VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KLORFENIRAMINA MALEAT DAN

FENILPROPANOLAMINA DALAM SEDIAAN TABLET PARATUSIN SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Nama alat :
Neraca Analitik Mettler Dragon 204 atau Sartorius CPA26P HPLC Shimadzu LC 2010A
Kolom HPLC Shim-pack CLC-CN(M) - 5m
Vial dan tutup sampel HPLC Ukuran yang sesuai
Labu ukur Gelas Grade A, 50 mL, 100 mL
Pipet Gelas Grade A 5,0 mL
Filter 0,45 m Milipore

Bahan yang digunakan:

Pereaksi Spesifikasi KH2PO4 Merck (Cat.# 104873)
Metanol HPLC JT Baker (Cat. # 9093-68)
Asam asetat glacial JT Baker (Cat. # 9058-69)
Trietilamina Merck (Cat.# 808352)
Asetonitril HPLC JT Baker (Cat. # 9017-69)
Air untuk produk injeksi (air suling)
Klorfeniramina Maleat Kadar 98,92% (standar pembanding)
Fenilpropanolamina Kadar 99,11% (standar pembanding)

Pembuatan larutan dapar

Dilarutkan 0,78 gram Kalium dihidrogen fosfat dalam 900 mL aquadest, lalu ditambahkan 10
mL trietilamina dan tambah asam asetat glasial hingga mencapai pH 5,3, kemudian dicampur
dengan aquadest sampai volume 1000 mL (larutan A). Dicampurkan larutan A dan metanol
dengan perbandingan 2 : 1.

Pembuatan pelarut
Dicampurkan larutan dapar dan asetonitril dengan perbandingan 30 : 70.
Pembuatan fase gerak
Dicampurkan pelarut dan aquadest dengan perbandingan 75 : 25 kemudian disaring
menggunakan filter 0,45 m.

Pembuatan larutan standar

Dilarutkan dalam pelarut standar pembanding CTM sebanyak 10 mg dalam labu ukur 50 mL,
cukupkan volume hingga tanda batas. Pipet 5 mL larutan ke dalam labu ukur 100 mL,
tambahkan 7,5 mg standar pembanding PPA dan dilarutkan dengan pelarut hingga tanda batas
(konsentrasi CTM = 0,01 mg/ml, PPA = 0,075 mg/ml). Disaring dengan filter 0,45 m dan
dimasukkan ke dalam vial HPLC kemudian ditutup.
Preparasi sampel
Ditimbang dan gerus halus sampel sebanyak 20 tablet. Hitung bobot rata-rata per tablet.
Ditimbang sejumlah serbuk tablet yang setara dengan bobot setengah tablet ( 330 mg) ke dalam
labu ukur 100 mL, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas. Untuk
mempercepat kelarutan, dilakukan ultrasonik selama 30 menit. Disaring dengan filter 0,45 m
dan dimasukkan ke dalam vial HPLC kemudian ditutup.

Kondisi pengukuran
Sebelum dilakukan analisis untuk validasi ini harus dipastikan bahwa alat yang digunakan masih
berstatus terkalibrasi. Standar, pereaksi, bahan untuk plasebo memenuhi spesifikasi dan belum
kadaluarsa.
Parameter uji metode validasi yang dilakukan meliputi uji kesesuaian sistem, spesifitas,
linieritas, presisi, akurasi dan rentang.

Uji kesesuaian sistem

Diinjeksikan larutan standar CTM dan PPA ke dalam sistem kromatografi sebanyak 6 kali.
Dihitung asimetri terhadap CTM dan PPA, simpangan baku relatif (%RSD) terhadap waktu
retensi dan simpangan baku relatif (%RSD) terhadap area.

Spesifitas
Disiapkan larutan sampel dari serbuk plasebo yang terbuat dari campuran sintesis material
pendukung produk. Spesifitas ditentukan dengan membandingkan peak larutan sampel, larutan
plasebo, fase gerak, solven danlarutan standar pembanding. Diinjeksikan pelarut, fase gerak,
larutan sampel, larutan plasebo dan larutan standar pembanding ke dalam sistem kromatografi.

Linieritas
Dibuat sederet larutan standar dengan 5 kadar berbeda pada rentang 50% hingga 150% (50%,
75%, 100%, 125%, 150%) dengan pembuatan larutan standar konsentrasi 100% yaitu, ditimbang
10 mg standar CTM ke dalam labu ukur 50 ml ditambahkan dengan pelarut hingga tanda batas,
lalu dihomogenkan. Dipipet 5 mL larutan standar CTM dan ditambahkan 7,5 mg standar PPA ke
dalam labu ukur 100 mL ditambahkan dengan pelarut hingga tanda batas, lalu dihomogenkan.
Disaring dengan filter 0,45 m dan dimasukkan ke dalam vial HPLC dan ditutup. Diinjeksikan
ke dalam sistem kromatografi. Ditentukan persamaan regresi linier dan koefisien korelasi (r).
Untuk konsentrasi 50%, CTM ditimbang 5 mg dan PPA ditimbang 3,75 mg.
Untuk konsentrasi 75%, CTM ditimbang 7,5 mg dan PPA ditimbang 5,625 mg.
Untuk kosentrasi 125%, CTM ditimbang 12,5 mg dan PPA ditimbang 9,375 mg.
Untuk konsentrasi 150%, CTM ditimbang 15 mg dan PPA ditimbang 11,25 mg.

Presisi
Ditimbang dan digerus halus sampel sebanyak 20 tablet. Dihitung bobot rata-rata per tablet.
Ditimbang sejumlah serbuk tablet yang setara dengan bobot setengah tablet ( 330 mg) ke dalam
labu ukur 100 mL, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas. Untuk
mempercepat kelarutan, dilakukan ultrasonik selama 30 menit. Disaring dengan filter 0,45 m
dan dimasukkan ke dalam vial HPLC kemudian ditutup. Diinjeksikan ke dalam sistem
kromatografi. Dihitung kadar CTM dan PPA dan ditentukan simpangan baku relatif (%RSD).
Lakukan prosedur di atas sebanyak 6 kali preparasi.
Akurasi
Dibuat larutan sampel pada konsentrasi 80, 100, 120 %. Analisis dikerjakan triplo untuk masing-
masing konsentrasi. Pembuatan larutan sampel dengan konsentrasi 100% caranya yaitu
ditimbang dan digerus halus sampel sebanyak 20 tablet. Dihitung bobot rata-rata per tablet.
Ditimbang sejumlah serbuk tablet yang setara dengan bobot setengah tablet ( 330 mg) ke dalam
labu ukur 100 mL, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas. Untuk
mempercepat kelarutan, dilakukan ultrasonik selama 30 menit. Disaring dengan filter 0,45 m
dan dimasukkan ke dalam vial HPLC kemudian ditutup. Diinjeksikan ke dalam sistem
kromatografi. Dihitung kadar CTM dan PPA serta ditentukan % perolehan kembali sampel yang
diperoleh. Untuk konsentrasi 80% sampel ditimbang 264 mg, sedangkan untuk konsentrasi
120% sampel ditimbang 396 mg.

Rentang
Dibuat larutan sampel pada konsentrasi 80, 100, 120 % dan dikerjakan triplo untuk tiap
konsentrasi. Pembuatan larutan sampel dengan konsentrasi 100% caranya yaitu ditimbang dan
digerus halus sampel sebanyak 20 tablet dan dihitung bobot rata-rata per tablet. Ditimbang
sejumlah serbuk tablet yang setara dengan bobot setengah tablet ( 330 mg) ke dalam labu ukur
100 mL, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas. Untuk mempercepat
kelarutan, dilakukan ultrasonik selama 30 menit. Disaring dengan filter 0,45 m dan dimasukkan
ke dalam vial HPLC kemudian ditutup. Diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi. Dihitung
kadar CTM dan PPA serta ditentukan koefisien korelasi (r) dan simpangan baku relatif (%RSD)
terhadap persen perolehan kembali. Untuk konsentrasi 80% sampel ditimbang 264 mg,
sedangkan untuk konsentrasi 120% sampel ditimbang 396 mg.
Berikut tabel kriteria penerimaan validasi sehingga validasi yang dilakukan dapat dikatakan
memenuhi persyaratan atau tidak.

Tabel 3. Kriteria penerimaan validasi metode penetapan kadar

Parameter validasi Kriteria penerimaan
Uji kesesuaian sistem Asimetri : 0,5 2,0
SBR waktu retensi : < 2%
SBR Area : < 2%
Spesifitas Tidak muncul peak pada material yang lain
Linieritas Koefisien korelasi (r) > 0,998
Presisi SBR 2,0
Akurasi % Perolehan kembali 98 102 %
Rentang (range) SBR 2,0 %
nilai koefisien korelasinya (r) 0,998
Hasil dan Pembahasan
Validasi metode penetapan kadar Klorfeniramina maleat (CTM) dan Fenilpropanolamina
(PPA) dalam sediaan tablet Paratusin secara KCKT menghasilkan data yang memenuhi
persyaratan CPOB. Hal ini dapat diketahui dari data tiap parameter validasi. Hasil yang
diperoleh kemudian dibandingkan dengan persyaratan CPOB sehingga dapat diketahui parameter
tersebut telah sesuai syarat validasi metode atau tidak. Secara lengkap data hasil validasi metode
tersebut dapat dilihat pada data hasil tiap parameter validasi.
Uji kesesuaian sistem
Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk menetapkan keefektifan sistem operasi atau metode
sebelum digunakan. Data hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 4.

Dari hasil uji kesesuaian sistem, asimetri CTM diperoleh 1,275 dan PPA 1,240.
Simpangan baku relatif untuk waktu retensi dan area CTM diperoleh 0,114 dan 0,119 sedangkan
PPA diperoleh 0,062 dan 1,172. Nilai hasil uji tersebut masih memenuhi syarat yang ditetapkan,
sehingga metode ini sesuai untuk digunakan.

Spesifitas
Spesifitas adalah uji untuk mengetahui pengaruh yang diberikan pelarut, fase gerak dan
plasebo (bahan-bahan pengisi dan bahan-bahan tambahan tanpa kandungan bahan aktif) terhadap
pengukuran bahan aktifnya. Data hasil uji spesifitas dapat dilihat pada Tabel 5.

Pada tabel dapat dilihat bahwa pelarut, fase gerak dan larutan plasebo tidak memberikan
pengaruh pada penetapan kadar CTM dan PPA. Pada kromatogram memang menunjukkan
adanya puncak, tetapi puncak tersebut bukan puncak yang spesifik untuk CTM maupun PPA.
Oleh karena itu, dapat dikatakan pelarut, fase gerak dan plasebo tidak memberikan pengaruhv
terhadap penetapan kadar CTM dan PPA dalam sediaan tablet Paratusin.
Linieritas
Uji Linieritas suatu metode analisis bertujuan untuk membuktikan adanya hubungan
linier antara konsentrasi zat sebenarnya (teoritis) dengan respon alat. Dalam hal ini dituntut
ketelitian pada saat preparasi serta kemampuan alat mendeteksi zat yang diukur dengan tepat dan
teliti. Linieritas atau kecenderungan korelasi antara dua variabel biasanya dinyatakan dalam
koefisien korelasi (r). Linieritas yang baik atau adanya korelasi yang erat ditunjukkan dengan
harga koefisien korelasi (r) yang mendekati atau sama dengan nilai satu. Hasil uji linieritas dapat
dillihat pada Tabel 6. dan 7.

Uji linieritas dilakukan dengan membuat larutan dari bahan baku pembanding CTM dan
PPA dengan 5 konsentrasi berbeda pada rentang 50 150%, kemudian dibuat kurva hubungan
antara konsentrasi terhadap area yang diperoleh. Hasil uji linieritas CTM didapatkan persamaan
garis y = 13506029,60x + 3505,50 dan nilai koefisien korelasi sebesar 0,999, sedangkan hasil uji
linieritas PPA didapatkan persamaan garis y = 865859x - 145,6 dan koefisien korelasi sebesar
0,999.
Pada uji linieritas diperoleh nilai koefisien korelasi untuk CTM 0,999 dan PPA 0,999
sehingga metode uji ini telah memenuhi persyaratan uji linieritas yaitu > 0,998. Oleh karena itu,
metode ini pada konsentrasi kerja 50% sampai dengan 150% masih memberikan garis linier.
Nilai tersebut menggambarkan adanya korelasi yang berbanding lurus antara respon deteksi alat
terhadap nilai konsentrasi zat aktif.

Presisi
Presisi merupakan parameter yang digunakan untuk menyatakan bahwa metode uji
tersebut bila dilakukan secara berulang-ulang dalam satu seri pengukuran akan selalu
menghasilkan kadar yang mendekati sama dan atau tidak bergeser. Uji presisi dilakukan dengan
menginjeksikan larutan uji yang telah dipreparasi sebanyak enam kali. Hasil uji presisi dapat
dilihat pada Tabel 8. dan 9.

Hasil uji presisi diperoleh simpangan baku relatif untuk CTM sebesar 1,02 % dan
simpangan baku relatif untuk PPA sebesar 0,56 % dan nilai simpangan baku relatif tersebut
memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan yaitu < 2 %. Berdasarkan data yang dihasilkan pada
uji presisi menunjukkan bahwa metode ini mempunyai presisi yang tinggi.

Akurasi
Akurasi sering dinyatakan perolehan kembali. Parameter akurasi bertujuan untuk
menentukan metode uji yang digunakan dapat memberikan hasil yang sama dengan nilai
sebenarnya atau dengan kata lain konsentrasi yang didapat sama dengan konsentrasi
sebenarnya.Uji akurasi dilakukan dengan membuat larutan dari bahan baku pembanding CTM
dan PPA pada tiga konsentrasi yang berbeda dengan tiga kali pengulangan. Hasil Uji akurasi
dapat dilihat pada Tabel 10. dan 11.

Hasil uji menunjukkan persen perolehan kembali CTM pada 100,87 101,10% dan
persen perolehan kembali PPA pada 101,19 101,43%. Persyaratan uji akurasi adalah 98
102%, oleh karena itu hasil uji akurasi CTM dan PPA memenuhi persyaratan uji akurasi. Metode
ini dikatakan akurat karena menunjukkan kedekatan nilai yang dihasilkan pada penetapan kadar
CTM dan PPA dengan nilai yang sebenarnya.

Rentang
Hasil uji rentang diperoleh dari data uji akurasi yang dilakukan dan dapat dilihat pada Tabel 12
& 13
 Dari tabel di atas, uji rentang diperoleh hasil CTM dan PPA yang sama yaitu simpangan
baku relatif 0,08% dan koefisien korelasi 0,999. Hasil ini menunjukkan uji rentang masih
memenuhi persyaratan yang ditetapkan yaitu simpangan baku relatif < 2,0% dan koefisien
korelasi > 0,998. Nilai ini menunjukkan bahwa penetapan kadar ini bila dilakukan pada rentang
80 120% masih memberikan hasil yang baik.

Kesimpulan
Pada pengujian beberapa parameter validasi yang dilakukan, diperoleh hasil sebagai berikut :
1) Uji kesesuaian sistem diperoleh rata rata asimetri CTM sebesar 1,275 dan PPA sebesar
1,240, simpangan baku relatif untuk waktu retensi dan area CTM sebesar 0,114 dan 0,119,
sedangkan PPA sebesar 0,062 dan 1,172.
2) Uji spesifitas menunjukkan bahwa pelarut, fase gerak dan larutan plasebo tidak memberikan
pengaruh pada metode penetapan ini.
3) Uji linieritas untuk CTM diperoleh persamaan garis y = 13506029,60x + 3505,50 dengan nilai
koefiien korelasi sebesar 0,999, sedangkan untuk PPA diperoleh persamaan garis y = 865859x
145,6 dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0,999.
4) Uji presisi diperoleh simpangan baku relatif CTM sebesar 1,02 % dan simpangan baku relatif
PPA sebesar 0,56%.
5) Uji akurasi menunjukkan % perolehan kembali CTM pada 100,87 101,10 % dan untuk PPA
pada 101,19 101,43 %.
6) Uji rentang untuk CTM dan PPA menunjukkan hasil yang sama yaitu dengan simpangan baku
relatif sebesar 0,08 % dan koefisien korelasi sebesar 0,998.
7) Berdasarkan hasil validasi metode penetapan kadar Klorfeniramina maleat dan
Fenilpropanolamina dalam sediaan tablet Paratusin secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT), dapat disimpulkan bahwa metode ini valid digunakan untuk pemeriksaan rutin di
laboratorium QC PT Prafa.