PERSIAPAN DAN HOMOGENISASI SAMPEL OBAT TRADISIONAL

A. Ruang Lingkup

Persiapan dan homogenisasi sampel meliputi cara persiapan sampel obat

tradisional untuk memperoleh distribusi bakteri secara merata didalam sampel

yang diuji

B. Prinsip

Membebaskan sel-sel bakteri yang masih terlindung oleh partikel sampel dan

untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya

menurun karena kondisi yang kurang menguntungkan didalam proses

pembuatan Obat Tradisional

C. Larutan Pengencer

Fluid Casein Digest Soy Lecithin Polysornat 20 (FCDSLP)

Casein Peptone Lecithin Polysorbat Broth (CPLB) atau Letheen Broth (LB)

Peptone Dilution Fluid (PDF)

D. Persiapan Sampel

1. Penanganan wadah atau Kemasan

Diperlukan alat-alat untuk persiapan seperti gunting, spatula, pinset dan

lain-lain

a. Wadah terbuat dari plastic atau kertas

Bagian wadah yang akan dibuka dibersihkan dengan kapas beralkohol

70%, kemudian dibuka secara aseptic didekat nyala api bunsen

 b. Wadah botol kaca

Sumbat atau tutup botol serta bagian yang akan dibuka dibersihakan

dengan kapas beralkohol 70%, kemudian dibuka dengan aseptic didekat

nyala api Bunsen

2. Homogenisasi sampel

a. Sediaan bentuk serbuk

1) Dengan aseptic ditimbang 10 gram sampel kedalam wadah steril

2) Tambahkan 90 ml PDF, jika sampel kurang dari 10 gram maka

pengambilan sampel disesuaikan sehingga diperoleh suspense

pengenceran 1:10 dikocok hingga homogeny

b. Sediaan Rajangan

1) Dengan cara aseptic sejumlah sampel bentuk rajangan dipotong-

potong menggunakan (pisau atau guntung steril) menjadi kecil-

kecil.

2) Sebagian ditumbuk dalam cawan mortar steril supaya menjadi

partikel halus.

3) Dengan aseptic ditimbang sebanyak 10 gram kedalam wadah steril

4) Tambahkan 90 ml PDF, jika sampel kurang dari 10 gram maka

pengambilan sampel disesuaikan sehingga diperoleh suspense

pengenceran 1:10 dikocok hingga homogeny

c. Sediaan bentuk kapsul

1) Dengan cara aseptic ditimbang 10 gram sampel.

 2) Tambahkan 90 ml LB, jika sampel kurang dari 10 gram maka

pengambilan sampel disesuaikan sehingga diperoleh suspensi

pengenceran 1:10 dikocok hingga homogen

d. Sediaan tablet/pil

1) Dengan cara aseptic ditimbang 10 gram sampel.

2) Tambahkan 90 ml LB, jika sampel kurang dari 10 gram maka

pengambilan sampel disesuaikan sehingga diperoleh suspensi

pengenceran 1:10 dikocok hingga homogeny

e. Sediaan cairan

1) Dengan cara aseptic dipipet 10 ml sampel.

2) Tambahkan 90 ml LB, jika sampel kurang dari 10 ml maka

pengambilan sampel disesuaikan sehingga diperoleh suspensi

pengenceran 1:10 dikocok hingga homogeny

f. Sediaan bentuk Krim dan yang mengandung minyak

1) Dengan cara aseptic ditimbang 10 gram sampel.

2) Tambahkan 1-2 ml tween 80 dan diaduk

3) Tambahkan LB hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10

dikocok hingga homogen

 UJI ANGKA LEMPENG TOTAL DALAM OBAT TRADISIONAL

A. Ruang Lingkup

Metode ini digunakan untuk menetapkan angka bakteri aerob mesofil yang

terdapat dalam sediaan obat tradisional

B. Prinsip

Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan

pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang

sesuai

C. Pereaksi Khusus

1. Media dan Pengencer

Letheen Broth (LB)

Peptone Dilutions Fluid

Plate Count Agar (PCA+ 1% TTC)

2. Pereaksi

Tripenyl Tetrazolium Chloride 0,5 % (TTC)

D. Peralatan Khusus

1. Pipet ukur mulut lebar

2. Alat hitung koloni

E. Prosedur

1. Homogenisasi sampel
 Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/00, atau disesuaikan dengan jenis

sampel yang diuji.

2. Pengenceran

a. Disiapkan 5 tabung reaksi atau lebih masing-masing telah diisi dengan

9 ml PDF (sebagai 10-1)

b. Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 1 ml kedalam tabung yang

berisi 9 ml PDF (sebagai 10-2)

c. Dibuat pengenceran selanjutnya sampai pengenceran 10-6 atau sesuai

yang diperlukan.

d. Dari setiap tabung pengenceran dipipet 1 ml kedalam cawan petri dan

dibuat duplo.

e. Kedalam cawan petri kemudian dituang 15-20 ml media PCA dan

diratakan dengan menggoyang cawan petri.

f. Untuk kontrol satu cawan petri diisi pengencer 1 ml dan media PCA

g. Setelah media memadat diinkubasi pada suhu 35-370C Selama 24-48

jam dengan posisi dibalik.

h. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung

3. Perhitungan

++
Angka Lempeng Total : X Faktor Pengenceran
3

UJI ANGKA KAPANG/KHAMIR DALAM OBAT TRADISIONAL

A. RUANG LINGKUP

Merode ini digunakan untuk menetapkan angka kapang/khaamir dalam obat

tradisional

B. PRINSIP

Pertumbuhan kapang / khamir setelah cuplikan diinokulasi pada media lempeng

yang sesuai dengan cara semai dan diinkubasi pada suhu 20-250C

C. PEREAKSI KHUSUS

Potato Dextrose Agar (PDA) + Kloramfenikol

Peptone Dilution Fluid (PDF)

D. PROSEDUR

1. Homogenisasi sampel

Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/00, atau disesuaikan dengan jenis

sampel yang diuji.

2. Pengenceran

a. Disiapkan 3 buah tabung yang masing-masing telah diisi 9 ml PDF

b. Dari hasil homogenisasi sampel, dipipet 1ml ke dalam tabung PDF pertama,

dikocok hingga homogen sehingga diperoleh pengenceran 10-1

c. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-4

3. Inokulasi dan Inkubasi

a. Dari masing-masing pengenceran dipipet 0,5 ml ke permukaan lempeng

media PDA, masing-masing dibuat duplo, segera diratakan

b. Untuk mengetahui sterilitasnya dibuat blanko pada satu lempeng PDA

ditetesi 0.5 ml pengencer dan diratakan

c. Seluruh lempeng diInkubasi selama 5-7 hari pada suhu 20-15 0C, dengan

posisi tidak dibalik. Pengamatan dan perhitungan koloni dimulai dari hari

ke-2. Koloni Khamir memiliki bentuk bulat kecil berwarna putih

menyerupai bakteri.

d. Perhitungan

++
X Faktor Pengenceran
3
UJI Escherichia coli DALAM OBAT TRADISIONAL
A. Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan adanya Escherichia coli dalam
sediaan obat tradisional.
B. Prinsip
Pertumbuhan E. coli pada media selektif yang sesuai, dilanjutkan dengan
konfirmasi uji biokimia, yang menghasilkan senyawa indol dan tidak dapat
menggunakan sitrat sebagai sumber energy.
C. Pereaksi Khusus
1. Media
a. Letheen Broth (LB)
b. Tryptic Soy Broth (TSB)
c. Eosin Methylene Blue (EMB) Agar
d. Tryptone Broth (TB)
e. MR VP Medium
f. Simmons Citrate Agar (SCA)
g. Nutrient gar (NA) atau Tryptic Soy Agar (TSA)
2. Pereaksi
a. Pereaksi Indol (Kovac)
b. Larutan Merah Metil
c. Larutan Alfa Naftol
d. Larutan KOH 40%
D. Prosedur
1. Homogenisasi Sampel
Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/06, disesuaikan sengan jenis
sampel yang diuji.
2. Pengkayaan
Dengan cara aseptic dipipet 10 mL suspense hasil homogenisasi sampel
kemudian diinokulaiskan pada 90 mL TSB, diinkubasi pada suhu 35-37oC
selama 18-24 jam.
3. Isolasi
Dari biakan pengkayaan diinokulasikan 1 sengkelit pada permukaan EMB
dan/atau Endo Agar, diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam,
dengan posisi lempeng dibalik. Diamati koloni spesifik yang tumbuh
dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm, warna hijau dengan kilap
logam dan bintik biru kehijauan di tengahnya, dan pada Endo Agar
dengan ciri-ciri koloni bulat, diameter 2-3 mm, waarna merah keunguan
dengan kilap logam.
4. Identifikasi dan Konfirmasi
 Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada EMB dan/atau Endo Agar
diinokulasi pada NA atau TSA miring, kemudian diinkubasi pada suhu
35-37oC selama 18-24 jam. Dari NA dan TSA miring dilanjutkan dengan
uji IMViC sebagai berikut :
a. Uji Indol
Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada media
Trptone Broth dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam.
Ke dalam biakan ditambahkan 1 mL pereaksi indol (Kovac) dikocok
dan didiamkan beberapa menit. Warna merah cherry yang berbentuk
cincin pada permukaan biakan menunjukkan reaksi indol positif.
b. Uji Merah Metil
Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulaiskan pada media
MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam. Setelah
diinkubasi tambahkan 5 tetes larutan Merah Metil dikocok homogeny
dan didiamkan beberpa menit, bila biakan menjadi merah
menunjukkan hasil uji positif.
c. Uji Voges Proskauer
Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada media
MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam.
Setelah diinkubasi ditambahkan 3 tetes larutan alfa naftol dan 2 tetes
larutan KOH 40%, dikocok kemudian didiamkan selama beberapa
menit. Jika warna biakan menjadi merah muda hingga merah menyala
menunjukkan reaksi positif.
d. Uji Sitrat
Satu sengkelit biakan NA dan TSA miring diinokulasi kan pada
Simmons Citrate Agar dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-
48 jam. Jika terjadi perubahan warna biakan menunjukkan hasil uji
positif.
E. Pernyataan Hasil
Escherichia coli dinyatakan positif jika hasil uji IMViC sebagai berikut:
Indol : positif (+)
Merah- Metil : positif (+)
VP : negative (-)
Sitrat : negative (-)
UJI Salmonella DALAM OBAT TRADISIONAL 98/MIK/06
a. Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan adanya almonella dalam sediaan
obat tradisional.
b. Prinsip
Ada empat tahap untuk mendeteksi adanya
c. Pereaksi Khusus
1. Media dan pengencer
2. Pereaksi
3. Mikroba baku
d. Peralatan Khusus
e. Prosedur
1. Homogenisasi Sampel
2. Pra-Pengkayaan Non Selektif
3. Pengkayaan Selektif
4. Inokulasi dan Identifikasi
5. Konfirmasi
f. Konfirmasi
1. TSIA
2. Uji Urease
3. Uji Dekarboksilasi Lysin
4. Uji Voges Prokauer
5. Uji Indol
6. Uji b-Galaktosidase
g. Interpretasi Hasil
h. Pernyataan Hasil