2.

3 Cara Kerja
2.3.1 Injeksi Antigen pada Mencit
Escherichia coli dikultur selama 24 jam dengan suhu 37C dimedia Luria Bertani (LB).
Kultur diambil 1 ml, dimasukkan pada microtube, lalu disentrifugasi 10000 rpm pada suhu 4C
selama 5 menit. Pelet ditambahkan 1 ml PBS. Kemudian disentrifugasi kembali 10000 rpm dengan
suhu 4C selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml PBS dan diambil 2 L + 98 L evans
blue. Sel limfosit dihitung menggunakan hemositometer. Lalu ditentukan dosis yang akan
diinjeksikan ke mencit dan E.coli diinjeksikan ke mencit secara intraperitoneal. Setelah seminggu
mencit dirawat, mencit diinjeksikan dengan booster berupa E.coli dengan dosis 106, 105, 104 dan
103.

2.3.2 Isolasi Sel Limfosit dan Flow Cytometry

Mencit didislokasi, dibedah dan diambil organ spleen dan thymus. Organ dicuci dengan PBS,
dipindahkan ke PBS steril dan dihancurkan dengan ujung spuit berlawanan arah jarum jam.
Suspensi dipindahkan ke propilen dan ditambahkan PBS hingga 6 ml pada spleen dan 10 ml pada
thymus. Kemudian disentrifugasi 2500 rpm suhu 10C selama 5 menit. Pelet diresuspensi dengan
PBS 1 ml. Suspensi sel diambil 50 L dab diletakkan pada mikrotube berisi 500 L PBS. Lalu
disentrifugasi kembali 2500 rpm, dengan suhu 10C selama 5 menit. Pelet ditambahkan 50 L
larutan antibodi ekstraseluller. Kemudian diinkubasi selama 20 menit dengan suhu 4C dalam
kondisi gelap, diresuspensi dengan 300 L PBS. Suspensi sel dimasukkan dalam kuvet dan
dilakukan analisis flow cytometry.