Tujuan dari pengukuran analitis adalah memperoleh data

yang konsisten, dapat dipercaya, dan akurat.

Pengukuran yang tidak tepat dapat menyebabkan

biaya menjadi besar (perlu pengulangan)

Sama pentingnya juga agar pengerjaannya mengikuti

regulasi dan terakreditasi

U.S. FDA, EMEA, EPA, AOAC, ISO, KAN

2
 Kurang terdokumentasinya prosedur maupun hasil validasi

Tahapan pencuplikan dan persiapan contoh berkontribusi terhadap galat

keseluruhan

Aksesoris dan material yang digunakan untuk kualifikasi alat yang tidak

memenuhi syarat

Kurangnya peranti lunak validasi dan sistem komputer untuk validasi

Kualifikasi dan validasi hanya dilakukan saat waktu tertentu saja

Adaptasi terhadap kriteria penerimaan untuk sistem kualifikasi yang

baru
3
 Pencuplikan Contoh

Preparasi Contoh

Analisis

Pelaporan Evaluasi Data

4
Nilai tambah dan biaya VS validasi lengkap
5
Kesesuaian instrumen

Status kualifikasi dan kalibrasi

Kesesuaian material

Status standar pembanding (Reference Standards), reagen,

placebo lots

Kesesuaian analis

Status pelatihan dan rekam kualifikasi

Kesesuain dokumentasiSuitability of Documentation

Menulis prosedur analitis dan protokol yang tepat dengan

kriteria penerimaan yang sudah mapan 6
 Menetapkan aplikasi, tujuan, dan lingkup dari

metode

Analat? konsentrasi? Matriks sampel?

Mengembangkan metode analitis

Mengembangkan protokol validasi

Kualifikasi instrumen

Operator yang memenuhi syarat/terlatih

7
Kualifikasi material

Melakukan percobaan pre-validasi

Menyesuaikan parameter metode sesuai kriteria yang

diterima jika diperlukan

Melakukan percobaan validasi penuh

Mengembangkan prosedur operasi standar dalam

memakai metode untuk analisis rutin

Mendokumentasikan percobaan validasi dan hasilnya

dalam laporan validasi

8
 Kesesuaian Sistem

Validasi

Kalibrasi
Pompa Injektor
Detektor Sistem Data

Analis Metode

Sampel
9
 Metode Compendial vs. Non-compendial

Verifikasi metode Compendial

Prosedur analitik yang telah diregulasi seperti dalam USP/NF

Validasi metode Non-compendial

Prosedur analitik alternatif yang diusulkan oleh pemakai

untuk digunakan selain dari prosedur analitik yang telah

diregulasi 10
 US FDA 21 CFR (Code of Federal Regulations) Bagian 210 dan 211

Part 210: cGMP untuk Manufacturing, Processing, Packaging, atau Holding of

Drugs; Umum

Part 211: cGMP untuk Manufacturing Practice for Finished Pharmaceuticals

Pedoman ICH
Q2A, Text on Validation of Analytical procedures
(Maret 1995)
Q2B, Validation of Analytical Procedures: Methodology (Mei 1997)
USP Bab <1225>
Validasi metode compendial
11
 Akurasi, sentivitas, spesifitas, dan ketertiruan suatu metode uji

yang digunakan oleh suatu firma harus mapan dan

terdokumentasi. Validasi dan dokumentasi tersebut dapat

diselesaikan sesuai dengan 211.194(a)(2).

21 CFR PART 211 - CURRENT GOOD

MANUFACTURING PRACTICE FOR
FINISHED PHARMACEUTICALS
Subpart I-Laboratory Controls
211.165 Testing and release for
distribution (e)

12
Validasi metode yaitu memapankan, lewat bukti dokumen,

jaminan yang tinggi bahwa suatu metode analitik akan

menghasilkan hasil analisis yang konsisten yang menggambarkan

secara tepat karakteristik kualitas produk yang diuji

21 CFR PART 210 - CURRENT GOOD

MANUFACTURING PRACTICE IN MANUFACTURING,
PROCESSING, PACKING, OR HOLDING OF DRUGS
210.3 Definitions (b) (25)

13
 Tujuan validasi suatu prosedur analitik yaitu untuk

membuktikan bahwa prosedur tersebut sesuai untuk

tujuan yang diimaksudkan

ICH Guideline for

Industry Q2A

14
Dalam praktiknya, biasanya dimungkinkan untuk

mendesain percobaan sedemikian rupa sehingga

karakteristik validasi yang tepat dapat dipertimbangkan

serentak agar berbunyi, pengetahuan menyeluruh pada

kapabilitas prosedur analitik, contohnya: Spesifitas,

linearitas, kisaran, akurasi, dan presisi

ICH Guideline for Industry

Q2B

15
Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan

pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan

tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi

SNI 19 - 17025 -2000

16
 Presisi

Spesifitas keterulangan

Linearitas Presisi intermediat

Limit deteksi
Kisaran
Limit kuantitasi
Akurasi Robustness

17
 Parameter Asai Kategori 2
Asai Kategori 1 Asai kategori 3
kinerja analitik Kuantitatif Uji Batas

Akurasi Ya Ya * *
Precsisi Ya Ya Tidak Ya
Spesifitas Ya Ya Ya *
LD Tidak Tidak Ya *

LK Tidak Ya Tidak *

Linearitas Ya Ya Tidak *

Kisaran Ya Ya * *

Ruggedness Ya Ya Ya Ya
* Mungkin diperlukan, bergantung pada kodrat uji spesifiknya
Kategori 1: Kuantitasi komponen mayor atau zat aktif
Kategori 2: Penentuan impurities atau produk degradasi
Kategori 3: Penentuan karakteristik kinerja
18
 Uji ketakmurnian (Impurity
Tipe Prosedur testing)
Identifikasi Asai
Analitik
Kuantitatif Uji Batas

Akurasi Tidak Ya Tidak Ya

Presisi Tidak Ya Tidak Ya
Keterulangan Tidak Ya Tidak Ya

Presisi Interm. Tidak Ya Tidak Ya

Spesifitas Ya Ya Ya Ya

LD Tidak Tidak Ya Tidak

LK Tidak Ya Tidak Tidak

Linearitas Tidak Ya Tidak Ya

Kisaran Tidak Ya Tidak Ya

19
 Kemampuan suatu
metode analitik
untuk mengukur
analat tanpa
adanya gangguan
Selektivitas
dari komponen Bias
lainnya

20
 Investigasi spesifitas harus dilakukan saat validasi
untuk uji identifikasi, asai ketakmurnian, dan asai
potensi
Prosedur yang digunakan akan bergantung pada
sasaran yang dimaksud oleh prosedur analitik
Jika metode yang digunakan tidak dapat
membedakan maka dua atau lebih prosedur
direkomendasikan untuk digunakan

21
 Harus dapat membedakan antara komponen yang
berdekatan secara struktur
Konfirmasi: Hasil negatif untuk sampel yang
ditambahkan komponen yang secara struktur
berdekatan dengan analat dan hasil positif untuk
sampel yang ditambahkan analat
Pemilihan zat pengganggu yang potensial harus
didasarkan pada pertimbangan keilmuan yang
pantas
22
 Metode kromatografi
Menunjukkan resolusi
Impurities/Degradants tersedia
Membubuhkan/menambahkan dengan impurities/degradants
Memperlihatkan resolusi dan ketiadaan pengganggu
Impurities/Degradants tidak tersedia
Stress Samples
For assay, Stressed and Unstressed Samples should be
compared.
For impurity test, impurity profiles should be compared.
23
Pure and Impure HPLC peaks

Uji Peak purity dapat juga dievaluasi dengan

spektrum dari detektor PDA
spektrometri massa 24
 Plasebo
Drug Substance Degradants
Drug Product Degradants
Related Substances
Packaging Extractables

25
 Temperatur tinggi (50 to 60 oC)
Panas
Kelembaban (70 to 80%)
Kelembaban
Hidrolisis Asam (0.1 N)
Hidrolisis Asam Hidrolisis Basa (0.1 N)
Hidrolisis Basa Oksidasi peroksida (3 to 30%)

Oksidasi Pencahayaan kuat UV/Sinar

tampak
Cahaya
Dimaksudkan untuk menghasilkan degradasi 10 to 30 %
26
 DEG DEG DEG DEG
Kondisi Bahan aktif
#1 #2 #3 #4

HCl 2 N 0 0 17.23 4.71 95.17%

NaOH 0.1 N 0 0 0 0 100%

H2O2
1.12 1.41 1.65 1.2 99.98%
30%

UV/Vis 0 0 4.68 0 94.67%

27
 Kemampuan suatu
asai mendapatkan
respon langsung dan
proporsional dengan
adanya perubahan
konsentrasi analat

28
 Pemeriksaan visual plot sinyal vs. [analat]
Menggunakan metode statistika yang tepat
Regresi linear (y = mx + b)

Koefisien korelasi, intersep-y (b), kemiringan (m),

jumlah kuadrat residual (residual sum of squares)

Memerlukan sedikitnya 5 level konsentrasi

29
 R2 = 0.999

Kemiringan/Slope = 0.97

Intersep-y = 0.233

Persamaan garis: Y = 0.97X + 0.233

Std. Error = 1.319

Std. Deviasi kemiringan = 0.0079

30
 Interval antara
konsentrasi atas dan
bawah suatu analat
dalam sampel yang
menunjukkan tingkat
kesesuaian presisi,
akurasi, dan linearitas
31
 Normalnya diturunkan dari studi linearitas
Membuktikan dengan konfirmasi metode
menghasilkan tingkat berterima pada linearitas,
akurasi, dan presisi
Kisaran spesifik bergantung pada tujuan aplikasi
dari prosedur

32
 Drug Substance & Drug product Assay
Konsentrasi uji 80 to 120% o
Uji keseragaman kandungan (Content Uniformity Assay)
Konsentrasi uji 70 to 130%
Metode uji disolusi (Dissolution Test Method)
+/- 20% kisaran spesifik
Impurity Assays
From Reporting Level to 120% of Impurity Specification for Impurity
Assays
From Reporting Level to 120% of Assay Specification for
Impurity/Assay Methods

33
 Kedekatan hasil analisis yang
diperoleh menggunakan
suatu metode dengan nilai
sebenarnya

34
 Ditentukan pada kisaran yang telah ditetapkan dari suatu
prosedur analitik
Dilakukan dengan jumlah konsentrasi minimum 3 tingkat dan
tiap tingkat dilakukan tiga ulangan (total 9 pengukuran)
Dilaporkan sebagai:

Persen perolehan kembali dari jumlah ditambahkan yang

diketahui (reference material) atau

Perbedaan rerata hasil dari metode yang digunakan dan nilai

yang diterima
35
 % perolehan % perolehan
Jumlah kembali kembali
Jumlah yang %
yang 99.2 98.9
ditambahkan perolehan
diperoleh
(mg) kembali
(mg) 99.3 99.3
0.0 0.0 --- 99.4 99.7
50.2 50.4 100.5 Rerata 99.3 99.3
79.6 80.1 100.6 SD 0.1 0.4
99.9 100.7 100.8
SK 95% 99.30.25 99.30.99

36
 Rerata % perolehan
Analat (%) Rasio Analat Unit
kembali
100 1 100 % 98-102
10 10-1 10 % 98-102
1 10-2 1% 97-103
0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
37
 Ball Ball Strike Strike
Ball Strike
Ball Ball Ball StrikeStrike
Kedekatan hasil beberapa Ball Ball Strike

pengukuran dari beberapa

pengambilan contoh pada sampel

yang homogen

Investigasi harus menggunakan

sampel homogen dan autentik

38
 Keterulangan

Presisi Intermediat

Ketertiruan

39
 presisi yang Dilakukan dengan
dihasilkan pada mengukur minimum 9
kondisi pengukuran
pengoperasian yang (3 konsentrasi
sama pada waktu masing-masing 3
yang pendek ulangan) atau
Disebut juga sebagai Minimum 6 kali
Intra-assay precision pengukuran pada level
100% analat
40
Diungkapkan sebagai variasi Bergantung pada keadaan

laboratorium dimana prosedur

Diungkapkan dengan istilah standar digunakan untuk maksud

deviasi, standar deviasi relatif tertentu

(koefisien variasi), dan selang Studi harus termasuk

kepercayaan variasi hari, analis,

Diketahui sebagai bagian dari peralatan, dsb

Ruggedness pada USP

41
 Hari 1 Hari 2
100.6 99.5
100.8 99.9
100.1 98.9
100.3 99.2
100.5 99.7
100.4 99.6
rerata = 100.5 rerata = 99.5
SBR = 0.24% SBR = 0.36%
SK = 100.5 0.24 SK = 99.5 0.36
Grand
rerata = 100.0
SBR = 0.59%
42
 Definisi: kemampuan meniru data dalam
presisi yang telah ditetapkan
Pengukuran: SB, SBR dan selang kepercayaan
uji keterulangan pada dua lab yang berbeda

43
 Lab 1 Lab 2 Lab 3

Hari1 Hari 2 Hari 1 Hari 2 Hari 1 Hari 2

Analis Analis Analis Analis Analis Analis

1 2 1 2 1 2

3 Prep 3 Prep 3 Prep 3 Prep 3 Prep 3 Prep

44
 % Analat Rasio Analat Unit RSD (%)

100 1 100 % 1.3

10 10-1 10 % 2.7
1 10-2 1% 2.8
0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.3
0.0001 10-6 1 ppm 11
0.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 21
0.0000001 10-9 1 ppb 30

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

45
 Batas Kuantitasi (BK)

Jumlah terkecil analat dalam Jumlah terkecil analat dalam

sampel yang masih dapat sampel yang dapat

dideteksi tapi tidak untuk dikuantifikasi akurasi dan

kuantitasi presisi yang baik

Estimasi dengan nisbah Estimasi dengan nisbah isyarat

isyarat derau 3:1. derau 10:1.

46
 Estimasi Batas Deteksi (BD) & Batas
Kuantitasi (BK)

1. Evaluasi visual
- Digunakan untuk metode non-instrumental
2. Rasio isyarat terhadap derau (S/N)
- 3:1 untuk BD
- 10:1 untuk BK
3. Standar deviasi respon dan kemiringan

47
Based on Signal-to Noise-Ratio

48
 3.3s 10s
BD = BK =
S S

S = kemiringan kurva kalibrasi

s = standar deviasi pembacaan blangko atau standar
deviasi persamaan garis
Diabsahkan (Validated ) dengan menguji sampel pada
BD dan BK
49
 Robustness

Definisi: kapasitas suatu metode untuk tidak

dipengaruhi oleh variasi kecil yang disengaja
Penentuan: membandingkan hasil dibawah kondisi
berbeda dengan presisi dibawah kondisi normal
Variasinya seperti: stabilitas larutan, variasi pH pada
fase gerak, kolom yang berbeda (dari pabrikan yang
berbeda), suhu, laju alir.

50
 Keterulangan ? Ketertiruan

Ruggedness
Presisi
Intermediat
Robustness

51
 Presisi Instrumen - Injeksi 10 Std

Keterulangan - Satu kali analisis (6 prep)

Presisi intermediat - Dua kali analisis
Ketertiruan - Dua Lab
Ruggedness - Banyak variabel
Robustness - Perubahan disengaja

52
 Robustness Variations

Semua pengujian - Manipulasi preparasi sampel

- Waktu ekstraksi
HPLC - Komposisi fase gerak
- Kolom yang berbeda
- Suhu
- Laju alir
GC - Kolom yang berbeda
- Suhu
- Laju alir

53
MeOH/ Waktu Waktu
Resolusi
Air Retensi 1 Retensi 2

75:25 11.94 16.41 7.39

80:20 8.47 11.17 6.17

85:15 7.81 10.18 5.93

54
 ICH
Definisi: evaluasi peralatan,
elektronik, pengoperasian
analitis dan sampel secara
keseluruhan
Pengukuran: repeatability,
tailing factor (T), capacity
factor (k), resolution (R), and
theoretical Plates (N)
USP 23 <621>
Syarat Kesesuain Sistem
Parameters Recommendations
K In general k 2.0
R > 2, between the peak of
interest and the closest
R potential interferent
(degradant, internal STD,
impurity, excipient, etc..)
T T2
N In general N > 2000
Repeatability RSD 2.0% (n 5)
55
Evaluasi kinerja analitik suatu teknik analisis
dengan melakukan perhitungan nilai beberapa
parameter kinerja analitik untuk validasi metode
yaitu: linearitas, akurasi, presisi, limit deteksi,
dan limit kuantitasi dari hasil analisis total
flavonoid dengan metode AlCl3 secara
spektrofotometri sinar tampak dengan hasil:

56
Data kurva kalibrasi
Konsentrasi Ulangan
Standar 1 2 3 4 5 6
(g/ml) Absorbans
10 0.262 0.259 0.255 0.261 0.258 0.261
20 0.427 0.426 0.428 0.421 0.423 0.424
30 0.581 0.577 0.584 0.591 0.592 0.579
40 0.744 0.752 0.741 0.752 0.755 0.751
50 0.892 0.884 0.899 0.891 0.889 0.893
60 1.048 1.045 1.047 1.047 1.051 1.045
70 1.198 1.189 1.201 1.203 1.195 1.188
80 1.356 1.353 1.349 1.357 1.361 1.354

57
Hasil Pengukuran kadar flavonoid total dalam meniran
Ulangan Kadar (% b/b)
1 1,11
2 1,14
3 1,23
4 1,28
5 1,18
6 1,08
7 1,15
8 1,21
9 1,23

58
Hasil uji akurasi
Ulangan [flavonoid total] awal [flavonoid total] spiked [flavonoid total] hasil
(g/ml) (g/ml) pengukuran (g/ml)
1 10 20,5 20,6
2 10 20,5 20,3
3 10 20,5 19,9
1 10 25,7 25,8
2 10 25,7 25,5
3 10 25,7 26,1
1 10 30,4 30,5
2 10 30,4 30,2
3 10 30,4 31,0

59