DISKUSI

Deteksi dini terhadap infeksi dermatofit pada kuku jelas merupakan perbaikan
besar dalam diagnosis tinea un-guium, sehingga pengobatan antijamur harus
segera dilakukan pada diagnosis yang benar dan pada saat bersamaan terbatas
pada infeksi dermatofit. Meskipun distribusi spesies bervariasi di antara
berbagai wilayah di dunia, T. rubrum ada di sebagian besar survei yang
dilaporkan merupakan patogen utama di tinea un-guium, yang mencakup 63 sampai
89% infeksi (1a, 9, 10, 19 , 23, 27). Pada saat yang sama, dermatofit
termasuk genom yang kurang terbinafin-gen Microsporum dilaporkan secara bulat
menjadi agen onikomikosis yang sangat jarang, dan deteksi DNA dermatofit pada
spesimen kuku akan menyebabkan infeksi pada terbitan dengan terbinafine der-
matophyte. dalam sebagian besar kasus dan dengan demikian memberikan
informasi yang memadai untuk membimbing klinisi meskipun tidak memiliki
identifikasi spesies.

Evaluasi klinis deteksi PCR tunggal dan multipleks pada dermatofit dan T.
rubrum tertentu pada spesimen kuku menunjukkan peningkatan sensitivitas
dibandingkan dengan diagnosis konvensional (Tabel 3). Dalam perbandingan ini,
sampel positif dengan mikroskopi namun negatif oleh kultur dianggap seefisien
matematis dengan diagnostik tradisional, walaupun kita bisa-tidak
mengesampingkan kemungkinan bahwa beberapa dari kasus ini dapat menyebabkan
infeksi Nondermatophyte. Namun, tidak biasa untuk mendapatkan hasil kultur
negatif dari pasien dengan dermatofitosis, karena kesulitan yang terkait
dengan pengambilan sampel (bahan yang tidak mencukupi atau penggunaan kliping
kuku bukan materi subun-gual) atau perawatan medis sebelumnya, dan lain-lain,
dan kasus dengan mikroskop positif namun budaya negatif karenanya harus
diselidiki lebih lanjut (5). Pada suatu kesempatan identifikasi spesies yang
diperoleh dengan budaya konvensional dan PCR saling bertentangan (T. tonsuran
oleh kultur dan T. rubrum oleh PCR). Fakta bahwa PCR T. rubrum negatif bila
diterapkan pada strain referensi T. tonsurans dan juga untuk semua isolat
kontrol T. tonsuran yang diuji pada awalnya menimbulkan pertanyaan apakah ini
adalah kasus kesalahan identifikasi dengan identifikasi konvensional atau
double infeksi T. tonsuran dan T. rubrum. Karena infeksi kuku di Denmark
disebabkan oleh T. tonsuran sangat jarang terjadi, terutama di kalangan orang
Denmark (seperti dalam kasus ini), penjelasan sebelumnya lebih mungkin
terjadi dalam pendapat kami; bagaimana pun, isolat itu tidak disimpan dan
oleh karenanya tidak ada pemeriksaan lebih lanjut yang mungkin dilakukan.
Satu spesimen adalah dengan meth-odology konvensional yang didiagnosis
sebagai infeksi campuran dengan T. rubrum dan T. mentagrophytes, namun PCR
hanya menghasilkan produk PCR pan-dermato-phyte. Ini diurutkan dan diurutkan
cocok dengan T. mentagrophytes, sesuai dengan hasil cul-ture. Beberapa
penjelasan untuk kurangnya de-teksi isolat T. rubrum dalam kasus ini ada. (i)
Meskipun spesimen yang digunakan untuk pengujian konvensional dan PCR yang
berasal dari pasien yang sama, bahan tersebut bukan bahan yang sama persis
dan T. rubrum mungkin tidak ada dalam spesimen yang digunakan untuk PCR. (ii)
Ini mungkin merupakan kasus kontaminasi lempeng budaya oleh T. rubrum. (iii)
Sensitivitas PCR T. rubrum mungkin tidak cukup dalam kasus infeksi campuran.
Faktanya, bagaimanapun, primer primer T. rubrum menargetkan gen multicopy,
berbeda dengan primer pan-dermatophyte, dan PCR T. rubrum juga negatif saat
sampel dijalankan dalam pengaturan PCR tunggal menunjukkan bahwa Sensitivitas
PCR T. rubrum tidak boleh kalah dengan PCR pan-dermatofit. Namun, pemeriksaan
sam-ples tambahan dari kasus infeksi campuran yang terdokumentasi diperlukan
untuk mengevaluasi hal ini lebih lanjut.

Penafsiran deteksi jamur nondermatophyte pada spesimen kuku masih

kontroversial. Temuan tersebut mungkin mencerminkan adanya unsur cetakan pada
spesimen kuku karena kontaminasi, kolonisasi sementara atau infeksi kuku yang
trau-matalized atau yang berpenyakit, atau kontaminasi di laboratorium. Oleh
karena itu, setidaknya pemulihan spesies jamur identik biasanya diperlukan
sebelum peran patogen dipertimbangkan, dan bahkan dalam kasus ini pemulihan
mungkin merupakan infeksi yang sekunder akibat kondisi kuku patologis yang
mendasarinya. Temuan dalam penelitian ini bahwa dua kuku menghasilkan cetakan
oleh kultur tetapi T. rubrum oleh PCR dapat mencerminkan pertumbuhan berlebih
dengan jamur yang terkontaminasi atau kolorisasi yang berkembang pesat atau
infeksi ganda sejati.

Meskipun identifikasi dermatofit dan / atau T. rubrum pada spesimen kuku

telah dicoba menggunakan berbagai metode mo-lecular, hanya satu studi yang
baru diterbitkan yang melibatkan ekstraksi DNA secara langsung dari spesimen
kuku tanpa kultur sebelumnya (15). Metode ekstraksi yang dijelaskan,
bagaimanapun, adalah prosedur multistep yang melibatkan 14 langkah dan dengan
demikian padat karya dan dikaitkan dengan peningkatan risiko penanggulangan.
Penerapan prosedur dua tahap 15 menit untuk ekstraksi DNA secara langsung
dari spesimen kuku dan diagnosis berbasis PCR multipleks dari setiap
dermatofit dan / atau T. rubrum dengan peningkatan sensitivitas dibandingkan
dengan prosedur diagnostik konvensional memungkinkan integrasi pertama
kalinya. dari metode berbasis biologi molekuler ke dalam pemeriksaan rutin
dermatofitosis kuku juga untuk laboratorium diagnostik yang menerima spesimen
dalam skala yang lebih besar. Ini membawa harapan bahwa diagnosis
onikomycosis yang cepat, spesifik, dan murah dapat tersedia secara luas dalam
waktu dekat.

Hasil
Evaluasi PCR pan-dermatofit dan T. rubrum menggunakan DNA yang diambil dari
kultur jamur. Ekstrak DNA dari kultur dari 12 strain dermatofit referensi, 89
isolat matrik maternal, dan 21 jamur lainnya (Tabel 1) digunakan untuk
evaluasi primer pan-dermatofit dan primer spesifik T. rubrum secara terpisah
dan multipleks Format PCR Produk PCR 203-bp yang sesuai dengan T. rubrum
diamati untuk sampel DNA rubrum 13/13 T. rubrum dengan PCR spesifik T. rubrum
secara terpisah dan dalam format multipleks, dan produk PCR 366-bp spesifik
diperoleh untuk 101/101 dermatofit Sampel DNA dengan PCR pan-dermatofit saja
dan dalam format multipleks (contoh hasil PCR pan-dermatofit dan T. rubrum
spesifik ditunjukkan pada Gambar 1). Tidak ada produk PCR yang terdeteksi
oleh PCR pan-dermato-phyte, PCR spesifik T. rubrum, atau PCR multipleks untuk
21 isolat jamur nondermatophyte atau untuk tiga samples DNA manusia
(sensitivitas 100% dan spesifisitas 100% untuk ketiga sistem PCR).
Evaluasi klinis PCR pan-dermatofit dan T. rubrum menggunakan DNA yang
diekstraksi langsung dari sampel kuku. Oleh
diagnostik konvensional dari 118 sampel kuku, 25 menghasilkan pertumbuhan T.
rubrum, 1 dari T. rubrum dan T. mentagrophytes, 1 dari Trichophyton
tonsurans, 3 dari Alternaria sp., 1 dari Acremonium sp., 1 dari Aspergillus
sp., 1 dari Candida sp., 2 S. brevicaulis, dan 1 dari spesies ragi tidak
diidentifikasi lebih lanjut. Enam puluh empat sampel adalah mikroskop dan
kultur negatif dan 18 positif dengan mikroskopi langsung untuk hifa dan
konidia namun kultur negatif; Sampel yang terakhir dianggap sebagai jamur
positif (tapi tidak ada identifikasi genus atau spesies yang dapat
ditetapkan). Sampel yang merupakan kultur positif jamur nondermatofit
dianggap sebagai dermatofit negatif dengan metode konvensional-ologi
dibandingkan dengan hasil PCR. DNA dari 118 sampel klinis diekstraksi dengan
menggunakan proto-col dua langkah yang cepat. Untuk masing-masing sampel,
lagi tiga set PCR dilakukan (PCR spesifik T. rubrum, PCR pan-dermatofit dan
multipleks pan-dermatophyte plus T. rubrum PCR). Semua hasil PCR multipleks
sesuai dengan hasil PCR tunggal, yang menunjukkan tidak adanya hilangnya
sensitivitas pada pengaturan PCR multipleks.

Secara keseluruhan, 50/118 (42,4%) sampel adalah dermatofit positif dengan

PCR dan 45/118 (38,1%) positif dengan diagnostik tradisional, termasuk sampel
positif dengan mikroskopi namun negatif menurut kultur. Di antara 24 spesimen
yaitu mi-kroskopi dan kultur positif (T. rubrum), 21 (87,5%) dikonfirmasi
oleh PCR sebagai T. rubrum positif, 2 adalah PCR negatif (8,3%), dan 1
dilaporkan sebagai T. mentagrophytes dan T rubrum positif dengan pemeriksaan
konvensional adalah pan-dermatofit positif namun T. rubrum PCR negatif. Dari
64 spesimen negatif dengan mikroskop dan kultur konvensional, 49 (76,6%)
dikuatkan oleh PCR sebagai negatif namun 15 (23,4%) adalah PCR positif (T.
rubrum). Dari 18 spesimen mikroskopis positif tapi kultur negatif (adanya
hifa yang diamati), 10 adalah T. rubrum PCR positif (55,6%), 7 negatif oleh
PCR (38,9%), dan hasil untuk satu sampel tidak mungkin dilakukan. untuk
menafsirkan (5.6%) (produk PCR yang tidak spesifik disintesis). Dua spesimen
yang negatif dengan pemeriksaan mikroskopis pada kuku tetapi T. rubrum
positif dalam kultur negatif oleh PCR (contoh hasil PCR pan-dermatofit dan T.
rubrum yang spesifik ditunjukkan pada Gambar 2). Satu spesimen
didiagnosis dengan pemeriksaan konvensional seperti T. tonsurans adalah pan-
dermatofit dan T. rubrum PCR positif. Akhirnya, PCR menghasilkan sembilan
spesimen yang didiagnosis oleh negara exami konvensional karena spesies
nondermatophy disajikan pada Tabel 2.

Untuk mengetahui apakah kekurangan produk PCR dalam sampel PCR-negatif dapat
disebabkan oleh adanya zat penghambat PCR dalam sampel, semua spesimen
negatif PCR dibubuhkan dengan DNA T. rubrum dan kemudian diuji ulang dalam
multiplex pan- dermatofit-T. rubrum PCR Produk PCR diproduksi dalam semua
kasus (data tidak ditunjukkan). Semua produk PCR spesifik T. rubrum yang
diperoleh dari spesimen yang tidak terdiagnosis sebagai sampel T. rubrum-
positif oleh meth-odology tradisional diurutkan (MWG Biotech, Jerman), dan
urutan dari semuanya sesuai dengan strain referensi T. rubrum. NCPF 113.
Produk PCR pan-dermatofit berasal dari DNA spesimen yang didiagnosis secara
konvensional seperti T. rubrum dan T. mentagrophytes yang diurutkan, dan
urutannya sesuai dengan strain referensi T. mentagrophytes NCPF 224
Perbandingan hasil yang diperoleh dengan diagnosa dan PCR konvensional
ditunjukkan pada Tabel 3. Secara keseluruhan, jumlah sampel positif meningkat
sebesar 11% (45 [38,1%] versus 50 [42,2%] dari 118 spesimen positif oleh
konvensional. dan metodologi PCR, masing-masing). Selanjutnya, karena adanya
sejumlah sampel mikroskopis positif namun kultur negatif, persentase sampel
dengan identifikasi spesies hampir dua kali lipat dengan penggunaan PCR (49
dari 118 spesimen ditemukan sebagai T. rubrum positif dengan metode berbasis
PCR, sementara hanya 27 dari 118 spesimen yang bersifat dermatofit positif
akibat kultur).
Sampel kuku klinis. Seratus delapan belas sampel kuku yang diterima untuk
pemeriksaan rutin di Laboratorium Mikologi di SSI termasuk secara prospektif.
Satu-satunya kriteria inklusi adalah adanya sejumlah bahan yang cukup untuk
diselidiki dengan mikroskop dan kultur langsung serta analisis PCR

Persiapan DNA dari kultur dermatofit. Strain dan isolat klinis dikultur dalam
2 ml media cair Sabouraud dengan sikloheksimida dan kloramfenikol (SSI
Diagnostika, Denmark) dan diinkubasi dengan pengocokan sampai 8 hari pada
suhu 27 C. Setelah panen, pelet disuspensikan kembali dalam 500 l buffer
lisis (400 mM Tris-HCl [pH 8.0], 60 mM EDTA [pH 8.0], 150 mM NaCl, 1% sodium
dodecyl sulfate) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 10 menit. .
Selanjutnya, 150 l kalium asetat (pH 4,8) ditambahkan dan tabung di vortex
dan disentrifugasi (1 menit, 12.000 g). Supernatan dipindahkan ke tabung
baru, dan sejumlah sama alkohol isopropil ditambahkan. Pelet DNA dicuci
dengan etanol 70%. Pelet DNA kering dilarutkan dalam 50 l buffer TE (10 mM
Tris, 1 mM EDTA). Dua mikroliter DNA digunakan dalam 20 sampai 50 l campuran
PCR. Reagennya, kecuali dinyatakan lain, dibeli dari Sigma (Jerman).

1.

Persiapan DNA dari sampel kuku. Untuk preparasi DNA (1), DNA dari sampel kuku
diekstraksi dengan 10 menit inkubasi sampel kuku pada 100 l buffer ekstraksi
(60 mM sodium bicarbonate [NaHCO3], 250 mM potassium chloride [KCl] dan 50 mM
Tris, pH 9,5) pada 95 C dan penambahan buffer anti-inhibisi 100 l
berikutnya (2% bovine serum albumin). Setelah pencampuran vortex, larutan
yang mengandung DNA ini digunakan untuk PCR.
PCR Pan-dermatofit. PCR Pan-dermatofit (1) adalah sebagai berikut.
Berdasarkan perbandingan (VectorNTI; InforMax, Inc.) urutan nukleotida dari
dermatofit yang berbeda di database nukleotida NCBI, satu set primer yang
mendeteksi fragmen DNA yang mengkodekan kitin sintase 1, panDerm1 (5
GAAGAAGATTGT CGTTTTCATCGTCTC3) dan panDerm2 (5 CTCGAGGTCAAAAGCACGC CAGAG3) ,
dirancang. Dua belas strain referensi dermatofit, 89 isolat dermatofit
klinis, 22 isolat jamur nondermatophyte, dan DNA manusia yang dimurnikan
(Tabel 1) telah diuji. Campuran PCR terdiri dari 10 l PCR Ready Mix (Sigma,
Jerman), 0,2 l masing-masing primer (panDerm1 dan panDerm2) pada 100 M, dan 4
l DNA dalam volume 20 l. PCR dilakukan pada pemurni termal MWG-Biotech.
Profil temperatur waktu untuk PCR adalah 45 siklus pada 30 C pada suhu 94
C, 30 s pada suhu 60 C, dan 30 s pada suhu 72 C, didahului denaturasi
awal selama 10 menit pada suhu 95 C. Kehadiran produk PCR spesifik sekitar
366 bp diperiksa dengan menggunakan elektroforesis pada gel agarose 1% dan
pewarnaan dengan etidium bromida.

PCR richophyton rubrum. Berdasarkan penjajaran (VectorNTI; InforMax, Inc.)

urutan spacer 2 transkripsi internal 2 di database nukleotida NCBI, universal
(uni, 5 TCTTTGAACGCACATTGCGCC3) dan primer Trichophyton rubrum-specific
(Trubrum-rev, 5 CGGTCCTGAGGGCGCT GAA3) dirancang . Setiap reaksi dilakukan
dalam volume 20 l dengan penambahan 4 l DNA dari mikroorganisme yang
tercantum di atas, 0,2 l masing-masing primer (pada 100 M), dan 10 l PCR
ReadyMix (Sigma, Jerman). Amplifikasi dilakukan pada thermal cycler (MWG-
Biotech, Germany) dan terdiri dari satu siklus awal denaturasi selama 5 menit
pada 94 C dan 45 siklus 30 s pada suhu 94 C, 30 s pada 60 C, dan 30 s
ekstensi pada 72 C. Setelah siklus termal, amplikon dielektroforesis dalam
gel agarosa 2% dan diwarnai dengan