Teknik Dasar insertsi gen target ke Plasmid

Langkah produksi plasmid

Dikenal ada 4 vektor yang dapat digunakan untuk memperbanyak/clone fragment DNA
dalam E coli:
1. Plasmid
2. Bacteriophage l
3. Cosmid
4. Bacteriophage M13 Plasmid

Kali ini difokuskan untuk teknik yang diaplikasikan pada plasmid

o Unsur atau elemen genetik autokromosom/nonkromosomal yang ditemukan di bakteri

dan yeast/ragi
o Berupa molekul rantai ganda DNA antara 1kb sd > dari 200kb

1. Isolasi DNA target (Isolation of plasma DNa & DNA containing gene of interest)
Ekstraksi dan isolasi DNA terlebih dahulu untuk mendapatkan target gen yang
diinginkan
2. Menginsertsi/menempelkan gen target ke plasmid (Gene inserted into plasmid )
Untuk proses ini diperlukan restriction & ligase enzymes (cut and paste/potong dan
tempelkan) ini dinamakan recombinant DNA plasmid
3. Menginduksi rekombinan plasmid ke sel bakteri dinamakan proses transformasi.
Melalui metode pemanasan/heat shock, bakteri dibut sedemikian rupa sehingga
permeable untuk menerima rekombinan plasmid tersebut. Kultur bakteri tersebut di
plate agar yang mengandung Antibiotik. Mengapa? Ini dikrenakan plasmid
rekombinan mengandung gen gen target dan juga gen yng resisten terhadap
antibiotik, dengan kata lain, bakteri yang survive dapat tumbuh di antibiotik agar
plate adalah bakteri yng sudah tertransformasi.
4. Sel bakteri yang sudah terpilih koloninya diperbanyak secara kulturisasi. Dalam
proses ini akan terjadi translasi memperbanyak gen protein sequence yang
diinginkan
5. Isolasi kembali protein target yang diinginkan melalui proses isolasi kembali dan
purifikasi
6. Konfirmasi kembali dengan PCR apakah memang protein target tersebut berhasil
diproduksi
(Source: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22002/)

Daftar pustaka
1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21407/
2. https://quizlet.com/5199837/steps-of-recombinant-dna-technology-flash-cards/
3. https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning
4. Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook. 1982. Molecular Cloning: A laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory-CSH. X+545pp.
5. Keller, NP & Jin Woo Bok. 2012. Fast and easy method for construction of plasmid
vectors using modified Quick-change mutagenesis. Methods Mol Biol. 944: 163174.
(Source: Keller, NP & Jin Woo Bok. 2012. Fast and easy method for construction of plasmid
vectors using modified Quick-change mutagenesis. Methods Mol Biol. 944: 163174.)

Daftar Pustaka

1. Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook. 1982. Molecular Cloning: A laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory-CSH. X+545pp.
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22002/
3. https://www.dnalc.org/view/15476-Mechanism-of-Recombination-3D-animation-
with-with-basic-narration.html