perhatikan agar metanol tidak mengenai sediaan tetes tebal karena akan membuat bagian
tersebut terfiksasi dan hasil pewarnaan tidak sesuai dengan hasil yang diinginkan.
Hati-hati pada saat membilas sediaan tetes tebal karena bagian tersebut tidak difiksasi dan
tidak menempel dengan kuat ke slide kaca.

-9-
Pengertian Malaria

Malaria adalah penyakit menular yang disebabkan oleh parasit (protozoa) dari genus
plasmodium, yang dapat ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles. Istilah malaria diambil
dari dua kata bahasa Italia yaitu mal (buruk) dan area (udara) atau udara buruk karena dahulu
banyak terdapat di daerah rawa-rawa yang mengeluarkan bau busuk. Penyakit ini juga
mempunyai nama lain, seperti demam roma, demam rawa, demam tropik, demam pantai,
demam charges, demam kura dan paludisme (Prabowo, 2008).

Soemirat (2009) mengatakan malaria yang disebabkan oleh protozoa terdiri dari empat
jenis species yaitu plasmodium vivax menyebabkan malaria tertiana, plasmodium malariae
menyebabkan malaria quartana, plasmodium falciparum menyebabkan malaria tropika dan
plasmodium ovale menyebabkan malaria ovale.

Menurut Achmadi (2010) di Indonesia terdapat empat spesies plasmodium, yaitu:

1. Plasmodium vivax, memiliki distribusi geografis terluas, mulai dari wilayah beriklim
dingin, subtropik hingga daerah tropik. Demam terjadi setiap 48 jam atau setiap hari
ketiga, pada siang atau sore. Masa inkubasi plasmodium vivax antara 12 sampai 17 hari
dan salah satu gejala adalah pembengkakan limpa atau splenomegali.
2. Plasmodium falciparum, plasmodium ini merupakan penyebab malaria tropika, secara
klinik berat dan dapat menimbulkan komplikasi berupa malaria celebral dan fatal. Masa
inkubasi malaria tropika ini sekitar 12 hari, dengan gejala nyeri kepala, pegal linu,
demam tidak begitu nyata, serta kadang dapat menimbulkan gagal ginjal.
3. Plasmodim ovale, masa inkubasi malaria dengan penyebab plasmodium ovale adalah 12
sampai 17 hari, dengan gejala demam setiap 48 jam, relatif ringan dan sembuh sendiri.
4. Plasmodium malariae, merupakan penyebab malaria quartana yang memberikan gejala
demam setiap 72 jam. Malaria jenis ini umumnya terdapat pada daerah gunung, dataran
rendah pada daerah tropik, biasanya berlangsung tanpa gejala, dan ditemukan secara tidak
sengaja. Namun malaria jenis ini sering mengalami kekambuhan (Achmadi, 2010).

Etiologi

- 10 -
 Malaria disebabkan oleh protozoa dari genus plasmodium. Pada manusia plasmodium
terdiri dari 4 spesies, yaitu plasmodium falciparum, plasmodium vivax, plasmodium malariae,
dan plasmodium ovale. Akan tetapi jenis spesies plasmodium falciparum merupakan
penyebab infeksi berat bahkan dapat menimbulkan kematian (Harijanto, dkk 2010).

Gejala Malaria

Malaria adalah penyakit dengan gejala demam, yang terjadi tujuh hari sampai dua
minggu sesudah gigitan nyamuk yang infektif. Adapun gejala-gejala awal adalah demam,
sakit kepala, menggigil dan muntah-muntah (Soedarto, 2011).

Menurut Harijanto, dkk (2010) gejala klasik malaria yang umum terdiri dari tiga
stadium (trias malaria) yaitu:

1. Periode dingin. Mulai menggigil, kulit dingin, dan kering, penderita sering membungkus
diri dengan selimut atau sarung dan saat menggigil seluruh tubuh sering bergetar dan
gigi-gigi saling terantuk, pucat sampai sianosis seperti orang kedinginan. Periode ini
berlangsung 15 menit sampai 1 jam diikuti dengan peningkatan temperatur.
2. Periode panas. Penderita berwajah merah, kulit panas dan kering, nadi cepat dan panas
badan tetap tinggi dapat mencapai 400C atau lebih, respirasi meningkat, nyeri kepala,
terkadang muntah-muntah, dan syok. Periode ini lebih lama dari fase dingin, dapat
sampai dua jam atau lebih diikuti dengan keadaan berkeringat.
3. Periode berkeringat. Mulai dari temporal, diikuti seluruh tubuh, sampai basah, temperatur
turun, lelah, dan sering tertidur. Bila penderita bangun akan merasa sehat dan dapat
melaksanakan pekerjaan seperti biasa.

Menurut Anies (2006) malaria komplikasi gejalanya sama seperti gejala malaria ringan,
akan tetapi disertai dengan salah satu gejala dibawah ini:

Gangguan kesadaran (lebih dari 30 menit).

Kejang.
Panas tinggi disertai diikuti gangguan kesadaran.
Mata kuning dan tubuh kuning.
Pendarahan dihidung, gusi atau saluran pencernaan.
Jumlah kencing kurang (oliguri).

- 11 -
 Warna air kencing (urine) seperti air teh.
Kelemahan umum.
Nafas pendek.

Klasifikasi Nyamuk Anopheles

Malaria adalah penyakit infeksi yang ditularkan melalui gigitan nyamuk

Anopheles, adapun klasifikasi nyamuk Anopheles spp secara umum sebagai berikut;

Kingdom : Animalia
Phylum : Arthropoda
Class : Insecta
Order : Diptera
Superfamily : Culicoidea
Family : Culicidae
Subfamily : Anophelinae
Genus : Anopheles

- 12 -
 Daftar Pustaka

1. Moody A: Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clin Microbiol Rev. 2002,
15: 66-78.Bruce-Chwatt, L. J. (1958) Trans. roy. Soc. trop. Med. Hyg., 52, 389
2. Muirhead-Thomson, R. C. (1954) Trans. roy. Soc. trop. Med. Hyg., 48, 208
3. Worth, R. M. (1964) Amer. J. Hyg., 80, 70
4. Bejon P, Andrews L, Hunt C A, Sanderson F, Gilbert S C and Hill A. Thick blood
film examination for Plasmodium falciparum malaria has reduced sensitivity and
underestimates parasite density
5. Trape JF: Rapid evaluation of malaria parasite density and standardization of
thick smear examination for epidemiological investigations. Trans R Soc Trop
Med Hyg. 1985, 79: 181-184.

- 13 -
14